油樟葉多糖的提取及其體外抗自由基活性研究*

杜永華，敖光輝，魏琴，曾月，李玉杰

1(宜賓學院香料植物資源開發與利用四川省高校重點實驗室，四川宜賓，644000)

2(內江師范學院，四川內江，641112)3(宜賓學院生命科學與食品工程學院，四川宜賓，644000)

4(宜賓學院 食品科學與工程研究所，四川宜賓，644000)

植物多糖是植物體內廣泛存在的生物活性物質，除具有免疫調節、抗腫瘤、降血糖、抗病毒、降血脂等生物活性外，還具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、抗疲勞作用，日益成為食品科學、天然藥物、生物化學與生命科學研究領域的熱點。油樟［Cinnamomum longepaniculatum(Gamble)N.Chao］是我國特有的樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)植物樹種［1］，其葉富含揮發油，比同屬植物香樟［Cinnamomum.camphora(Linn.)Presl］葉含油量高1～2倍，是香料、食品、醫藥、日用和化工產品的重要原料來源［2］。研究表明，香樟葉除含有揮發油外，還含有多糖、黃酮、生物堿、多酚等生物活性成分［3-4］，其多糖成分含量豐富，冬季干葉片多糖含量達116.55 mg/g，具有一定抗氧化活性［3，5］。油樟葉在提取揮發油后的殘渣提取物具有抗微生物［6］、抗癌［7］、抗炎［8］和鎮痛［9］作用。然而，目前對油樟葉中多糖成分的提取及其抗氧化活性研究未見相關文獻報道。本實驗采用均勻設計法優選油樟葉多糖的提取工藝，并對其體外抗自由基活性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

油樟(C.longepaniculatum)葉，采摘于四川省宜賓市翠屏區邱場鄉油樟種植基地;葡萄糖標準品購自貴州迪大生物有限公司，含量≥98%;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼［1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-(2，4，6-trinitrophenyl)hydrazyl，DPPH］梯希愛(上海)化成工業發展有限公司;其他試劑均為國產分析純。

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 油樟葉預處理

采用水上蒸餾的方法，將油樟葉用水蒸氣蒸餾3 h除去揮發油，殘渣于60℃烘干，粉碎，取60～80目油樟葉粉末，加石油醚(沸程30～60℃)索氏抽提1 h脫脂，殘渣60℃烘干，即得脫油油樟葉粉，待用。

1.2.2 油樟葉多糖含量的測定

精密稱取D(+)葡萄糖標準品50.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，精密吸取14.0 mL至100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻即得0.07 mg/mL葡萄糖標準溶液。精密吸取 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL葡萄糖標準溶液分別至10 mL容量瓶中，用蒸餾水補至2.0 mL，加入1.0 mL 5%苯酚，搖勻后迅速加入5.0 mL濃H2SO4，充分混合均勻，室溫放置20 min，以2.0 mL蒸餾水代替葡萄糖標準溶液同法顯色作空白對照。在489 nm處測定吸光度A，以吸光度值A為縱坐標，葡萄糖質量濃度c(mg/L)為橫坐標，繪制標準曲線，求得線性回歸方程為A=0.731 6c-0.052 4，R2=0.999 3。

將油樟葉多糖提取液定容至250 mL，吸取2.5 mL稀釋定容至50 mL，取定容液2.0 mL于10 mL容量瓶中，按標準曲線繪制的顯色操作，測定吸光度值，根據標準曲線的回歸方程和稀釋倍數計算樣品溶液中的多糖含量，計算多糖提取量。

多糖提取率/%=［提取液中多糖含量(g)/脫油油樟葉干粉質量(g)］×100

1.2.3 油樟葉多糖的提取工藝流程

脫油油樟葉粉→加入水→浸泡→回流提取→過濾→濾液減壓濃縮→Sevage法去蛋白→體積分數80%乙醇沉淀→無水乙醇洗滌沉淀→真空冷凍干燥→粗多糖

1.2.4 單因素實驗

考察提取溫度(40、55、70、85、100 ℃)、液料比［(5、10、15、20、25)∶(mL∶g)］、浸泡時間(0、30、60、90、120 min)和提取時間(30、80、130、180、230 min)對油樟葉多糖提取率的影響。

1.2.5 均勻設計試驗優化多糖提取工藝

在單因素實驗基礎上，選取提取溫度、料液比、浸泡時間和提取時間4個因素，參考文獻［10］，選取(108)表安排試驗，對油樟葉總多糖的提取工藝進行優選，并根據優選條件進行驗證實驗。

1.2.6 油樟葉多糖體外抗自由基活性

(1)DPPH自由基清除活性參考馬金寶等［11］方法，取2.0 mL不同濃度多糖水溶液，在517 nm處測定其對DPPH自由基的清除活性，陽性對照組用同等濃度VC代替多糖溶液，每個樣品平行測定3次。DPPH自由基清除率(E，%)計算:

E/%=［1-(A2-A1)/A0］×100

式中:A0為2 mL DPPH乙醇溶液+2 mL溶劑的吸光度值;A1為2 mL待測溶液+2 mL溶劑的吸光度值;A2為2 mL DPPH乙醇溶液+2 mL待測溶液的吸光度值。

(2)超氧陰離子自由基清除活性采用鄰苯三酚自氧化法［12］，取1.0 mL不同濃度多糖水溶液，在320 nm處測定其對超氧陰離子自由基的清除活性，空白對照組用等體積Tris-Hcl溶液代替多糖溶液，陽性對照組用同等濃度VC代替多糖溶液，每個樣品平行測定3次。超氧陰離子自由基清除率(E，%)計算:

E/%=(A2-A1)/A2×100

式中:A2為空白對照的吸光度值;A1為待測溶液的吸光度值。

(3)羥基自由基清除活性采用 Fenton法［13］，取1.0 mL不同濃度多糖水溶液，在510 nm處測定其對羥基自由基的清除活性，以蒸餾水為空白對照，陽性對照組用同等濃度VC代替，每個樣品平行測定3次。羥基自由基清除率(E，%)計算:

E/%=［1-(A2-A1)/A0］×100

式中:A0為蒸餾水空白對照的吸光度值;A1為l.0 mL 9 mmol/L FeSO4+1.0 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液+1.0 mL待測溶液+1.0 mL蒸餾水的吸光度值;A2為1.0 mL 9 mmol/L FeSO4+l.0 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液+1.0 mL待測溶液+1.0 mL 8.8 mmol/L H2O2的吸光度值。

1.2.7 數據分析

采用DPS7.05統計軟件的二次多項式逐步回歸模型分析均勻設計實驗數據，采用數量型數據幾值分析模型計算各測試物對自由基的半數清除濃度(EC50)。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

單因素實驗結果見圖1。由圖1-a可知，在固定液料比15∶1(mL∶g)、浸泡時間 30 min、提取時間180 min條件下，隨著提取溫度的升高，油樟葉多糖分子擴散運動加劇，溶出量增加，油樟葉多糖提取率呈線性增加，100℃達最高為12.65%。表明在實驗范圍內溫度對多糖提取率影響顯著，多糖提取率隨溫度增加而增加，但溫度超過100℃，可能對多糖的穩定性和活性產生影響［14］，因此，多糖優選提取溫度控制在100℃為宜。

由圖1-b可知，在固定提取溫度95℃，浸泡時間30 min，提取時間180 min條件下，油樟葉多糖提取率隨著液料比的增加而增加，液料比超過15∶1時，大部分油樟葉多糖已溶出，溶劑與材料中多糖的濃度差變小，多糖提取率增幅減小。在液料比達20∶1時，多糖提取率最高達13.65%。超過此液料比后多糖提取率略有下降，可能是液料比過大時，雜質溶出增加，相當于多糖被稀釋，得率反而降低［15］。因此，優選液料比為20∶1(mL∶g)。

由圖1-c可知，在固定提取溫度95℃，液料比15∶1，提取時間180 min條件下，油樟葉多糖提取率先隨浸泡時間的延長而緩慢升高，浸泡60 min時多糖提取率最高達12.01%，此后多糖提取率緩慢下降。因此，浸泡時間以60 min為宜。但在實驗所設浸泡時間范圍內，由于油樟葉粉末粒度較小，溶劑分子能較快擴散到物料內部，迅速進入多糖動力學溶出過程，多糖提取率變化幅度較小。

圖1 提取溫度(a)、液料比(b)、浸泡時間(c)和提取時間(d)對多糖提取率的影響Fig.1 Influence of extraction temperature，liquid-solid ratio，immersion time and extraction time on the extraction rate of polysaccharides

由圖1-d可知，在固定提取溫度95℃，液料比15∶1，浸泡時間30 min條件下，多糖提取率隨提取時間的延長呈現先緩慢增加后下降趨勢，180 min時提取率最高達7.99%。表明時間過短，多糖溶出不充分;時間過長，引起多糖結構變化而使提取率下降。因此，優選提取溫度為180 min。在實驗所設提取時間范圍內，多糖提取率變化幅度不大。

2.2 均勻設計實驗結果

2.2.1 數學回歸模型的建立及顯著性檢驗

在單因素實驗基礎上采用均勻設計實驗優化油樟多糖提取工藝，實驗設計及結果見表1。

表1 均勻設計實驗安排與結果Table 1 Design matrix and results of uniformed design test

由表1可知，油樟多糖提取率最高實驗組合為提取溫度100℃，液料比23 mL/g，浸泡時間60 min，提取時間155 min，提取率為14.06%。采用DPS統計軟件對實驗數據進行二次多項式逐步回歸分析，得油樟葉多糖提工藝參數的回歸方程:

回歸方程相關系數R=0.998 0，F=71.331 1，P=0.013 9＜0.05，Durbin-Watson統計量d=1.743 6，接近2，多元回歸模型可用。在建立多元回歸模型的同時進行通徑分析，決定系數R2=0.996 0，剩余通徑系數ρe=0.063 1，通徑分析成立。表明上述回歸方程具有統計學意義，可以反映多元線性回歸模型，回歸分析有效。

由上述回歸方程可知，X3和X4未入選方程，表明在實驗所選因素水平范圍內，浸泡時間(X3)和提取時間(X4)對油樟葉多糖提取率無顯著影響，這與單因素實驗結果相似。

對上述模型進行顯著性分析，結果見表2。由表2可知，從偏相關系數大小來看，提取溫度(X1)對多糖提取率的影響大于液料比(X2)，前者的影響達到顯著水平(P≤0.05)。提取溫度與提取時間的交互影響達到顯著水平(P≤0.05)，液料比與浸泡時間、浸泡時間與提取時間之間存在交互作用，但對多糖提取率影響不顯著(P＞0.05)。

表2 各因素的顯著性檢驗Table 2 Significance of each variable term in the fitted regression equation for he extraction rate of polysaccharides

2.2.2 提取工藝的優化與驗證

通過DPS軟件求解上述回歸方程，得到油樟葉多糖提取工藝的優化條件為:提取溫度100℃，液料比16∶1(mL∶g)，浸泡時間 0 min，提取時間 215 min，多糖提取率模型預測值為15.73%。在此條件下進行3次驗證試驗，測得實際多糖提取率為14.36%，與預測值相近，且高于均勻設計實驗中多糖提取率最高的組合(提取率為14.06%)，表明均勻設計實驗獲得的多元回歸模型可用于油樟葉多糖提取工藝的優化。優化的油樟葉多糖提取工藝的驗證結果表明油樟葉中含有較豐富的多糖成分，其含量略高于香樟葉中總多糖含量(12.94%)［16］。

2.3 抗自由基活性

以優化工藝制備油樟葉多糖提取液，經濃縮、去蛋白、乙醇沉淀、洗滌和真空冷凍干燥得到黃褐色粉末狀油樟葉粗多糖，粗多糖得率為10.32%，多糖純度為318.40 mg/g。可見，多糖提取液經后續工藝處理后損失較大，需要進一步對后續工藝進行優化。

由圖2-a可知，油樟葉多糖對DPPH自由基清除能力隨質量濃度的增加而增強，在低濃度范圍內與VC的清除能力差異較明顯，質量濃度達0.2 mg/mL后，清除率逐漸接近VC。當多糖濃度達1.6 mg/mL時，其對DPPH自由基清除率達90.00%，表明油樟葉多糖在高濃度范圍內對DPPH自由基的清除能力較強。這一趨勢與紫椴花多糖清除DPPH自由基結果相似［15］。由表3可知，油樟葉多糖對DPPH自由基的清除能力與其質量濃度有較明顯的線性關系(R=0.941 7)，其 EC50為0.086 mg/mL，但仍不如VC的清除能力強(VC的EC50為0.002 mg/mL)。自由基清除劑通過轉移傳遞電子或氫原子給DPPH來中和其自由基［17］，因此，以上結果表明油樟多糖可能有較強的供氫能力。

圖2 油樟葉多糖的體外清除自由基活性Fig.2 Radical scavenging activities of polysaccharides from C.longepaniculatum in vitro

由圖2-b可知，在鄰苯三酚自氧化反應體系中，油樟葉多糖具有一定清除超氧陰離子自由基作用，其清除能力隨其質量濃度的增加而增強，但在所選質量濃度范圍內，其清除率低于60%，而VC在質量濃度為0.4 mg/mL時的清除率達69.80%。在低質量濃度范圍內，油樟多糖與VC對超氧陰離子的清除能力較為接近，質量濃度大于0.4 mg/mL后其抑制率明顯低于VC。可見，油樟多糖對超氧陰離子自由基清除能力與VC有較大差距，在低質量濃度內有相對較強清除能力［18］。油樟多糖對超氧陰離子自由基的EC50為1.075 mg/mL，大于VC的6倍(表3)。

由圖1-c和表3可知，油樟多糖對羥基自由基的清除能力隨著質量濃度的增加而呈線性增強(R=0.986 9)，當質量濃度為3.2 mg/mL時，對羥自由基清除率達80.20%，但明顯低于同濃度VC的清除率(95.30%)。幾率值分析計算出油樟多糖和VC對羥自由基EC50分別為0.905、0.140 mg/mL。可見，油樟多糖對羥自由基具有一定清除作用，但其清除能力弱于VC。

表3 油樟葉多糖對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的半數清除濃度Table 3 The half scavenging concentration of polysaccharides from C.longepaniculatum on DPPH·，O2-· and·OH

3 結論

采用熱水浸提法，在單因素實驗基礎上，以提取溫度、液料比、浸泡時間、提取時間為自變量，多糖提取率為考察指標，經均勻設計實驗優化油樟葉多糖的提取工藝條件為提取溫度100℃、液料比16∶1(mL∶g)、浸泡時間0 min、提取時間215 min，多糖提取率為14.36%，與模型預測值接近，回歸模型能較準確地擬合油樟葉多糖的提取工藝。

采用化學比色法，以VC為陽性對照，測定油樟葉多糖對不同自由基的體外清除能力，表明在不同抗自由基體系中油樟葉多糖表現出不同的清除能力，在一定質量濃度范圍內呈現明顯的量效關系，對DPPH、超氧陰離子和羥基自由基的 EC50分別為0.086、1.075、0.905 mg/mL，其清除能力均低于VC。可見，油樟葉多糖具有一定抗自由基活性，對油樟多糖的進一步研究與開發具有重要意義。

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