濃香型白酒酵母對(duì)發(fā)酵糟醅中乙醇及主要酸、酯生成的影響*

王濤，胡先強(qiáng)，游玲，王松，余雨柚，簡(jiǎn)曉平

1(宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川宜賓，644000)2(固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓，644000)

3(四川蜀南遠(yuǎn)航生物科技有限公司，四川宜賓，644300)4(四川省宜賓高洲酒業(yè)有限責(zé)任公司，四川 宜賓，645150)

濃香型白酒釀造是典型的固態(tài)、混菌發(fā)酵過(guò)程，來(lái)自于釀造環(huán)境、工具、窖泥和曲藥中的酵母、細(xì)菌、古細(xì)菌和絲狀真菌均參與其中，微生物代謝產(chǎn)物、原料及其酶解產(chǎn)物、以及這些物質(zhì)相互反應(yīng)所形成的產(chǎn)物決定了濃香型白酒的風(fēng)格和品質(zhì)，在這些物質(zhì)中，乙醇和“四大酸、四大酯”(己酸、乙酸、丁酸、乳酸及其對(duì)應(yīng)的乙酯)起著主要的作用，其中己酯則被認(rèn)為是濃香型白酒的主體呈香呈味物質(zhì)［1-2］。酵母在濃香型白酒釀造中起著重要的作用，相關(guān)研究主要集中在多樣性［3-4］、高產(chǎn)乙醇菌株的選育等方面［5］，對(duì)其在濃香型白酒釀造過(guò)程中扮演的角色的認(rèn)識(shí)尚停留在利用可發(fā)酵性糖生成乙醇階段，而關(guān)于酵母在濃香型白酒發(fā)酵體系中對(duì)酸、酯的影響卻鮮有報(bào)道。

本研究將分離自濃香型白酒釀造諸環(huán)節(jié)并經(jīng)過(guò)酸度、乙醇耐受性篩選的20株酵母菌分別接種于裝有入窖糧糟與黃水的玻璃發(fā)酵壇中，遮光發(fā)酵50 d后，檢測(cè)發(fā)酵糟醅酸度、蒸餾酒體乙醇含量以及對(duì)酒體風(fēng)味影響較大的3種有機(jī)酸(乙酸、己酸、丁酸)、4種酯和總酯的含量，并與空白對(duì)照(沒(méi)有接種酵母的窖外發(fā)酵體系)及窖內(nèi)對(duì)照進(jìn)行了比較分析，希望在獲得一些有應(yīng)用前景的酵母菌株的同時(shí)，在一定層面探究濃香型白酒釀酒酵母對(duì)發(fā)酵糟醅中主要酸、酯、醇的影響，為研究濃香型白酒發(fā)酵機(jī)理提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

分離自四川宜賓多家濃香型白酒糟醅(9株)、窖房空氣(7株)、曲房空氣(3株)、窖泥(1株)，分屬于Debaryomyces(6 株)、Wickerhamomyces(6株)、Pichia(3株)、Lodderomyces(2 株)、Zygosaccharomyces(2株)及Trichosporonoides(1株)等6個(gè)屬一級(jí)分類地位的20株酵母。

1.1.2 糟醅及培養(yǎng)基

酵母活化培養(yǎng)基為YPD液體培養(yǎng)基;入窖糧糟(已添加20%的曲粉)取自四川宜賓某白酒企業(yè);黃水為窖內(nèi)對(duì)照窖池上一輪發(fā)酵黃水。

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始日期為2014年4月6日，以該批糟醅入窖發(fā)酵的窖池為窖內(nèi)對(duì)照。

1.1.3 主要儀器與試劑

氣相色譜儀(Agilent 7890A)，安捷倫科技有限公司;色譜柱，(LZP-930:300 mm × 0.25 μm × 0.32 μm)鄭州譜析。所用試劑、藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備

斜面菌種活化、擴(kuò)培后以無(wú)菌水調(diào)整濃度為108個(gè)/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 接種、發(fā)酵

在釀造車間，入窖糧糟加體積分?jǐn)?shù)為1%的黃水混勻后，分裝入1 L的無(wú)菌玻璃壇(每壇0.83 kg)，每壇接種50 mL菌懸液，充分混勻后封口(封口材料自內(nèi)到外依次為窖皮泥、壇蓋、保鮮膜、牛皮紙)。以50 mL無(wú)菌水取代菌懸液接種的玻璃壇為空白對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，室溫條件下遮光培養(yǎng)50 d。并以同批糟醅入窖發(fā)酵體系為窖內(nèi)對(duì)照(當(dāng)天封窖)。

1.2.3 發(fā)酵糟醅酸、醇、酯檢測(cè)

發(fā)酵結(jié)束后，窖外發(fā)酵體系剝?nèi)シ饪诘慕哑つ嗟炔牧虾螅瑹o(wú)菌條件下混勻糟醅后取樣200 g檢測(cè)。窖內(nèi)發(fā)酵體系在發(fā)酵50 d時(shí)用自制采樣器多點(diǎn)取樣1 000 g混勻后檢測(cè)(近似部位取樣3次)。

發(fā)酵糟醅酸度檢測(cè)采用NaOH溶液酸堿中和滴定法測(cè)定;糟醅蒸餾液乙醇含量檢測(cè)采用酒精計(jì)法測(cè)定，總酯含量采用皂化反滴定法［6］測(cè)定。

氣相色譜分析:取發(fā)酵糟醅各200 g，加等體積蒸餾水蒸餾，取餾分100 mL用0.22 μm細(xì)菌濾膜過(guò)濾后GC檢測(cè)，并以乙酸丁酯(色譜純、0.348 5 g/L)作為內(nèi)標(biāo)物。色譜條件:載氣為高純氦氣，柱溫50℃(保持3 min)，以5℃/min的速率升溫至150℃(保持5 min);以5℃/min的速率升溫至190℃(保持5 min)，以3℃/min的速率升溫至220℃(保持10 min);進(jìn)樣口溫度220 ℃，進(jìn)樣量0.2 μL，分流比20∶1。

空白對(duì)照、每個(gè)菌株的3個(gè)重復(fù)，窖內(nèi)對(duì)照的3次取樣均單獨(dú)檢測(cè)，取平均值。同時(shí)利用SPSS 18.0(Pearson相關(guān)系數(shù)、雙側(cè)檢驗(yàn)并標(biāo)記顯著性相關(guān))對(duì)糟醅中酸與酯含量的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵情況

玻璃壇發(fā)酵體系在發(fā)酵過(guò)程中壇底水分緩慢增加，結(jié)束時(shí)壇底液體高度1 cm左右糟醅顏色均一為泥黃色，無(wú)霉菌污染，具有濃香型白酒典型香味。對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行觀察，并且對(duì)出窖內(nèi)原酒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，窖內(nèi)酒醅發(fā)酵正常。

2.2 各發(fā)酵體系主要理化指標(biāo)

對(duì)發(fā)酵體系中糟醅及其餾分的檢測(cè)結(jié)果如表1、表2(以“平均值±SD值”形式給出)所示。

表1 20株酵母對(duì)發(fā)酵體系中4種酯含量的影響Table 1 Content of 4 esters in fermented grain when enhanced by 20 yeast strains

表2 20株酵母對(duì)發(fā)酵體系中乙醇、酸度及3種酸含量的影響Table 2 Content of ethanol，titrable acids and 3 acids in fermented grain when enhanced by 20 yeast strains

2.2.1 酯類物質(zhì)

本研究中窖內(nèi)發(fā)酵糟醅中酯類物質(zhì)含量與實(shí)際生產(chǎn)和文獻(xiàn)報(bào)道［7］基本一致，其中總酯、己酯、乙酯和丁酯含量均高于空白對(duì)照，且己酯、丁酯含量遠(yuǎn)高于空白對(duì)照，分別為空白對(duì)照的13.57倍和5.00倍，初步顯示了窖池發(fā)酵對(duì)糟醅己酯、丁酯有重要的影響;而窖內(nèi)對(duì)照糟醅乳酯含量(2.50 g/L)低于空白對(duì)照(3.71 g/L)，這顯示窖池發(fā)酵在一定程度上可降低糟醅乳酯含量。

供試的20株菌中，有10株菌對(duì)應(yīng)的發(fā)酵糟醅總酯含量高于窖內(nèi)對(duì)照，最高達(dá)到了11.52 g/L(Z9Y-91，Lodderomyces，來(lái)自曲房空氣)，而且這 10 株菌分別來(lái)自于窖房空氣(5株)、糟醅(3株)以及曲房空氣(2株)，分屬于 Debaryomyces(3株)、Wickerhamomyces(3株)、Lodderomyces(2株)以及 Pichia和 Trichosporonoides(各1株)，這顯示供試菌株中能促進(jìn)糟醅提升總酯含量的酵母在分離來(lái)源與屬一級(jí)分類地位上具有多樣性。

所有接種供試菌株的發(fā)酵糟醅己酯、丁酯含量均遠(yuǎn)低于窖內(nèi)對(duì)照，這進(jìn)一步顯示了窖池發(fā)酵對(duì)己酯、丁酯積累的重要作用。有13株酵母對(duì)應(yīng)的發(fā)酵糟醅己酯含量高于空白對(duì)照，15株酵母對(duì)應(yīng)的發(fā)酵糟醅丁酯含量高于空白對(duì)照;這顯示了供試酵母中部分菌株(如 Z8Y-15(Pichia、窖房空氣)、H6Y-19(Wickerhamomyces、糟醅))可在一定程度上分別促進(jìn)糟醅提升己酯、丁酯含量。

所有接種供試菌株的發(fā)酵糟醅乙酯含量均低于窖內(nèi)對(duì)照，供試的20株菌中有一半乙酯含量高于空白對(duì)照，最高為0.83 g/L(是空白對(duì)照的2.36倍)，對(duì)應(yīng)接種菌株 Z8Y-91(Debaryomyces、來(lái)自窖房空氣)，該菌株具有應(yīng)用于濃香型白酒釀造促進(jìn)發(fā)酵糟醅提升乙酯含量的潛力。

所有接種供試菌株的發(fā)酵糟醅乳酯含量均高于窖內(nèi)對(duì)照，但供試的20株菌中有6株菌低于空白對(duì)照，這顯示供試菌株中小部分酵母對(duì)促進(jìn)糟醅降低乳酯含量有一定作用。其中以接種菌株Z8Y-15乳酯含量最低(為2.53 g/L)，該菌株具有應(yīng)用于濃香型白酒釀造促進(jìn)發(fā)酵糟醅降低乳酯含量的潛力。

2.2.2 乙醇含量

研究結(jié)果顯示，窖內(nèi)對(duì)照乙醇含量為7.20 mL/100 g，低于所有窖外發(fā)酵體系，這顯示窖池發(fā)酵對(duì)糟醅乙醇產(chǎn)量的貢獻(xiàn)可能較少。供試的20株菌中有16株(占80%)對(duì)應(yīng)糟醅中乙醇濃度高于空白對(duì)照，分別來(lái)自窖房空氣(7株)、糟醅(6株)、曲房空氣(2株)以及窖泥(1株)，分屬于Debaryomyces(6株)、Wickerhamomyces(4株)、Lodderomyces和 Pichia(各 2株)以及Trichosporonoides和 Zygosaccharomyces(各1株)。這顯示大部分供試菌株能在一定程度上提升糟醅乙醇含量，同時(shí)它們?cè)诜蛛x來(lái)源與屬一級(jí)分類地位上具有多樣性。其中最高為接種菌株Z8Y-15的發(fā)酵糟醅(乙醇含量9.70 mL/100 g)。

2.2.3 酸類物質(zhì)

總體上，酵母菌株對(duì)糟醅酸度的影響較小，除S432Y-42(Pichia、來(lái)自糟醅、酸度4.67 mL/10 g)外，均在生產(chǎn)允許范圍內(nèi)［8］。窖內(nèi)對(duì)照酸度(4.15 mL/10 g)略高于空白對(duì)照(4.08 mL/10 g)，但窖內(nèi)對(duì)照己酸、乙酸、丁酸含量分別為 0.35、0.55、0.21 g/L，均低于空白對(duì)照，這可能是由于窖池內(nèi)窖泥的參與使發(fā)酵過(guò)程的生理生化反應(yīng)更為復(fù)雜，使得酸類物質(zhì)更多地向酯類等物質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致窖內(nèi)對(duì)照總酯、己酯、乙酯、丁酯含量高于空白對(duì)照。

研究數(shù)據(jù)顯示，接種菌株Z9Y-91的發(fā)酵糟醅己酸含量高，其丁酸含量也高，接種Z8Y-15的發(fā)酵糟醅己酸含量低，其丁酸含量也低，似乎顯示，糟醅中己酸與丁酸含量可能有一定的聯(lián)系。對(duì)供試的20株酵母發(fā)酵糟醅己酸、丁酸含量數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)二者Pearson相關(guān)性系數(shù)高達(dá)0.906，顯示它們之間存在顯著的線性相關(guān)性，這可能由于它們的生成方式具有一定的相似性，均是由棲息于窖泥中的厭氧或兼性厭氧微生物產(chǎn)生的，可通過(guò)進(jìn)一步研究予以驗(yàn)證。

供試的20株酵母中有12株發(fā)酵糟醅乙酸含量低于空白對(duì)照，其中有7株來(lái)自糟醅、4株來(lái)自窖房空氣、1株來(lái)自曲房空氣，這顯示窖房環(huán)境(糟醅、窖房空氣)中的部分(11株，占來(lái)自窖房環(huán)境酵母的68.75%)酵母菌對(duì)促進(jìn)糟醅降低乙酸含量有一定的作用。

2.3 發(fā)酵體系中酸類物質(zhì)與酯類物質(zhì)含量的關(guān)系

濃香型白酒發(fā)酵糟醅中乙酯類物質(zhì)生成的主要途徑之一是酸與乙醇的反應(yīng)，由于在糟醅中乙醇含量較大，一般不成為這一酯化反應(yīng)的限制因素，故本文僅對(duì)酸與酯含量之間的關(guān)系做分析。表3為供試的20株酵母對(duì)應(yīng)的發(fā)酵糟醅己酸、乙酸、丁酸與其對(duì)應(yīng)乙酯含量的相關(guān)性系數(shù)。

表3 發(fā)酵糟醅中酸與其對(duì)應(yīng)乙酯含量的相關(guān)性Table 3 Correlation between acids and their corresponding ester in fermented grain

從表3可以看出，20株供試菌株己酸與己酯含量Pearson相關(guān)性系數(shù)為-0.038，絕對(duì)值介于0～0.3之間，顯示它們之間無(wú)線性相關(guān)性;而乙酸與乙酯、丁酸與丁酯含量 Pearson相關(guān)性系數(shù)分別為0.688、0.617，絕對(duì)值均大于0.5，顯示它們均有顯著的線性正相關(guān)性。

窖內(nèi)對(duì)照己酯含量為空白對(duì)照的13.57倍，而己酸含量卻為空白對(duì)照的50.72%，這可能是由于濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程中己酯的生成途徑不僅僅是乙醇與己酸酯化的結(jié)果，還存在對(duì)窖內(nèi)己酯生成的有重要影響的生化反應(yīng)途徑，莊世文［9］、周恒剛［10］、沈怡方［11］等人研究就發(fā)現(xiàn)了窖內(nèi)己酯生成的多種途徑。同時(shí)，窖內(nèi)環(huán)境可能更適宜多種厭氧微生物生長(zhǎng)，其中可能包括一些產(chǎn)酯化酶較好的菌株，導(dǎo)致窖內(nèi)發(fā)酵糟醅中的酯化酶含量與活性大于窖外(有待驗(yàn)證)，使己酸、乙醇的酯化反應(yīng)進(jìn)行更充分。

沈怡方研究指出白酒中乙酯的形成有3條途徑:一是酵母菌在酒精發(fā)酵時(shí)的副產(chǎn)物;二是酒醅中多量乙酸經(jīng)微生物酯化而成;三是其他微生物發(fā)酵的代謝物［11］。在我們的研究發(fā)現(xiàn)糟醅乙酸、乙酯含量之間具有顯著的線性相關(guān)性，這顯示，盡管糟醅乙酯生成存在多種途徑，但乙酸與乙醇酯化可能是其最主要的途徑，即糟醅中乙酸含量可能是乙酯生成的主要限制因素。糟醅中丁酸與丁酯含量也有相似關(guān)系。

上述現(xiàn)象顯示，濃香型白酒發(fā)酵體系中的酯類物質(zhì)的生成存在多種途徑，在不同乙酯類物質(zhì)的生成過(guò)程中，酸、醇酯化途徑所占比重不同。

3 討論

供試的20株菌檢測(cè)結(jié)果顯示，糟醅中乙酸與乙酯、丁酸與丁酯含量間存在線性相關(guān)性，而己酸與己酯之間則無(wú)線性相關(guān)性，這似乎顯示含碳量低(分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單)的酸(乙酸、丁酸)對(duì)應(yīng)的乙酯可能主要由酸醇直接酯化而來(lái)，而含碳量高(分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜)的酸(己酸)對(duì)應(yīng)的乙酯的生成將更加復(fù)雜。

供試的20株菌株中大部分(16株，占80%)能促進(jìn)糟醅增加乙醇含量，顯示著濃香型白酒釀造環(huán)境中酵母類群對(duì)發(fā)酵有積極影響，其中菌株Z8Y-15不僅能有效促進(jìn)糟醅中乙醇、己酯的生成，還可降低乳酯含量，在濃香型白酒釀造中具有較好應(yīng)用前景;菌株Z8Y-91能有效促進(jìn)糟醅增加乙酯含量，在清香型白酒釀造中具有較好應(yīng)用前景。

窖內(nèi)對(duì)照與窖外發(fā)酵體系(含空白對(duì)照)中己酯、丁酯生成量差異較大，表明窖池(窖泥)發(fā)酵方式對(duì)糟醅己酯、丁酯含量有重要的影響，這可能是由于窖泥的微生態(tài)系統(tǒng)以及發(fā)酵過(guò)程中“前緩、中挺、后緩落”的溫度變化有關(guān)［12-14］。

本文以分離自濃香型白酒釀造環(huán)境中的酵母菌接種于添加了黃水的入窖糧糟中遮光發(fā)酵，并使用窖皮泥封窖，盡可能模擬實(shí)際生產(chǎn)，同時(shí)對(duì)每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)，以減小實(shí)驗(yàn)誤差，在一定程度上揭示了濃香型白酒酵母對(duì)糟醅中乙醇及主要酸、酯的影響，初步分析了發(fā)酵糟醅中部分酸與其對(duì)應(yīng)乙酯含量的相關(guān)性。

［1］ 徐成勇，郭波，周蓮，等.白酒香味成分研究進(jìn)展［J］.釀酒科技，2002(3):38-40.

［2］ 沈怡方.白酒的香型、風(fēng)格與流派［J］.釀酒，2003，30(1):1-2.

［3］ 張文學(xué)，喬宗偉，胡承，等.濃香型白酒糟醅中真菌菌群的多樣性分析［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào):工程科學(xué)版，2006，38(5):97-101.

［4］ 趙東，喬宗偉，彭志云.濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中酒醅微生物區(qū)系及其生態(tài)因子演變研究［J］.釀酒科技，2007(7):37-39.

［5］ 高玉妹，陶能國(guó)，劉躍進(jìn)，等.白酒酒曲中9株酵母菌的分離與特性研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(5):195-199.

［6］ 沈怡方.白酒生產(chǎn)技術(shù)全書(shū)［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2013:651-660.

［7］ 吳三多.五大香型白酒的相互關(guān)系與微量成分淺析［J］.釀酒科技，2001(4):82-85.

［8］ 賴登燡，薛常有，潘華文.入窖七因素的變化規(guī)律及相互關(guān)系的研究(四):入窖酸度［J］.釀酒科技，2011(4):43-45.

［9］ 莊世文，付俊淑，黃金海.酵母菌合成酯類化合物關(guān)鍵酶基因的研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(2):433-436.

［10］ 周恒剛.80年代前己酸菌及窖泥培養(yǎng)的回顧［J］.釀酒科技，1997(4):17-22.

［11］ 沈怡方.白酒中四大乙酯在釀造發(fā)酵中形成的探討［J］.釀酒科技，2003(5):28-31.

［12］ 吳衍庸，薛堂榮，陳昭蓉，等.五糧液老窖厭氧菌群的分布及其作用的研究［J］.微生物學(xué)報(bào)，1991，31(4):299-307.

［13］ 胡承，應(yīng)鴻，許德富，等.窖泥微生物群落的研究及其應(yīng)用［J］.釀酒科技，2005(3):34-38.

［14］ 周慶伍.白酒固態(tài)發(fā)酵溫度變化與產(chǎn)、質(zhì)量關(guān)系的研究［J］.釀酒，2008，35(3):62-64.