大孔樹脂處理對鱈魚蛋白酶解液中腥味物質的影響*

常鈺菲，侯虎，李八方

(中國海洋大學食品科學與工程學院，青島 山東，266003)

鱈魚，鱈屬魚類，是世界年捕撈量最大的深海魚。鱈魚中蛋白含量約16.5%，高于三文魚、鯧魚等魚類，具有很高的營養價值［1］。研究表明，水產蛋白酶解產物中廣泛存在著具有降血壓［2］、抗氧化［3-4］等特殊生理功能的多肽，還可用于牛磺酸、殼聚糖［5］等的制備，來源于海洋生物的活性肽，在功能食品的開發中極具潛力。

但是，水產品普遍具有令人生厭的不良風味，尤以腥味為主;此外，在制備酶解液時，由于酶解過程較難控制，酶解產物通常具有苦腥味，嚴重制約水產蛋白酶解液在食品方面的應用［6］。因此，脫腥成為水產品加工及應用領域亟待解決的問題。

水產品脫腥方法主要分為物理脫腥、化學脫腥及生物脫腥三類，常見方法有活性炭吸附法、酸堿處理法及酵母發酵等［7］。活性炭吸附法在脫腥脫色方面有一定效果，但使蛋白質損失較大;酸堿處理法會引入一定的試劑殘留;酵母等微生物發酵法，僅適于液態樣品［8］，且酵母粉的加入會引入異味。近年來，大孔樹脂因具有吸附性和篩選性，能有效吸附各類有機物質，在不良風味脫除方面的應用逐漸興起［9-11］。

本實驗以大孔樹脂吸附脫腥為研究對象，通過單因素實驗，以大孔樹脂型號為變量進行樹脂初篩，選出對鱈魚蛋白酶解產物脫腥的最佳樹脂類型;以溫度、樹脂添加量及pH為變量進行單因素實驗，在此基礎上進行響應面優化，得出該型大孔樹脂的最佳脫腥工藝，并通過驗證實驗及SPME-GC-MS分析確證該工藝可行、有效，為鱈魚蛋白酶解液在腥味脫除、功能性食品開發等水產品加工應用領域提供實驗依據及理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鱈魚購自青島南山水產品市場。宰殺后的新鮮鱈魚，去除魚皮、內臟及鰓部，取背部魚肉，制成肉糜，于-20℃冷凍保存。

枯草桿菌堿性蛋白酶(食品級)，由南寧龐博試劑有限公司提供;牛血清蛋白標準品，由賽默飛科技有限公司提供;其他試劑均為國產分析純。

001×7型大孔樹脂，山東魯抗立科藥物化學有限公司;D151、D201、D311型大孔樹脂，安徽三星樹脂科技有限公司;DA201-C型大孔樹脂，江蘇蘇青水處理工程集團有限公司;D4006、AB-8型大孔樹脂，南開大學化工廠。

1.2 儀器與設備

AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司;DS-1高速組織搗碎機，上海標本模型廠;PHS-3C雷磁pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司;SHA-B恒溫振蕩器，國華電器有限公司;722s可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司;65 μm PDMS/DVB萃取纖維及HP-INNOWax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)氣相色譜柱，美國Supelco公司;GC-MS氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 鱈魚蛋白酶解液的制備

將鱈魚肉糜解凍，以20%為底物濃度加入至pH 10的緩沖液中，并加入0.15%枯草桿菌堿性蛋白酶，于55℃下攪拌酶解4 h，沸水浴中滅酶10 min，冷卻，于5 000 r/min離心20 min，取上清液待用。

1.3.2 大孔樹脂預處理［12］

將大孔樹脂用蒸餾水洗至出水無味，無細碎樹脂及雜質。以0.5 BV無水乙醇浸泡24 h，蒸餾水反復洗凈至無氣味。以2 BV 4%HCl浸泡4 h，排去酸液，蒸餾水洗至中性;以2 BV 4%NaOH浸泡4 h，排去堿液，蒸餾水洗至中性。濕基保存，使用時抽濾脫水。

1.3.3 大孔樹脂靜態吸附單因素實驗

以經脫腥處理后的鱈魚蛋白酶解液的腥味分值及多肽損失率為指標，分別考察樹脂型號、溫度、樹脂添加量、pH對大孔樹脂脫腥效果的影響。

1.3.4 中心組合(Box-Behnken)試驗設計及響應面分析

應用Design-Expert 7.0軟件，依據Box-Behnken設計原理，以酶解產物脫腥后的腥味分值和多肽損失率為響應值，選取脫腥溫度(X1)、樹脂添加量(X2)、pH(X3)3個自變量，分別在3個水平上進行響應面試驗，建立自變量與響應值之間的回歸關系，求得最優值并進行驗證，從而對大孔樹脂的脫腥工藝進行優化。共計17組試驗，因素水平編碼見表1。

表1 響應曲面試驗設計因素水平表Table 1 Factors and coded levels in response surface model

1.3.5 脫腥效果評價

以大孔樹脂脫腥后的鱈魚蛋白酶解液的腥味分值和多肽損失率為評價指標。

腥味分值由感官評定得來。感官評定小組由10名(5男5女)感官評定員組成，分別對大孔樹脂處理后的樣品進行感官評定。評定室溫為25℃左右，評定過程中不得相互交流，樣品的評定之間有一定的時間間隔。以酶解原液作為參照(分值為6)，根據表2所列評分標準進行打分，取平均值表示該樣品的腥味程度。

表2 感官評分標準表Table 2 Sensory evaluation standard

多肽含量的測定:參照水解液中多肽含量的測定方法［13］，分別測定鱈魚蛋白酶解原液和經AB-8大孔樹脂處理后的鱈魚蛋白酶解液中的多肽含量，多肽損失率計算:

式中，W0—鱈魚蛋白酶解產物中多肽含量;W1—大孔樹脂處理后的鱈魚蛋白酶解產物中的多肽含量。

1.3.6 SPME-GC-MS分離鑒定

將鱈魚蛋白酶解液及大孔樹脂最佳工藝處理后的酶解液分別通過固相微萃取法(SPME)進行腥味物質萃取，并通過GC-MS進行分離及鑒定。

SPME:萃取纖維采用65 μm PDMS/DVB。

GC:色譜柱采用為 HP-INNOWax(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)，進樣口溫度250℃;初始柱溫40℃，保持3 min，以8℃ /min的速度升溫至250℃，保持10 min;載氣為氦氣(He)，流量為 0.8 mL/min。不分流進樣。

MS:電子轟擊(EI)離子源，離子源溫度250℃，電子能量70 eV，檢測器電壓為350 V，質量掃描范圍m/z 35～500。

通過計算各物質的Kovats指數，進一步為物質定性，并通過檢索Flavor數據庫(http://www.flavornet.org)、LRI＆ Odour數據庫(www.odour.org.uk)及文獻值［14］等，對物質進行風味描述。

2 結果與討論

2.1 大孔樹脂脫腥單因素實驗

2.1.1 不同型號大孔樹脂脫腥效果比較

以大孔樹脂型號為變量進行單因素實驗，脫腥效果如圖1-a所示。由圖可知，就腥味分值而言，大孔吸附樹脂(DA201-C、D4006、AB-8)對腥味物質的吸附能力高于離子交換樹脂(001×7、D151、D201、D311);就多肽吸附能力而言，陽離子交換樹脂(001×7、D151)的吸附能力高于陰離子交換樹脂(D201、D311)，大孔吸附樹脂中，DA201-C吸附較多的多肽，多肽損失率最高，而在D4006型和AB-8型2種吸附樹脂作用下，多肽損失率較低。因此，從腥味分值和多肽損失率兩個角度綜合考慮，AB-8型大孔吸附樹脂可吸附較多的腥味物質但又不至于損失大量多肽，脫腥效果較好。因此，本實驗選取AB-8型大孔吸附樹脂作為最佳樹脂類型，用于后續的單因素實驗及響應面試驗。

2.1.2 溫度對大孔樹脂脫腥效果的影響

由圖1-b可知，在15～55℃范圍內，隨著溫度的升高，經AB-8型大孔樹脂吸附處理后的酶解液的多肽損失率呈上升趨勢，而腥味分值呈降低趨勢，且兩者的變化幅度均隨溫度升高而逐漸減弱。這表明，在一定范圍內，升高溫度，可促使AB-8型大孔樹脂更多地吸附多肽，致使多肽損失率上升;相應地，升高溫度也可促進AB-8型大孔樹脂對不良風味物質的吸附，此外，溫度的升高有利于腥味物質的揮發，2種作用可共同導致腥味分值的降低。從腥味分值和多肽損失率兩個角度綜合考慮，當溫度介于25～45℃之間時，脫腥效果較好。因此，本實驗選取25、35及45℃，作為后續響應面試驗中溫度的3個水平。

2.1.3 樹脂添加量對大孔樹脂脫腥效果的影響

由圖1-c可知，在2.0%～20.0%范圍內，當樹脂添加量增加時，酶解液的多肽損失率呈上升趨勢，腥味分值大幅下降，而當樹脂添加量由10.0%增至20.0%時，腥味分值增幅很小，分值介于1.5～2.0之間，即表現為“腥味較弱”。這表明，在一定范圍內，增加樹脂量可加大AB-8型大孔樹脂對鱈魚蛋白酶解液中多肽的吸附，致使多肽損失率升高;相應地，樹脂量的增加也可促進對腥味物質的吸附，但當樹脂添加到一定量時，繼續加大樹脂量，對腥味物質的吸附因趨于飽和而無明顯變化。從腥味分值和多肽損失率兩個角度綜合考慮，當樹脂添加量介于5% ～15%之間時，脫腥效果較好。因此，本實驗選取5%、10%及15%，作為后續響應面試驗中樹脂添加量的3個水平。

2.1.4 pH對大孔樹脂脫腥效果的影響

由圖1-d可知，當pH值由4升至9時，酶解液的多肽損失率均在15%上下浮動，無明顯變化;而在pH值由4升至7時，腥味分值大幅降低，酶解液由“腥味偏重”變為“腥味較弱”或“略有腥味”，當pH值繼續升高時，腥味分值略微上升。這表明，pH值的高低對多肽吸附率影響甚微;對腥味而言，中性環境更利于AB-8型大孔樹脂對鱈魚蛋白酶解液中腥味物質的吸附。從腥味分值和多肽損失率兩個角度綜合考慮，當pH值介于6～8之間時，脫腥效果較好。因此，本實驗選取6、7、8作為后續響應面試驗中pH的3個水平。

2.2 響應面法優化大孔樹脂脫腥工藝

2.2.1 響應面試驗結果分析

采用Design-Expert 7.0軟件對響應面試驗結果進行統計分析，并對各因素進行二項式擬合，并應用該軟件繪制各指標與其他2個自變量的三維曲面圖。響應面試驗結果見表3，方差分析見表4。

根據實驗結果，分別對腥味分值Y及多肽損失率W進行二次多項式擬合，得到回歸模型如下:

表3 響應面試驗結果Table 3 Experimental results of response surface model

由表4可以看出，本實驗所選用的二次多項模型顯著(P＜0.05)，失擬項不顯著(P值分別為0.053 1、0.080 5，均大于0.05)，這說明此回歸模型理想，用方程Y和W擬合3個因素與腥味分值及多肽損失率之間的關系是可行的。對于腥味分值，其決定系數R2為0.973 5，校正決定系數Radj2為0.933 5，說明該模型能解釋93.35%的響應值。對于多肽損失率，其決定系數R2為0.993 0，校正決定系數Radj2為0.984 0，說明該模型能解釋98.40%響應值。

表4 腥味分值(Y)、多肽損失率(W)回歸模型方差分析Table 4 ANOVA on regression model of fishy odor value and polypeptide loss ratio

方差分析結果表明，X1、X2、X3、X12、X22和X32對腥味分值Y影響顯著，即溫度、樹脂添加量、pH三個因素均對腥味值有顯著影響;X1、X2、X3、X12、X1X3對多肽損失率影響顯著，即溫度、樹脂添加量、pH三個因素均對肽損失率有顯著影響，交互項溫度/pH對肽損失率也有顯著影響。

2.2.2 各因素對響應值的影響

各因素對響應值的影響如圖2(a～c)所示，在實驗范圍內，腥味分值隨著溫度、樹脂添加量、pH的增加出現下降，但繼續增大3者用量反而導致腥味分值的增加，這說明腥味分值Y具有低點。如圖2(d～f)所示，在實驗范圍內，多肽損失率W隨著溫度、樹脂添加量、pH的增加呈現先升高后降低的趨勢，說明這3個因素均有最佳值。

圖2 各因素交互效應三維曲面圖Fig.2 3D surface images of interaction effects

2.2.3 大孔樹脂靜態吸附脫腥最優工藝驗證

通過Design-Expert 7.0軟件，按照優化目標，將腥味分值Y設置為最小“minimize”，將多肽損失率W設置為最小“minimize”，得到最優工藝為溫度25℃、樹脂添加量13.23%、pH 8.0，此工藝下腥味分值Y預測為1.9，多肽損失率W預測為17.62%。按照該最佳工藝條件重復試驗3次，得到平均腥味分值Y為2.0，多肽損失率W為17.89%，實驗結果與軟件預測值接近，說明該工藝穩定、可靠。

2.3 SPME-GC-MS驗證脫腥前后腥味物質的變化

對鱈魚蛋白酶解產物及AB-8型大孔樹脂在最佳工藝下脫腥后的酶解產物分別進行SPME-GC-MS分離鑒定，得到的揮發性風味物質總離子流色譜圖如圖3所示，所示揮發性風味物質鑒定結果見表5。

圖3 脫腥前后總離子流色譜圖對比Fig.3 Total ions chromatogram of hydrolysate before and after deodorization

由圖3可知，在該GC-MS條件下得到的總離子流色譜圖的分離度較好。由表5可知，經AB-8型大孔樹脂最佳工藝處理后，鱈魚蛋白酶解產物中的8種揮發性風味物質被脫除，且其他物質的豐度均有一定程度降低。被脫除的風味化合物中，1-戊烯-3-醇、己醛、2-己烯醛及異戊酸冰片酯等是水產品中常見的腥味來源［15］:1-戊烯-3-醇主要賦予鱈魚蛋白酶解液以蘑菇、肉味和溫和油脂風味，具有低閾值和高風味活性的特點，被證明對北極蝦［16］等水產品的風味構成亦有較大貢獻;己醛、己酸甲酯等，主要賦予鱈魚蛋白酶解產物以青草味、清香味;異戊酸冰片酯(bornyl isovalerate)是鱈魚蛋白酶解液土腥味的主要來源［17］。因此，SPMEGC-MS結果表明，經AB-8大孔樹脂最佳工藝處理后的鱈魚蛋白酶解產物，其腥味有所減弱，該方法可有效脫除鱈魚蛋白酶解產物中的腥味物質。

表5 GC-MS及Kovats指數鑒定結果Table 5 Identification results of GC-MS and Kovats indices

3 結論

(1)單因素實驗結果表明，AB-8型大孔吸附樹脂脫腥效果最佳;其他條件相同，當溫度介于25～45℃時，當樹脂添加量介于5% ～15%時，當pH在6～8范圍內時，脫腥效果較好。

(2)AB-8型大孔樹脂對鱈魚蛋白酶解液的最佳脫腥工藝為:溫度25℃、樹脂添加量13.23%、pH 8.0。此工藝下脫腥得到的酶解液腥味分值為2.0，多肽損失率為17.89%，與軟件預測值接近。

(3)驗證實驗及SPME-GC-MS分析表明，該脫腥工藝有效、可靠，可作為AB-8型大孔樹脂對鱈魚蛋白酶解液的最佳脫腥工藝。

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