草魚冷藏過程中肌肉蛋白質結構特征的變化*

王發祥，李強，俞健，李向紅，王建輝，張付蘭，劉永樂

(長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南省水生資源食品加工工程技術研究中心，湖南長沙，410114)

蛋白質為草魚肌肉組織的最重要組成部分，其冷藏過程中的降解和變性均會導致其功能喪失，從而直接決定了魚肉的質量［5-6］。李曉波［7］認為，鮮肉發生腐敗變質的過程，實際上是蛋白質的降解、脂肪的酸敗和糖類的發酵作用的過程，其中蛋白質變性和降解是一個重要的腐敗過程，其結果不僅導致鮮肉營養成分的破壞，而且還產生嚴重的臭味，有時還會分泌毒素等;而蛋白質變性或降解的實質是蛋白質分子中的次級鍵被破壞，從而引起其天然結構解體或二級結構變化。本文旨在通過掃描電鏡和紅外光譜分析等方法，研究了冷藏過程中草魚肌肉蛋白質的微觀和分子結構的變化，以明確其結構特征的變化規律。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及主要儀器

新鮮草魚，購自當地農貿市場，每尾約1.5 kg。

TGL20M冷凍高速離心機，長沙易達儀器有限公司;JSM-6700F掃描電子顯微鏡，日本JEOL公司;Nicolet-6700傅立葉變換紅外光譜儀，美國尼高力公司;LS-45型熒光分光光度計，廈門億辰科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同冷藏時間點蛋白質樣品制備

分別取4 ℃ 貯藏下 0、2、4、6、8、10 d 的草魚肌肉，絞碎后，稱取10 g左右的樣品于100 mL的離心杯中，按文獻［8］最優條件提取肌肉蛋白質，提取液在常溫下透析24 h脫除SDS及鹽，經真空冷凍干燥得到蛋白質粉末，即為不同冷藏時間點蛋白質樣品，4℃冷藏備用。

1.2.2 掃描電鏡分析

蛋白質是細胞的產物，同時也是細胞中各種生命活動必不可少的物質，蛋白質分布在細胞的各個部位中。在構建模型時，學生應盡可能標記出各種高中階段所學蛋白質及相應的生命活動，將復雜知識可視化、系統化。聯系細胞的各個部位所進行的生命活動，思考會有哪些蛋白質的參與。如，細胞中的滑面型內質網上是否分布與脂質、糖合成的有關的酶、而粗面型內質網上是否分布與蛋白質加工有關的酶？細胞質基質中與細胞呼吸有關的酶（有氧呼吸第一階段、無氧呼吸）有哪些？

分別取少量冷凍干燥的不同冷藏時間點的草魚肉蛋白質樣品，鍍金處理60 s。然后以掃描電子顯微鏡觀察的其微觀形態結構。

1.2.3 傅里葉變換紅外光譜分析

采用傅里葉變換紅外光譜法(FT-IR)檢測方法分析草魚肌肉蛋白二級結構的變化情況［9-10］。一定量蛋白質樣品置于干燥器內充分干燥后，取1 mg與100 mg KBr混合研磨后壓片，置于全反射晶體的反射面上進行全波段(4 000～600 cm-1)掃描，每次試驗對信號進行64次掃描累加，分辨率為4 cm-1，扣除背景后得到紅外光譜圖。利用OMNIC數據處理軟件校正，限制譜帶范圍為1 600～1 700 cm-1;用Origin7.5軟件中的Peakfit功能，將譜圖進行兩點基線校正;再以Savitsk-Golay函數平滑，二階導數擬合。根據各指認峰積分面積計算出各種二級結構的相對百分含量。

1.2.4 表面疏水性分析

［11］采用 ANS(8-anilino-1-naphthalenesulfonate，1-苯胺基萘-8-磺酸)熒光探針法測定:稱取蛋白樣品0.01 g溶于 PB緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.0)并定容至100 mL，再取一定量以該緩沖液依次稀釋成原濃度的 0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 倍備用。取不同濃度的蛋白質樣品4 mL，加入50 μL的8 mmol/L ANS，設置激發波長為365 nm，發射波長為480 nm，測定其熒光強度，以熒光強度對蛋白質濃度作曲線，曲線初始階段的斜率即為蛋白質樣品的表面疏水性指數。

1.2.5 游離巰基含量變化分析

參考 Ellman’s試劑法［12］稍作修改:不同冷藏時間點的蛋白質樣品以11 mg/mL的SDS溶液配制成0.4%的蛋白質溶液，取1 mL加入0.2 mol/L的Tris-HCl緩沖液(含8 mol/L尿素、2%SDS和10 mmol/L EDTA，pH 6.8)中，混勻后取4 mL加入0.5 mL 0.1%的 DTNB{5，5'-dithiobis(2-nitrobenzoicacid)，5，5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)}試劑，45℃水浴30 min，在412 nm處測吸光值。以1.1%SDS溶液取代樣品作空白對照，根據結果計算游離巰基含量。

2 結果與分析

2.1 顯微結構變化分析

以掃描電子顯微鏡觀察不同冷藏時間草魚肌肉蛋白的超顯微結構，結果如圖1所示。可見，第0天的蛋白質顆粒結構完整，表面平滑，說明新鮮草魚肌肉蛋白質聚合緊密，形態規則;冷藏第2天，蛋白質結構明顯扭曲，但表面仍比較光滑;第4天，蛋白質表面開始出現細溝壑和孔隙，可能是因為蛋白質分子在組織酶的作用下開始水解;冷藏第6天，蛋白質逐漸解體、斷裂，并出現了較大孔穴;第8天開始，蛋白質明顯裂解成小片段;第10天時破碎愈加明顯，顆粒更細。這說明在冷藏過程中，草魚肌肉蛋白質會不斷變性、降解，并可能最終降解為小分子片段。

圖1 不同冷藏時期草魚肌肉蛋白質的掃描電鏡觀察結果Fig.1 SEM results of grass carp muscle proteins at different cold storage time

2.2 二級結構變化分析

傅里葉變換紅外光譜法是近十幾年發展起來的對蛋白質的二級結構進行定量研究的方法，最多用于二級結構分析的紅外譜帶為酰胺I帶(1 700～1 600 cm-1)［9-10］。圖2為不同冷藏時期草魚肌肉蛋白質的FT-IR圖譜，根據各組相關峰位的指認及面積與蛋白質二級結構成分的對應關系［10-13］將分析結果列于表1。

圖2 不同冷藏時期草魚肌肉蛋白質的FT-IR圖譜Fig.2 FT-IR spectra of grass carp muscle proteins at different cold storage time

表1 冷藏過程中草魚肌肉蛋白質二級結構含量變化Table 1 Change in content of secondary structure of proteins during grass carp cold storage

可見，隨著冷藏時間的延長，草魚肌肉蛋白質無規卷曲含量則逐漸上升，第10天升至19.71%，升高了20.33%，說明蛋白質變性導致其無序程度增加;而α-螺旋結構含量從第4天開始逐漸下降，第10 d降至35.65%，下降了12.77%，表明冷藏過程中肌肉蛋白質分子中α-螺旋結構會向無規則卷曲結構轉變，這與朱孔輝［14］等研究鰱魚肌肉蛋白質的結果非常相似。

2.3 表面疏水性變化分析

不同冷藏時間點草魚肌肉蛋白質的表面疏水性指數如圖3所示。可見冷藏前4 d表面疏水性指數一直增加，主要是因為其不斷變性引起折疊打開、分子結構逐漸伸展，導致部分原先埋藏在分子內部的疏水性殘基逐漸暴露至其分子表面所致，這與Benjakul等［11］研究發現太平洋鱈魚凍藏2 d后肌球蛋白疏水性增加2倍多的結果吻合;隨著冷藏時間延長，疏水性指數又逐漸下降，可能是因為變性展開加速了蛋白質分子被組織酶水解，而隨后降解成的小分子蛋白質又發生了重新折疊或聚合。

圖3 冷藏過程中草魚肌肉蛋白表面疏水性的變化Fig.3 Change in surface hydrophobicity of proteins during grass carp cold storage

2.4 游離巰基含量變化分析

巰基是蛋白質中最具反應活性的功能性基團之一，其含量變化在一定程度上反映蛋白質的聚合和變性程度［14］。草魚冷藏過程中肌肉蛋白質中游離巰基的含量變化如圖4所示。

圖4 冷藏過程中草魚肌肉蛋白巰基含量變化Fig.4 Changes in content of free sulfhydryl of proteins during grass carp cold storage

可見游離巰基含量與表面疏水性的變化趨勢基本相同，即前4 d含量逐漸上升，由0 d的40.11 mol/g上升至第4天的57.53 mol/g的最高值，繼續冷藏含量又開始下降，至第10天降至43.68 mol/g。游離巰基先升后降的趨勢在很大程度上反映了草魚冷藏過程中肌肉蛋白質結構變化的過程，蛋白質先受冷變性導致聚合體解開和空間結構伸展，一些二硫鍵被還原或原包埋于內部的巰基不斷暴露，進而有利于酶將蛋白質分子降解為小片段;著冷藏時間的延長，暴露的巰基又會被氧化成二硫鍵，蛋白質小片段重新聚合，從而導致蛋白質原有功能喪失，魚肌肉質量下降。

3 結論

本研究分析了冷藏過程中草魚肌肉蛋白質顯微結構、二級結構、表面疏水性及游離巰基含量的變化，從結構特性變化角度探討了其逐漸變性和降解的過程。掃描電鏡觀察發現，蛋白質顆粒逐漸由表面平滑開始扭曲、斷裂和破碎，直觀反映了其變性和降解過程;二級結構含量分析表明，冷藏過程中蛋白質變性逐漸嚴重，無序程度增加，冷藏第4天開始α-螺旋向無規則卷曲轉變，說明出現了不可逆的結構破壞;表面疏水性及游離巰基含量的變化間接反映了蛋白質分子內部次級鍵的變化，均呈現先上升至第4天后開始下降的趨勢，再次印證了4 d為腐敗的關鍵時間點，冷藏4 d后肌肉蛋白質開始由變性轉變為結構破壞并逐步被降解，從而導致肌肉質量持續下降。

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