木糖異構酶釀酒酵母孢子“微膠囊”的構建及酶學性質分析*

李毅，李子杰，中西秀樹，高曉冬

(江南大學生物工程學院糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

釀酒酵母二倍體細胞在氮源缺乏且非發酵性碳源存在下，停止營養生長同時啟動“產孢程序”，形成單倍體孢子［1-2］。與釀酒酵母營養細胞細胞壁相比，孢子壁包含有4種不同結構，從內到外依次為甘露糖層、β-葡聚糖層、殼聚糖層和二酪氨酸層。釀酒酵母孢子是一種休眠細胞，孢子壁所特有的二酪氨酸層和殼聚糖層結構，尤其是二酪氨酸層，賦予孢子能夠抵御多種環境壓力的特性［2-5］。基因DIT1參與二酪氨酸在胞質中的合成反應即催化L-酪氨酸形成二酪氨酸，敲除DIT1基因將導致二酪氨酸層不能形成，因而dit1Δ孢子不含有二酪氨酸層［4］。osw2Δ孢子雖然具有二酪氨酸層，但是表現出乙醚敏感性，可能是由于OSW2基因的缺失導致二酪氨酸層的網狀結構大小發生改變［6］。

D-木糖異構酶(XI，EC 5.3.1.5)是木糖代謝的關鍵酶，在工業上催化葡萄糖(木糖)到果糖(木酮糖)的轉化。為了賦予酵母代謝木糖的能力，多種來源的XI在酵母中進行表達，但目前只有來源于Clostridium phytofermentans、Piromyces sp.strain E2、Thermus thermophilus、Orpinomyces、Clostridium cellulovorans的幾種XI具有生物活性［7-11］。但是，本文中將來源于 Clostridium phytofermentans和 Clostridium cellulovorans密碼子優化后的xylA基因以及直接從Thermus thermophilus擴增的xylA基因在釀酒酵母細胞中表達，只有來源于Thermus thermophilus的基因檢測到對D-葡萄糖的催化活性。嗜熱菌Thermus thermophilus來源的XI首次在釀酒酵母實現了活性表達，在85℃具有催化D-葡萄糖生成D-果糖的最高活性［11］。該酶的研究應用主要集中兩個領域:一方面在分子基礎上的改造，降低其最佳催化溫度，利于釀酒酵母中異源表達發酵木糖生產酒精［12-13］;另一方面，作為一種嗜熱酶的模型，對其耐熱機理方面進行研究［14］。釀酒酵母孢子“微膠囊”這一全新固定化酶技術是根據釀酒酵母在產孢前孢子膜形成過程中，改變了分泌蛋白的分泌途徑，使得高爾基體囊泡運輸到前孢子膜，從而使蛋白定位在前孢子膜間隙中，在孢子壁組裝和前孢子膜外膜裂解過程中蛋白會被包埋在孢子壁中［2，15］。

本研究擬利用釀酒酵母孢子“微膠囊”這一全新固定化酶技術將來源于嗜熱細菌Thermus thermophilus HB8的D-木糖異構酶以分泌形式表達固定到孢子壁上殼聚糖和二酪氨酸之間的周質間隙，并以游離表達的XI作為對照，研究其酶學性質。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

釀酒酵母AN120野生型菌株，osw2Δ缺陷型菌株，dit1Δ缺陷型菌株以及質粒相關信息見表1。

1.2 培養基

LB培養基:酵母浸出粉10 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，瓊脂粉20 g(固體)，加水定容至1 L，121℃高壓滅菌20 min。

YPD培養基:酵母浸出粉10 g，蛋白胨20 g，加水至900 mL，121℃高壓滅菌20 min，使用前加入100 mL單獨滅菌的200 g/L葡萄糖。

SD-Trp培養基:無氨基酵母氮源(YNB)6.7 g，瓊脂粉20 g(固體培養基)，加水至900 mL，121℃高壓滅菌20 min，使用前分別加入100 mL單獨滅菌的200 g/L的葡萄糖和2 g缺少色氨酸(Trp)的氨基酸混合物。

YPA培養基:酵母浸出粉10 g，蛋白胨20 g，醋酸鉀20 g，加水定容至1 L，121℃高壓滅菌20 min。

產孢培養基:醋酸鉀20 g，加水定容至1 L，121℃高壓滅菌20 min。

1.3 質粒構建

為了使帶有SPR1基因的分泌信號肽序列(ss)的木糖異構酶基因xylA在TEF2基因強啟動子TEF作用下以分泌形式表達，構建表達載體pRS424-TEFpr-ssxylA如下:以pRS424-TEFpr-ss-GFP為模板，HXO-153和xylA-R1為引物，PCR擴增得到信號肽序列ss片段。以純化后的ss和xylA-R2為引物，T.thermophilus HB8的基因組為模板，PCR擴增得到ss-xylA片段。用SpeI和EcoRI限制性內切酶分別對ss-xylA片段和載體pRS424-TEFpr進行雙酶切，16℃過夜連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布LB氨芐抗性平板，得到陽性單克隆。為了構建帶有3×HA標簽的重組質粒 pRS424-TEFpr-ss-xylA-3HA，先以 HA-F和HA-R為引物，pFA6a-3HA-His3MX6為模板，PCR擴增得到3×HA片段，然后再以3×HA片段和HXO153為引物，PRS424-TEFpro-ss-xylA為模板，PCR擴增得到ss-xylA-3HA片段。將得到的ss-xylA-3HA片段和載體pRS424-TEFpr分別用SpeI和EcoRI雙酶切，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布LB氨芐抗性平板，得到陽性單克隆。為構建重組質粒pRS424-TEFpr-ss-GFP-xylA，以xylA-F2和xylA-R2為引物PCR擴增得到xylA片段，用PstI和EcoRI對xylA片段雙酶切后連接到pRS424-TEFpr-ss-GFP上。為構建重組質粒pET28a-xylA得到游離表達的XI純酶，以xylA-F1和xylA-R2為引物，T.thermophilus HB8的基因組為模板，PCR擴增得到xylA片段，經NdeI和EcoRI雙酶切后連接到表達載體pET-28a上。

表1 本研究中所用的菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究中的引物Table 2 Primers used in this study

1.4 木糖異構酶在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達和純化

將重組質粒pET28a-xylA轉化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取正確轉化子到含有卡那霉素的LB培養基中過夜培養。將2 mL培養液轉接到卡那霉素終濃度為50 μg/mL的100 mL LB培養基中，37℃培養，待OD600約為0.8時，加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L，于16℃誘導表達20 h。將細胞收集之后用10 mL平衡緩沖液(pH 7.5，50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑)重懸，置于冰上超聲破碎，12 000 g離心30 min收集上清液，利用鎳親和層析柱純化上清中的XI。首先用平衡緩沖液平衡柱子，然后上樣使上清液以約1 mL/min的流速流過鎳柱。上樣完畢后先用平衡緩沖液洗掉以較小吸附力結合在柱子上的雜蛋白，然后用洗脫緩沖液(pH 7.5，50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑)洗脫、收集目的蛋白，并用超濾管進行脫鹽和濃縮，取樣進行SDS-PAGE檢測，蛋白濃度用BCA蛋白試劑盒檢測。

1.5 木糖異構酶在釀酒酵母孢子上的表達、固定及孢子純化

將重組質粒pRS424-TEFpr-ss-xylA分別轉化釀酒酵母AN120野生型菌株、osw2Δ和dit1Δ缺陷型菌株，將酵母陽性轉化子轉接到5 mL SD-Trp液體培養基，30℃過夜培養后將1 mL培養液轉接到50 mL YPA培養基，30℃下搖床培養12 h，8 000 g離心1 min收集菌體，用無菌水洗滌2次后將菌體重懸在50 mL 2%的醋酸鉀培養基中，30℃下搖床培養24 h產孢。為了確保單個孢子能夠從子囊殼中釋放出來，將上述培養好的子囊孢子進行酶處理和超聲破碎。具體過程如下:8 000 g離心1 min收集子囊孢子，然后用1×PBS緩沖液洗滌孢子并重懸在相同緩沖液中，充分混勻后加入lyticase(625 U/g濕細胞)，30℃處理30 min后8 000 g離心1 min收集處理過的細胞，棄掉上層清液，細胞沉淀用1×PBS緩沖液洗滌2次，重懸于相同緩沖液中，充分混勻，超聲破碎獲得單個孢子。將破碎后的孢子懸浮液用Percoll密度梯度離心的方法進行純化，各梯度的配比如下:(1)80%Percoll，10%0.5%Triton-X，10%2.5 mol/L 蔗糖;(2)70%Percoll，20%0.5%Triton-X，10%2.5 mol/L 蔗糖;(3)60%Percoll，30%0.5%Triton-X，10%2.5 mol/L 蔗糖;(4)50%Percoll，40%0.5%Triton-X，10%2.5 mol/L蔗糖。將不同濃度梯度的Percoll溶液按照從高濃度到低濃度依次加入到離心管中，最后加入孢子懸浮液，15 000 g離心30 min，孢子和碎片分層，孢子將會位于離心管的底部，將上層液體和細胞碎片除去得到純化的孢子［17］。將純化的孢子用無菌水洗滌2遍后，進行真空冷凍干燥得到孢子粉末。

1.6 熒光分析木糖異構酶在不同孢子壁上的定位

為了進一步驗證XI是否表達在孢子壁上，將XI與綠色熒光蛋白GFP融合表達，在熒光顯微鏡下觀察XI在孢子壁上的定位。將重組質粒pRS424-TEF-pr-ss-GFP-xylA分別轉化釀酒酵母AN120野生型菌株，osw2Δ和dit1Δ缺陷型菌株，產孢過程同1.5，在尼康熒光倒置顯微鏡下，使用100×油鏡觀察，圖像利用NIS-Element AR軟件分析。

1.7 蛋白免疫印跡分析木糖異構酶在不同孢子壁上的表達

將重組質粒pRS424-TEFpr-ss-xylA-3HA轉化釀酒酵母AN120野生型菌株，osw2Δ和dit1Δ缺陷型菌株，孢子的制備過程同1.5。將孢子重懸在8 mol/L尿素中，冰上超聲破碎1 h，使孢子上的蛋白全部溶解在尿素中，12 000 g離心10 min，取上清用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度。以YPA培養基培養后的營養細胞作為對照，細胞破碎處理過程同孢子。最后取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測，按照濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙由下到上的順序疊放于電轉儀(1.0 A，25 V，30 min)，電轉完成后用5%的脫脂牛奶封閉PVDF膜3 h并用TBST緩沖液(150 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、體積分數0.05%的吐溫)洗膜3次，然后用含有一抗(Rabbit anti-HA，1∶4 000稀釋)的牛奶室溫下孵育3 h。用TBST緩沖液洗膜3次后，用含有二抗(Goat anti-rabbit IgG HRP，1∶4 000稀釋)的牛奶室溫下孵育3 h。TBST清洗3次后，用ECL顯色試劑盒對其進行顯色。

1.8 木糖異構酶酶學性質測定

XI的酶活測定在1.5 mL的體系中進行，反應體系為100 mmol Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)、2 g/L D-葡萄糖、10 mmol/L MnCl2。向反應體系中加入10 mg孢子(或3 μg游離酶)起始反應，在85℃下反應5 h后，沸水浴10 min終止反應。XI的酶活用高效液相色譜(HPLC)(HITACHI chromaster)進行分析，檢測條件為:Bio-Rad Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm)，流動相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.5 mL/min，柱溫60℃，5450示差檢測器。為了測定pH對XI酶活的影響，使用兩種緩沖液在85℃、不同pH條件下測定酶活。2種緩沖液分別為醋酸緩沖液(100 mmol/L，pH 5.0 和 6.0)、Tris-HCl緩沖液(100 mmol/L，pH 7.0，8.0和9.0)。為了測定溫度對XI酶活的影響，反應體系以100 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)作為緩沖液在不同溫度下(60～95℃)測定酶活。酶活的相對活性定義為最大酶活的百分比。為了測定孢子微膠囊固定XI的重復利用性，分別稱取10 mg凍干的3種孢子(野生型、osw2Δ和dit1Δ)，按上述測定酶法的方法測定轉化率，當反應結束后離心收集孢子，用超純水洗滌2次后進行下一次轉化率測定，共測定5次。

2 結果與討論

2.1 木糖異構酶在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達和純化

為了比較XI游離酶和孢子“微膠囊”XI固定化酶的酶學特性，首先在大腸桿菌BL21(DE3)中表達并純化了游離的XI。為了純化方便，在XI的N端設計了6×His的標簽。從SDS-PAGE上來看，純化得到的木糖異構酶分子質量在40 kDa左右(圖1)，與預測的大小43.9 kDa相近，并且純度達到90%以上。

圖1 SDS-PAGE檢測木糖異構酶的表達與純化Fig.1 SDS-PAGE analysis of XI expression and purification

2.2 熒光分析木糖異構酶在不同孢子壁上的定位

為了更加直觀地觀察XI在孢子壁上的表達和定位，將XI與GFP進行融合表達，通過GFP的熒光定位來確定XI的位置。從圖2中可以看到，對于野生型孢子和osw2Δ孢子來說，能夠清晰地看到GFP綠色熒光信號可以完好地包裹在未破子囊壁的孢子壁上，說明XI成功地表達在孢子壁上。相對于野生型孢子和osw2Δ孢子，dit1Δ孢子由于二酪氨酸層的缺失導致GFP信號強度稍弱，但仍可以觀察到融合蛋白表達定位到孢子壁上。

圖2 GFP標記的XI在孢子上的定位Fig.2 Localization of GFP-XI fusion protein in yeast spores

2.3 蛋白免疫印跡分析木糖異構酶在不同孢子壁上的表達水平

為了研究XI在不同類型孢子(營養細胞作為對照)的表達水平差異，將帶有3×HA標簽的XI在相應孢子中表達。從圖3中可知，相對于營養型細胞，孢子可以明顯包埋固定更多量的酶。野生型孢子和osw2Δ孢子表現出相對于dit1Δ更高的酶固定量，這與在dit1Δ孢子中表達的GFP-XI融合蛋白熒光信號較弱相一致，說明二酪氨酸層的存在可以在一定程度上能夠阻止酶的泄漏表達。

圖3 不同類型細胞的蛋白免疫印跡Fig.3 Western Blot of different cells

2.4 孢子“微膠囊”木糖異構酶酶學性質測定

盡管從GFP的熒光定位和western blot 結果可以確定XI成功地固定在孢子細胞壁上，但是由于細菌來源的蛋白表達、修飾不同于釀酒酵母，因此需要直接測定酶活來確定XI在孢子上是否具有催化活性。從圖4 HPLC檢測結果可以清楚地看到，底物D-葡萄糖在野生型孢子固定化酶的催化作用下可以轉化為D-果糖。

圖4 HPLC檢測固定在孢子上的XI的催化反應Fig.4 HPLC analysis of the reaction of XI immobilized on spores

由于3種孢子孢子壁結構的不同以及高溫反應條件下有降低固定效率的可能，因此以重復利用性為標準來確定固定化酶的穩定性。雖然dit1Δ孢子上的酶量低于野生型和 osw2Δ缺陷型(圖3)，但是dit1Δ孢子在第1次使用時表現出最高活性(圖5)。然而，dit1Δ孢子在第2次及多次使用后酶活下降迅速，可能是高溫破壞了酶與孢子的結合或者使結合不牢固的酶從孢子上脫離下來。相比較，雖然野生型和osw2Δ孢子由于二酪氨酸層的存在有效地阻止了酶的釋放，但是該層的存在在一定程度上影響了底物和酶的接觸。

圖5 XI在不同孢子上固定后的重復利用能力Fig.5 The reusabilities of XI immobilized on different spores

為了進一步了解XI固定在野生型和osw2Δ孢子上的酶學特性，分別檢測了pH和溫度對酶活的影響。首先，在不同pH條件下反應時，由圖6可以看到，孢子固定化酶和游離酶的最適pH值均為pH 7.0，對于野生型和osw2Δ孢子雖然沒有較大的pH耐受性差別，但孢子固定化酶相對于游離酶表現出范圍較廣的pH耐受性。同時，在不同溫度條件下反應時，從圖7可以看到，孢子固定化酶和游離酶的最適溫度為85℃。值得注意的是，野生型和osw2Δ孢子固定化酶在95℃高溫下的相對酶活都能達到最高酶活的60%。綜合考慮，孢子壁中二酪氨酸層的存在，一方面能有效地阻止酶的釋放，另一方面又可以提高酶對高溫的耐受性。另外，根據osw2Δ孢子表現出來的酶學性質，改變二酪氨酸層的疏松程度還可以提高酶和底物的結合能力。

圖6 pH對XI酶活的影響Fig.6 The effect of pH on the activity of XI

圖7 溫度對XI酶活的影響Fig.7 The effect of temperture on the activity of XI

3 結語

孢子“微膠囊”是一種新的酶固定化技術，通過分子生物學的方法使酶包埋在孢子殼聚糖層與二酪氨酸層之間，避免了蛋白純化和體外固定化等操作，并具有較好的重復使用性。因此，在醫藥、保健及食品等方面具有廣泛的應用價值。本研究中，木糖異構酶作為一種嗜熱酶，由于其較高的反應溫度，有效地避免了孢子在底物D-葡萄糖條件下萌發的可能，同時作為稀有糖D-阿洛酮糖合成的第一步，在接下來的工作中可以與第二步D-阿洛酮糖-3-差向異構酶結合，實現從相對低廉的底物D-葡萄糖向D-阿洛酮糖的轉化。另外，發掘與孢子萌發相關的基因，避免孢子在應用過程中的萌發，以及深入研究與二酪氨酸層結構相關的基因，改變二酪氨酸層的疏松程度，在此基礎上探索二酪氨酸層對酶的保護作用以及對底物分子的通透性，對于孢子“微膠囊”固定化酶系統的開發與利用具有重要意義。

［1］ Neiman A M.Ascospore formation in the yeast Saccharomyces cerevisiae［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2005，69(4):565-584.

［2］ Neiman A M.Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae［J］.Genetics，2011，189(3):737-765.

［3］ Briza P，Breitenbach M，Ellinger A，et al.Isolation of two developmentally regulated genes involved in spore wall maturation in Saccharomyces cerevisiae［J］.Genes Dev，1990，4(10):1 775-1 789.

［4］ Briza P，Winkler G，Kalchhauser H，et al.Dityrosine is a prominent component of the yeast ascospore wall.A proof of its structure［J］.J Biol Chem，1986，261(9):4 288-4 294.

［5］ Pammer M，Briza P，Ellinger A，et al.DIT101(CSD2，CAL1)，a cell cycle-regulated yeast gene required for synthesis of chitin in cell walls and chitosan in spore walls［J］.Yeast，1992，8(12):1 089-1 099.

［6］ Shi L，Li Z，Tachikawa H，et al.Microencapsulation of enzymes using yeast spores［J］.Appl Environ Microbiol，2014，80(15):4 502-4 510.

［7］ Brat D，Boles E，Wiedemann B.Functional expression of a bacterial xylose isomerase in Saccharomyces cerevisiae［J］.Appl Environ Microbiol，2009，75(8):2 304-2 311.

［8］ Kuyper M，Harhangi H R，Stave A K，et al.High-level functional expression of a fungal xylose isomerase:the key to efficient ethanolic fermentation of xylose by Saccharomyces cerevisiae?［J］.FEMS Yeast Res，2003，4(1):69-78

［9］ Madhavan A，Tamalampudi S，Ushida K，et al.Xylose isomerase from polycentric fungus Orpinomyces:gene sequencing，cloning，and expression in Saccharomyces cerevisiae for bioconversion of xylose to ethanol［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2009，82(6):1 067-1 078.

［10］ Ota M，Sakuragi H，Morisaka H，et al.Display of Clostridium cellulovorans xylose isomerase on the cell surface of Saccharomyces cerevisiae and its direct application to xylose fermentation［J］.Biotechnol Prog，2013，29(2):346-351.

［11］ Walfridsson M，Bao X，Anderlund M，et al.Ethanolic fermentation of xylose with Saccharomyces cerevisiae harboring the Thermus thermophilus xylA gene，which expresses an active xylose(glucose)isomerase［J］.Appl Environ Microbiol，1996，62(12):4 648-4 651.

［12］ L?nn A，Gardonyi M，van Zyl W，et al.Cold adaptation of xylose isomerase from Thermus thermophilus through random PCR mutagenesis［J］.European Journal of Biochemistry，2002，269(1):157-163.

［13］ Karhumaa K，Hahn-H?gerdal B，Gorwa-Grauslund M F.Investigation of limiting metabolic steps in the utilization of xylose by recombinant Saccharomyces cerevisiae using metabolic engineering［J］.Yeast，2005，22(5):359-368.

［14］ Chang C，Park B C，Lee D S，et al.Crystal structures of thermostable xylose isomerases from Thermus caldophilus and Thermus thermophilus:possible structural determinants of thermostability［J］.Journal of molecular biology，1999，288(4):623-634.

［15］ Suda Y，Rodriguez R K，Coluccio A E，et al.A screen for spore wall permeability mutants identifies a secreted protease required for proper spore wall assembly［J］.PloS one，2009，4(9):e7 184.

［16］ Zhang H，Tachikawa H，Gao X-D，et al.Applied uses of yeast spores as chitosan beads［J］.Appl Environ Microbiol，2014，80(16):5 098-5 105.

［17］ Kloimwieder A，Winston F.A screen for germination mutants in Saccharomyces cerevisiae［J］.G3(Bethesda)，2011，1(2):143-149.