匍枝根霉cbh2基因的克隆表達與結構分析*

張慶慶，謝志皓，李松，孫全霞，湯斌

(安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽蕪湖，241000)

纖維素酶，由3種主要組分組成，即內切葡聚糖酶(EG，EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(CBH，EC 3.2.1.91)和 β-葡萄糖苷酶(BG，EC 3.2.1.21)［1］。CBH包括CBHI和CBHII兩種異構酶，CBHI作用于纖維素的還原端，CBHII作用于纖維素的非還原端［2］，生成纖維二糖。在真菌中 CBHII分泌量沒有CBHI高，但其降解微晶纖維素的效率是CBHI的2倍［3］，CBH 酶活影響結晶纖維素的降解效率［4］，是破壞結晶纖維素的關鍵酶［5］。近年來，已有許多關于GH6、GH7 家族 CBH 的報道，Wang 等［6］通過將黑曲霉cbh結合到里氏木霉強啟動子Pcbh1質粒上，使用PEG-CaCl2方法轉化到里氏木霉中，重組子的酶活提高106倍;Takashima等［7］將CBH的結合域關鍵氨基酸位點進行突變來提高酶活;Tavagnacco等［8］研究結合域上糖基化位點對其結合效率的影響;Gao等［9］發現CBH的結合域具有破壞纖維素氫鍵結構。

目前對匍枝根霉的研究主要集中在γ-亞麻酸和脂肪脫氫酶等的研究［10］;在木質素降解酶系中，對匍枝根霉的研究主要在木聚糖酶［11］和纖維素酶［12］的研究，Tang等［13-14］將匍枝根霉中克隆表達 eg、bg基因，研究其結構與功能，并對匍枝根霉纖維素酶發酵條件進行優化，建立分批發酵動力學模型。目前，已經在黑曲霉、里氏木霉、康寧木霉、斜臥青霉等真菌中克隆出cbh2(外切葡聚糖酶II)基因，根霉屬的米根霉能分泌碳水化合物酶(CAZy)，但在基因組基因的研究中，其不含有GH6和GH7家族的基因［15］。本研究從匍枝根霉中克隆的cbh2基因，屬于GH6家族。cbh2基因已經成功在釀酒酵母、畢赤酵母、大腸桿菌等宿主中進行克隆表達，在大腸桿菌表達系統中，Wu等［16］將Thermobifida fusca菌中的cbh2在大腸桿菌中表達，并研究水解過程中的降解機制;Wang等［17］將Neocallimastix patriciarum J11菌中的cbh在大腸桿菌中表達，且具有耐熱和pH穩定性。本研究通過反向PCR技術獲得cbh2基因，該基因表達的CBHII酶能水解纖維素鏈非還原端生成纖維二糖，通過在E.coli BL21(DE3)克隆表達、分離純化獲得46 kDa的蛋白并研究酶的基本特性發現，CBHII具有很好的pH穩定性，能降解微晶纖維素，為進一步優化匍枝根霉的纖維素酶系，增強纖維素酶復合酶系的協同降解效率的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

匍枝根霉 TP-02(Rhizopus stolonifer TP-02)、E.coli DH5α 和E.coli BL21(DE3)、pET22-b(+)Vector為本實驗室保藏;克隆質粒pMD18-T購自Takara。

1.2 試劑和培養基

Taq 酶、dNTP、T4DNA Ligase、EcoRI、NotI購自Takara;胰蛋白胨、酵母粉、UNIQ-10柱式 Trizol總RNA抽提試劑盒、IPTG、氨芐硫酸鹽試劑、Acrylamide、Bis-acrylamide、AP、TEMED 引物設計購自上海Sangon 公司;BSA、Avicel購自 Sigma;HiTrap Ni，Hi-Trap DEAE FF，HiTrap Desalting，SephadexTMG-75 購自GE公司;其他藥品均為國藥分析純。

誘導培養基和LB培養基［13］

1.3 cbh2的克隆表達

1.3.1 引物設計

根據NCBI報道的cbh2基因進行比對分析，結合生物信息學分析手段和測序結果，設計引物如表1所示。

表1 PCR各引物序列Tabel 1 The sequences of primers for PCR

1.3.2 cbh2基因的克隆

將Rhizopus stolonifer接種在土豆培養基中活化24 h，以10%接種量轉接到誘導培養基中30℃ 180 r/min培養匍枝根霉60～72 h，收集菌體，清洗，冷凍干燥。用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取Rhizopus stolonifer的總RNA，以提取的總RNA為模板，Oligo dT-Adaptor為引物，逆轉錄合成cDNA的第一條鏈，以所合成的鏈為模板，以cbh2-AF/cbh2-AR引物擴增cbh2的核心cDNA序列。利用反向PCR技術［18］，根據獲得的cbh2的核心cDNA序列，設計反向引物，將逆轉錄合成的cDNA利用槽式引物進行擴增并用EcoRI切割，取單鏈cDNA 8 μL在T4連接酶的作用下16℃連接12 h，連接產物在65℃滅酶處理10 min。以環化好的cDNA為模板，cbh2-BF/cbh2-BR引物擴增cbh2的側翼序列，并通過膠回收與pMD18-T載體連接，藍白斑篩選送測序，獲得側翼序列。利用DNAStart軟件分析并設計cbh2-CF/cbh2-CR引物擴增出cbh2的全基因序列。根據CTAB的方法提取基因組DNA，并以基因組DNA為模板cbh2-CF/cbh2-CR為引物擴增cbh2的DNA序列。

1.3.3 cbh2表達載體的構建和誘導表達

把去掉信號肽的cbh2基因和表達載體pET22-b用EcoRI和NotI雙酶切，連接轉化到 E.coli BL21(DE3)進行克隆。挑取陽性克隆子驗證并測序，在LB培養基中，以未添加誘導劑的為對照，設計不同濃度的IPTG、誘導時間和誘導溫度對產酶進行表達研究。

1.4 氨基酸序列分析和同源建模

通過生物信息學的方法，利用PDB數據庫分析CBHII蛋白序列，選取最低的E-Value蛋白作為模板，其登錄號分別為:1QJW、4I5R、3CBH、1OC5、1OCN、1GZ1。通過DS 2.5軟件進行同源建模，并進行分子對接分析關鍵氨基酸與底物之間氫鍵的變化，及在催化過程中的重要性。

1.5 CBH 活性的測定［19］

在50℃的反應體系中，以微晶纖維素為底物，將0.5 mL適當稀釋的酶液加入試管中，混勻后于50℃水浴中反應30 min，終止反應，離心，加入DNS在沸水浴中顯色，測定上清液中的還原糖，每分鐘水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個酶活國際單位(IU)。

1.6 CBHII酶的純化

1.6.1 粗酶液的制備

在3 L自動發酵罐中以最佳條件培養重組大腸桿菌并收集菌體，清洗并超聲破碎獲得粗酶液，10 000×g離心10 min，上清液中加入飽和度為50%的固體(NH4)2SO4，鹽析過夜，4℃ 10 000×g離心10min，取沉淀物用適量緩沖液 A(20 mmol/L Tris-HCl+500 mmol/L NaCl+20 mmol/L C3H4N2，pH 7)溶解，并在此緩沖液中透析24 h，通過0.45 μm膜過濾后保存備用。

1.6.2 CBHII酶的3步純化

利用?KTA prime plus純化系統，Ni柱用緩沖液A平衡后，將樣品吸附在Ni柱上并平衡，用緩沖液B(20 mmol/L Tris-HCl+500 mmol/L NaCl+200～500 mmol/L C3H4N2，pH 7)進行線性洗脫，收集洗脫峰并測酶活。收集酶活樣品，使用HiTrap Desalting脫鹽后上樣于經過緩沖液C(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.0)平衡的HiTrap DEAE FF，用緩沖液D(20 mmol/L Tris-HCl+0 ～500 mmol/L NaCl，pH 7.0)進行梯度洗脫，收集洗脫峰并測酶活;合并酶活樣品使用HiTrap Desalting脫鹽后上樣5%于經緩沖液E(50 mmol/L HAc-NaAc，pH 4.8)平衡的G-75分離目的蛋白，收集洗脫峰并測酶活，并通過SDS-PAGE分析。

1.7 酶特性研究

1.7.1 溫度對酶活性的影響

在不同溫度(30～80℃)下，按1.5的方法測定CBHII的活性，最適溫度定義為最高酶活性(以相對活性100%計)所對應的溫度。將適量酶液與50 mmol/L、pH值為5.0的HAc-NaAc緩沖液在不同的溫度下(55～80℃)分別保溫不同時間后，立即在0℃冰箱中冷卻，然后在50℃下測酶的活性，以未經過保溫處理的酶活性作為評價熱穩定性的指標。

1.7.2 pH對酶活性的影響

在不同 pH值(pH 3.0～6.0、50 mmol/L HAc-NaAc;pH 6.1～8.0、50 mmol/L PBS)緩沖液配制2%的微晶纖維素底物，按1.5的方法測定酶活性，最適pH定義為最高酶活性所對應的pH值。將酶液在不同pH值的緩沖液中50℃保溫30 min測定殘余酶活性。酶的pH穩定性定義為殘余酶活性在85%以上的pH范圍。

1.7.3 動力學參數的測定

用50 mmol/L、pH為5.0的HAc-NaAc緩沖液配制不同質量濃度的微晶纖維素底物，按照1.5的方法測定，依據Hanes woolf plot的方法以［S］和［S］/V作圖，計算出CBHII的Km和Vmax值。

2 結果和分析

2.1 cbh2基因的分離和序列分析

利用反向PCR技術從匍枝根霉中獲得cbh2基因，并在基因組中獲得cbh2的DNA。該基因的DNA通過測序編碼1647 bp，cDNA通過測序編碼1323 bp;cbh2基因編碼含有3個內含子，獲得GenBank的登陸號KF916016.1。cbh2編碼440個氨基酸，其分子式為C2005H3083N539O658S17，分子質量(MW)約為46 kDa，等電點(pI)約為 4.81。1～33為結合區域(CBM)，34～85為連接區域(Linker)，86～440為催化區域(CD)。通過CDD數據庫比對分析，纖維二糖水解酶cbh2屬于糖苷水解酶第6家族。

2.2 cbh2催化過程的關鍵位點分析

將CBHII蛋白序列與PDB數據庫比對，選取最低E-Value的蛋白結構作為模板，催化域與1QJW的同源性為68.5%。結合DS 2.5軟件對匍枝根霉CBHII蛋白進行同源模擬，模型的PDF Total Energy最低值為9 303.7，DOPE值最低為-40 612.6，表明此模型可信度較高，并根據Ramanchandran Plot分析氨基酸的構象，表現出所建立模型的合理性。結構如圖1所示，CBM上保守的芳香族氨基酸殘基(Tyr和Trp)形成平坦的疏水性平面，與報道的T.reesei纖維二糖水解酶CBM的研究類似［20］。通過分子動力學研究，在催化過程中CBM首先與纖維素表面結合，CBM上3個平行的Tyr基團結合纖維素表面，增加其表面的親和力，結合域與纖維表面的結合是纖維酶解的必需和限速步驟;纖維六糖在CBHII催化隧道中主要與Arg179，Trp371，Lys399和 His418產生氫鍵，如圖2所示，在CD區的催化隧道中，由上述關鍵氨基酸對底物進行作用。通過動力學模擬整個催化過程的氫鍵分析，在底物不斷運動的過程中，氫鍵的大小和成鍵的基團都在不斷的變化，尤其是在His418上，是酶酸堿催化過程中最活潑的一個催化官能團，是影響催化反應速度的因素之一，His上咪唑基解離下來的質子濃度與水中的［H+］相近，在中性環境下一半以酸形式存在，一半以堿形式存在，既是供氫體又是受氫體，供出和接受質子的速度是相等的，結合其他的作用力通過纖維素鏈的移動降解β-1，4糖苷鍵，水解產生纖維二糖。

圖1 CBHII結構同源模擬和CBM的關鍵位點分析Fig.1 The structure homology modeling of CBHII and analysis of key sites in CBM

圖2 CD區催化隧道內關鍵位點分析Fig.2 Analysis of Catalytic Domain key sites in the tunnel

2.3 cbh2的克隆表達和純化

2.3.1 cbh2的克隆表達

cbh2基因與pET22b質粒進行雙酶切連接轉化到E.coli BL21(DE3)中，在Amp抗性平板上挑取陽性克隆子過夜培養，提取質粒進行酶切鑒定，并送測序。結果表明，重組菌E.coli BL21(DE3)/pET22bcbh2構建正確。

2.3.2 CBHII蛋白的誘導表達和純化

在搖瓶中以不同濃度的IPTG、不同的誘導時間和不同的誘導溫度進行產酶優化，最佳的條件:在LB液體培養基中，接種5%在37℃培養至OD600為0.6～0.8左右，加入IPTG使終濃度達到0.2 mmol/L并在25℃誘導14 h。以搖瓶的最佳產酶條件為基礎，在3 L全自動發酵罐中培養，溶氧控制在30%，發酵結束收集菌體，通過超聲破碎細胞，離心獲得粗酶液。

利用?KTA prime plus純化系統選擇鎳柱層析、DEAE FF層析和G-75層析分離帶標簽的目的蛋白，純化過程見表2，純化倍數提高了8.19倍，比活力達到4.67I U/mg。誘導表達和純化過程SDS-PAGE電泳圖見圖3所示，獲得46 kDa的酶蛋白。

表2 CBHII純化過程Table 2 The purification process of CBHII

圖3 CBHII分離純化SDS-PAGE凝膠電泳分析Fig.3 Purification and SDS-PAGE analysis of CBHII

2.4 CBHII酶的特性研究

2.4.1 酶的最適溫度

利用純化的CBHⅡ酶蛋白，在不同溫度(30～80℃)下，測定酶的最適反應溫度，結果如圖4(A)所示，CBHⅡ的最適反應溫度為50℃;通過不同的溫度下分別保溫不同時間研究酶的熱穩定性，結果如圖4(B)所示，在60℃以下酶的穩定性較好，溫度降低后酶活性就恢復正常，在50℃以上催化活力趨于下降，在50～60℃呈現可逆失活，65～70℃出現不可逆變性。(酶學性質研究的酶活測定數據根據5組平行實驗，分別去除最高值和最低值，以平均值計，下同)

圖4 CBHII的最適反應溫度及溫度穩定性Fig.4 The optimum temperature and thermostability of CBHII

2.4.2 酶的最適pH

CBHII的最適反應pH和pH穩定性研究結果如圖5所示。可知，CBHII的最適反應pH為5，當pH低于4和高于7時，酶的催化活性喪失較快，通過pH穩定性曲線發現，其在pH為4～7之間具有較好的穩定性;pH為5條件下30 min仍能保持原來的95%酶活，與最適反應pH也是一致的。

圖5 CBHII的最適pH和pH穩定性Fig.5 The optimum pH and pH stability of CBHII

2.4.3 酶反應動力學曲線

CBHII酶液與不同濃度的底物反應，在標準條件下測定酶活力，根據Hanes woolf plot作圖法以不同濃度的微晶纖維素為底物，求得米氏方程結果如圖6所示，求得 Km為 7.358 mg/mL，Vmax為 6.501 7［mg/(min·mL)］。

圖6 CBHII的 Hanes woolf plot圖Fig.6 Hanes woolf plot of CBHII

3 討論

利用反向PCR技術從匍枝根霉中克隆cbh2基因，其屬于GH6家族。本文就cbh2基因做了克隆表達、純化與酶性質方面的研究，并用同源建模和分子動力學的方法對其結構和催化機理進行探討研究，旨在為CBHII的應用提供數據參考和理論支持。采用E.coli BL21為宿主，將去除信號肽的cbh2基因整合到表達載體上，獲得E.coli BL21(DE3)/pET22b-cbh2重組菌，在大腸桿菌中實現可溶性表達，粗酶液酶活力為0.71 IU/mL，低于綠色木霉［21］cbh2在釀酒酵母中表達，但具有發酵周期短的特點。利用三步法進行純化，其優點在于純化過程中梯度去除雜蛋白，獲得純度較高的CBHII酶蛋白，比活力為4.67 IU/mg，對微晶纖維素表現出較高的酶活。

目前，對纖維二糖水解酶的研究主要在里氏木霉、黑曲霉、哈茨木霉、微紫青霉等的研究，在匍枝根霉中分離獲得外切纖維二糖水解酶基因的報道較少。在Neocallimastix patriciarum［18］中纖維二糖水解酶在E.coli BL21(DE3)中實現可溶性表達，且純化后獲得活力較高的蛋白。本研究獲得的重組CBHII酶的最適反應pH和溫度的研究結果與里氏木霉、草酸青霉分析表明，CBHII酶的最適反應pH與里氏木霉、草酸青霉相近，但最適反應溫度較里氏木霉具有耐熱性，CBHII酶活力與哈茨木霉相近，在E.coli BL21(DE3)進行表達CBHII，酶活力相對較低，原因可能是大腸桿菌缺乏協助蛋白折疊的系統［22］，真菌蛋白在表達的過程中無法形成正確折疊的高級結構，蛋白以錯誤形成包涵體出現，導致表達的CBHII酶活力低。本研究采用降低溫度來誘導表達，降低CBHII酶蛋白在大腸桿菌中的折疊速度，減少包涵體的形成，形成可溶性表達。構建的重組菌培養周期短，誘導劑使用濃度低，表達的CBHII蛋白在pH 4～7之間酶活力較穩定，但CBHII在E.coli BL21(DE3)中表達活力較低，我們將優化發酵條件和酶活測定方法來提高酶活，為制備以及在木質纖維素水解中的實際應用提供技術基礎。

［1］ Bhat M K.Cellulase and related enzymes in biotechnology［J］.Biotechnology Advances，2000，18(5):355-383.

［2］ Boisset C，Fraschini C，Schülein M，et al.Imaging the enzymatic digestion of bacterial cellulose ribbons reveals the endo character of the cellobiohydrolase Cel6A from Humicola insolens and its mode of synergy with cellobiohydrolase Cel7A［J］.Applied and Environmental Microbiology，2000，66(4):1 444-1 452.

［3］ Cheng C.Nucleotide sequence of the cellobiohydrolase gene from Trichoderma viride［J］.Nucleic Acid Research，1990，18(18):55-59.

［4］ WANG L S，ZHANG Y Z，GAO P J，et al.Changes in the structural properties and rate of hydrolysis of cotton fibers during extended enzymatichydrolysis［J］.Biotechnology and Bioengineering，2006，93(3):443-456.

［5］ Seiboth B，Hakola S，Mach R L，et al.Role of four major cellulases in triggering of cellulase gene expression by cellulose in Trichoderma reesei［J］.Journal of Bacteriology，1997，179(17):5 318-5 320.

［6］ WANG B B，XIA L M.High efficient expression of cellobiase gene from Aspergillus nigerin the cells of Trichoderma reesei［J］.Bioresource Technology，2011，102(6):4 568-4 572.

［7］ Takashima S，Ohno M，Hidaka M，et al.Correlation between cellulose binding and activity of cellulose-binding domain mutants of Humicola grisea cellobiohydrolase I［J］.Federation of European Biochemical Societies，2007，581(30):5 891-5 896.

［8］ Tavagnacco L，Mason P E，Schnupf U，et al.Sugar-binding sites on the surface of the carbohydrate-binding module of CBHI from Trichoderma reesei［J］.Carbohydrate Research，2011，346(6):839-846.

［9］ GAO P J，CHEN G J，WANG T H，et al.Non-hydrolytic disruption of crystalline structure of cellulose by cellulose binding domain and linker sequence of cellobiohydrolase I from Penicillium janthinellum［J］.Acta Biochimica et Biophysica Sinaca，2001，33(1):13-18.

［10］ 朱鈺，陸合，胡曉莉.影響米根霉產γ-亞麻酸的幾種因素［J］.微生物學雜志，2007，27(4):6-10.

［11］ 湯文晶，謝志皓，張慶慶，等.匍枝根霉液態發酵產木聚糖酶培養基優化研究［J］.安徽工程大學學報，2014，29(1):1-5.

［12］ TANG B，PAN H B，ZHANG Q Q，et al.Cloning and expression of cellulase gene EG1 from Rhizopus stolonifer var.reflexus TP-02 in Escherichia coli［J］.Bioresource Technology，2009，100(23):6 129-6 132.

［13］ 湯斌，張瑩瑩，楊亞平.匍枝根霉TP-02內切葡聚糖酶基因eg2的克隆表達及功能分析［J］.食品與發酵工業，2013，39(7):13-17.

［14］ 湯斌，許鐘源，李松，等.匍枝根霉纖維素酶發酵條件優化及分批發酵動力學模型的構建［J］.食品與發酵工業，2014，40(1):85-90.

［15］ Battaglia E，Benoit I，Brink J，et al.Carbohydrate-active enzymes from the zygomycete fungus Rhizopus oryzae:a highly specialized approach to carbohydrate degradation depicted at genome level［J］.BMC Genomics，2011，12(17):1-12.

［16］ WU W，BU L T，Vuong T V，et al.Loop motions important to product expulsion in the Thermobifida fusca glycoside hydrolase family 6 eellobiohydrolase from structural and computational studies［J］.The JournalL of Biological Chemistry，2013，288(46):33 107-33 117.

［17］ WANG H C，CHEN Y C，HUANG C T，et al.Cloning and characterization of a thermostable and pH-stable cellobiohydrolase from Neocallimastix patriciarum J11［J］.Protein Expression and Purification，2013，90(2):153-159.

［18］ 陸合，朱鈺，黃尤田.反向PCR克隆黑根霉R306Δ6-脂肪酸脫飽和酶基因［J］.微生物學雜志，2008，28(1):24-27.

［19］ 方浩，夏黎明.里氏木霉纖維二糖水解酶Ⅱ基因的高表達［J］.高效化學工程學報，2014，28(4):784-790.

［20］ CHEN L，Drake M R，Resch M G，et al.Specificity of O-glycosylation in enhancing the stability and cellulose binding affinity of Family 1 carbohydratebinding modules［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the U-nited States of America，2014，111(21):7 612-7 617.

［21］ 劉澤寰，全艷彩，唐根云，等.綠色木霉CBHII基因的克隆及在釀酒酵母中的表達［J］.華南理工大學學報，2009，37(6):91-95.

［22］ 陳科，黃瀟，路蕾，等.不同調控元件驅動下菊歐氏桿菌纖維素酶celY基因在大腸桿菌中表達的研究［J］.中國生物工程雜志，2012，32(2):24-28.