黑曲霉木聚糖酶的同源表達(dá)及其高產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵條件的優(yōu)化*

倪大偉，李瑞云，白愛枝，張文濤，王軍

1(內(nèi)蒙古自治區(qū)離子束生物工程重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特，010021)

2(內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特，010021)3(內(nèi)蒙古大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特，010021)

黑曲霉(Aspergillus niger)具有多種活性較強的酶系，是重要的酶制劑生產(chǎn)菌種，也是木聚糖酶的生產(chǎn)菌種之一。隨著真菌基因組學(xué)和基因微陣列及蛋白質(zhì)組學(xué)等實驗技術(shù)的發(fā)展，利用絲狀真菌作為宿主表達(dá)同源和異源蛋白也得到快速發(fā)展和應(yīng)用［1］，黑曲霉作為絲狀真菌的代表性菌種之一，其表達(dá)系統(tǒng)也越來越受到科技工作者的關(guān)注［2-3］。黑曲霉是國際公認(rèn)的安全生產(chǎn)菌株［4］，并且其本身具有強大的蛋白質(zhì)胞外分泌能力，有完善的翻譯后加工功能及成熟的發(fā)酵工藝等優(yōu)點，是外源和內(nèi)源蛋白表達(dá)的優(yōu)良宿主。

木聚糖酶是一種重要的工業(yè)酶制劑，在食品、飲料、造紙和飼料等方面有廣泛的應(yīng)用。目前市場上大部分高效木聚糖酶產(chǎn)品的技術(shù)核心都屬于國外公司，因此通過基因工程技術(shù)，構(gòu)建高表達(dá)的木聚糖酶工程菌，對于降低木聚糖酶的價格促進其應(yīng)用水平，是國內(nèi)木聚糖酶工業(yè)所面臨的最緊迫的問題。黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶基因xynB的同源表達(dá)研究的甚少，2005年Anthony等［5］利用 RT-PCR 從 A.niger BRFM281 mRNA擴增的帶有6個his標(biāo)簽的xynB基因克隆到有g(shù)pd強啟動子的表達(dá)盒，將該表達(dá)盒在蛋白酶陰性突變株Aspergillus niger D15#26中進行表達(dá)，獲得的1株基因工程菌的木聚糖酶產(chǎn)量達(dá)到900 mg/L，酶活力為625 U/mL;國內(nèi)的鄭瑞娟［6］從A.niger TS1中利用同樣方法克隆得到xynB基因，通過構(gòu)建與葡萄糖淀粉酶的融合表達(dá)質(zhì)粒，在尿嘧啶缺陷型A.niger M54中表達(dá)，獲得的重組菌的酶活力最高達(dá)507 IU/mL，分別是原出發(fā)菌和宿主菌的6.7倍和3.89倍。Record等［7］利用 Aspergillus nidulans gpd基因的啟動子、5’非編碼區(qū)和終止子將A.niger來源的阿魏酸脂酶faeA基因進行同源表達(dá)，表達(dá)量較原始菌株提高24.5 倍，達(dá) 1 g/L;Anthony Levasseur［8］采用同樣的策略表達(dá)A.niger BRFM131的阿魏酸脂酶faeB基因，產(chǎn)量較原菌株提高了16倍;同源表達(dá)較之異源表達(dá)，可有效避免異源表達(dá)中難以解決的問題，如分泌過程中蛋白的錯誤折疊和被內(nèi)源蛋白酶降解的可能以及物種密碼子的偏好性、基因結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性等，多種蛋白酶同源表達(dá)的成功，表明該策略具有廣泛的應(yīng)用價值。本實驗室從A.niger A327中克隆了木聚糖酶基因xynB［9］，采用同源表達(dá)策略將其表達(dá)在黑曲霉菌株A.niger A327中，本文對木聚糖酶活力最高的轉(zhuǎn)化子A.niger A70菌株的搖瓶發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 菌株與載體

出發(fā)菌株黑曲霉A.niger A327，由內(nèi)蒙古自治區(qū)離子束生物工程重點實驗室保藏;質(zhì)粒 VHb和p3SR2由中國科學(xué)院微生物所唐國敏教授惠贈。

1.2 主要儀器與試劑

TU-1800PC紫外-可見分光光度計，北京譜析通用儀器設(shè)備有限責(zé)任公司;DYY-12型電泳儀，北京六一;ZHWY-1102/1121型普通搖床，上海智誠，主要試劑:木聚糖(birchwood xylan)，美國sigma公司;玉米芯麩皮購于呼和浩特市郊，玉米芯經(jīng)粉碎機粉碎后備用;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)

從A.niger A327中克隆編碼xynB結(jié)構(gòu)基因及其5’調(diào)控區(qū)序列片段，總長1611bp，將其與目的載體pBS-T 連接［5］，并轉(zhuǎn)化 E.coli DH5α，挑取單克隆，鑒定陽性克隆子，分別將從質(zhì)粒VHb和質(zhì)粒p3SR2酶切得到的來源于A.nidulans的終止子TtrpC和選擇標(biāo)記基因amdS連接到已連入xynB基因的T載體中，得到表達(dá)載體pBS-XTP(圖12，并利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入菌株A327中，通過搖瓶發(fā)酵篩選產(chǎn)木聚糖酶活力最高的轉(zhuǎn)化子。

圖1Fig.1

1.4 木聚糖酶活力的測定方法［10］

取適當(dāng)稀釋的粗酶液0.1 mL，加到1 mL、1%的樺木木聚糖懸浮液中(pH5.0，0.2 mol/L醋酸緩沖液配制)于50℃水浴反應(yīng)10 min，用 DNS(3，5-二硝基水楊酸)法，測定產(chǎn)生的還原糖。以木糖為標(biāo)準(zhǔn)，在本實驗條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量定義為1個酶活力單位U/mL。

1.5 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

分離培養(yǎng)基(g/L):麩皮5，蛋白胨1，瓊脂20，Manders營養(yǎng)鹽液［11］定容 1 000 mL，pH 自然。PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200(去皮、切塊煮30 min，紗布過濾)，葡萄糖20，瓊脂15，蒸餾水定容至1 000 mL，pH自然。基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L):玉米芯75，麩皮24，Manders營養(yǎng)鹽液 1 000 mL，pH5.5 ～6.0。以上培養(yǎng)基在沒有添加糖蜜的情況下均在121℃滅菌30 min，添加糖蜜的培養(yǎng)基在115℃滅菌30 min;固體培養(yǎng)，置于30℃下培養(yǎng)4～5 d;液體培養(yǎng)，30℃下，搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵4 d，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。

1.6 基因工程菌產(chǎn)木聚糖酶條件優(yōu)化

1.6.1 培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，保持其他條件不變，分別添加不同濃度的玉米芯(40，50，60，70，80，90 g/L)，不同濃度的麩皮(15，20，25，30 g/L)，不同濃度的糖蜜(0，2，4，6，8，10 g/L)以及濃度均為 6 g/L的不同氮源((NH4)2SO4、NaNO3、NH4NO3、蛋白胨、尿素)，進行搖瓶發(fā)酵，研究各因子對木聚糖酶酶活的影響。

1.6.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

在基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的條件下，分別設(shè)置不同溫度(25℃(室溫)、28℃(黑曲霉A327產(chǎn)酶最適生長溫度)、31 ℃、34 ℃)，接種量(1.0、1.5、2.0、2.5 mL，孢子懸液濃度 108個/mL)，裝液量(30、45、60 mL)和搖床轉(zhuǎn)速(180、200、220轉(zhuǎn)/min)對基因工程菌A70的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

1.6.3 培養(yǎng)基的正交試驗

設(shè)計了4因素3水平的L9(34)正交試驗(見表1)，進一步對營養(yǎng)條件進行優(yōu)化。

表1 正交設(shè)計方案 單位:g/LTable1 Orthogonal design project

1.6.4 最適發(fā)酵條件驗證

利用上述單因素和正交試驗獲得的最適發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成進行最適發(fā)酵條件的驗證實驗。

以上發(fā)酵試驗均設(shè)置3組平行試驗，取平均水平，以發(fā)酵96 h上清液的木聚糖酶活力作為考核指標(biāo)考察各因素對基因工程菌A70產(chǎn)木聚糖酶的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 xynB基因在A.niger A327中的同源表達(dá)

將出發(fā)菌株A327菌株和篩選的部分轉(zhuǎn)化子(包括產(chǎn)酶水平最高的A70轉(zhuǎn)化子)分別在100 mL搖瓶中，28℃，200 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)，將發(fā)酵上清液離心得到粗酶提取液，沸水煮沸5 min，取相同體積的粗酶液進行SDS-PAGE(結(jié)果見圖2)。可見菌株A37，A55，A70，A74，A75，A77，A78 均不同程度地表達(dá)了xynB基因，木聚糖酶的產(chǎn)量不同程度的有所提高。目的產(chǎn)物分子量約為21 kDa，從圖中可以看出A63菌株產(chǎn)木聚糖酶的量較對照還要低，而A70菌株分泌木聚糖酶的量最多，這與發(fā)酵后酶活測定的結(jié)果一致(見表2)。表達(dá)程度的高低與xynB基因插入的拷貝數(shù)有關(guān)，在一定范圍內(nèi)插入拷貝數(shù)越多，表達(dá)量越高，當(dāng)拷貝數(shù)進一步提高，或許由于調(diào)控蛋白的滴定效應(yīng)，表達(dá)不再上升［12］，這一基因劑量效應(yīng)在外源蛋白的表達(dá)中同樣成立。從圖中可以看出有的菌株在表達(dá)xynB基因的同時，使其他蛋白的分泌有所提高，這可能與xynB基因所插入的位置有關(guān)，正好使其他蛋白的表達(dá)受到調(diào)控，提高了產(chǎn)量。

圖2 轉(zhuǎn)化株產(chǎn)酶的SDS-PAGE分析Fig.2 The SDS-PAGE detection of xylanase transformants

表2 轉(zhuǎn)化株發(fā)酵的木聚糖酶活力(IU/mL)Table 2 Xylanase activity of transformants fermentation

2.2 高效表達(dá)菌株A70的遺傳穩(wěn)定性

基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式:其一是結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性，重組 DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失;其二是分配不穩(wěn)定性，整個重組 DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸。將A70菌株進行斜面到斜面的傳代培養(yǎng)，傳代6次后，在基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，將經(jīng)不同傳代次數(shù)的A70菌株同時進行發(fā)酵實驗，結(jié)果(見表3)顯示，該菌株的遺傳穩(wěn)定性較好。

表3 Strain A70菌株的傳代酶活測定Table 3 The enzyme activity from continual inoculation of A70

2.3 發(fā)酵時間對菌株A70產(chǎn)酶的影響

隨著發(fā)酵時間的延長，微生物的代謝產(chǎn)物隨之增加，但分泌的代謝產(chǎn)物量通常受到營養(yǎng)條件、培養(yǎng)條件等多種因素的影響。實驗采取在相同的培養(yǎng)條件下，利用基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基對出發(fā)菌株A327和基因工程菌A70的發(fā)酵特性進行比較。結(jié)果如圖3和圖4所示，可見發(fā)酵96 h基因工程菌A70達(dá)到產(chǎn)酶高峰期，較出發(fā)菌株A327的產(chǎn)酶周期延長24 h，這可能是由于其基因序列中插入了表達(dá)載體，使得菌體的生長變慢或者使菌體的代謝調(diào)控機制受到影響，而使產(chǎn)酶周期延長，工程菌A70產(chǎn)酶水平為360 IU/mL，較出發(fā)菌株A327提高約16倍。

圖3 黑曲霉菌株A327的產(chǎn)酶曲線Fig.3 The cure of Strain A327 on xylanase production

圖4 黑曲霉菌株A70的產(chǎn)酶曲線Fig.4 The curve of A70 on xylanase production

2.4 高表達(dá)菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

在基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基條件下，根據(jù)實驗的目的添加或改變相應(yīng)的條件，對產(chǎn)酶水平最高的基因工程菌A70的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

2.4.1 碳源濃度對產(chǎn)酶的影響

在前期的研究中發(fā)現(xiàn)出發(fā)菌株A327以玉米芯為碳源時產(chǎn)木聚糖酶活力最高［13］，因此以玉米芯為主要碳源考察其初始發(fā)酵濃度對基因工程菌株A70產(chǎn)木聚糖酶的影響，結(jié)果見圖5，90 g/L的起始玉米芯濃度產(chǎn)酶的活力最高，同時也發(fā)現(xiàn)該濃度下發(fā)酵液因失水較多而變得粘稠，其次是80，40 g/L稍次之。

圖5 玉米芯的量對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of corncob concentration on xylanase production

2.4.2 麩皮質(zhì)量濃度對產(chǎn)酶的影響

本試驗在2.3.1的基礎(chǔ)上，在其它條件不變的情況下，分別以玉米芯質(zhì)量濃度為40、80和90 g/L，添加不同比例的麩皮進行發(fā)酵研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)玉米芯濃度和麩皮濃度為80 g/L和15 g/L時菌株A70產(chǎn)木聚糖酶的活力最高(結(jié)果見表4)。

表4 麩皮質(zhì)量濃度對產(chǎn)木聚糖酶活力的影響 單位:IU/mLTable 4 Effect of bran concentration on xylanase production

2.4.3 附加碳源濃度對產(chǎn)酶的影響

通常微生物發(fā)酵所需的碳源不止一種，而且不同種類的碳源對微生物代謝產(chǎn)物的分泌都有較大的影響。在其它條件不變的情況下，以玉米芯濃度為80 g/L，麩皮濃度為15 g/L，添加不同的速效碳源淀粉、葡萄糖、蔗糖、甜菜糖蜜、麥芽糖，發(fā)現(xiàn)菌株對甜菜糖蜜的利用效果最好。糖蜜是制糖工業(yè)的副產(chǎn)品，其組成因制糖原料、加工條件的不同而有差異，因其含有大量的蔗糖，因此是很好的微生物發(fā)酵培養(yǎng)基組分。對菌株A70來說，其利用甜菜糖蜜發(fā)酵產(chǎn)酶效果較單純的蔗糖好的原因可能是糖蜜中還含有較多的礦物質(zhì)成分以及其他營養(yǎng)素，對菌株的生長更有利。通過添加不同濃度的糖蜜考察其對菌株A70產(chǎn)木聚糖酶的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)添加的糖蜜濃度為12 g/L時，菌株產(chǎn)木聚糖酶的活力最高(見圖6)。

圖6 糖蜜質(zhì)量濃度對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of molasses concentration on xylanase production

2.4.4 不同氮源對產(chǎn)酶的影響

在上述實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基以80 g/L玉米芯，15 g/L麩皮，Mandels鹽液中去除(NH4)2SO4和 NaNO3后，分別加入(NH4)2SO4、NaNO3、NH4NO3、蛋白胨、尿素，質(zhì)量濃度為6 g/L，對照為原Mandlels鹽液不變，來研究氮源對產(chǎn)木聚糖酶的影響，結(jié)果見圖7，可見菌株A70對氮源的利用以尿素的產(chǎn)酶效果最好，NaNO3次之;但是實驗發(fā)現(xiàn)以尿素為氮源時，到發(fā)酵終點培養(yǎng)基的失水較嚴(yán)重，相比之下NaNO3的發(fā)酵效果更好。

圖7 不同氮源對產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of different nitriogen source on xylanase production

2.5 發(fā)酵條件對產(chǎn)酶的影響

以基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基對菌株A70的發(fā)酵溫度、接種量及溶氧條件進行了研究，試驗表明，產(chǎn)酶的最適溫度為28～30℃(見表5)，最適接種量為1.5 mL/瓶(見表6)，最適裝液量為30 mL/瓶，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速逐漸從180 r/min增加到220 r/min時，菌株的產(chǎn)酶水平隨之提高，說明菌株對溶氧的需求較高(見表7)，這也符合霉菌生長的特點。

表5 不同發(fā)酵溫度對酶活的影響Table 5 The effect of different fermentation temperature

表6 接種量對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Table 6 The effect of inoculation quantity on xylanase production

表7 溶氧對發(fā)酵的影響Table 7 The effects of ventilation in fermentation

2.6 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的正交試驗

上述實驗僅考慮了各個因素單獨的作用，未考慮各個因素均發(fā)生變化時，高產(chǎn)菌株發(fā)酵水平的變化。為了獲得同源表達(dá)基因工程菌黑曲霉A70最佳的產(chǎn)酶營養(yǎng)條件，選用L9(34)表設(shè)計了4因素3水平的正交試驗(見表1)進一步對營養(yǎng)條件進行優(yōu)化。正交試驗結(jié)果見表8。

表8 正交實驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test design

通過直觀分析正交試驗的結(jié)果，可以看出影響基因工程菌A70產(chǎn)酶的各因素主次順序為A＞C＞D＞B，最優(yōu)組合為玉米芯80 g/L，麩皮18 g/L，糖蜜14 g/L，NaNO38 g/L，在該組合下菌株產(chǎn)酶的最高水平為12586 U/mL。

2.7 最佳工藝條件驗證

按2.5確定的最佳培養(yǎng)基配方和2.4確定的最適發(fā)酵條件進行3次平行實驗，平均產(chǎn)酶水平為12 639 U/mL(見表9)，實驗結(jié)果表明，發(fā)酵工藝的重現(xiàn)性好，菌株的產(chǎn)酶水平穩(wěn)定。

表9 最適發(fā)酵條件驗證Table 9 The validation of optimal fermentation conditions

3 結(jié)論

通過對黑曲霉同源表達(dá)高產(chǎn)菌株培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化，菌株的發(fā)酵周期為4天，發(fā)酵培養(yǎng)基以玉米芯80 g/L，麩皮18 g/L，糖蜜14 g/L，NaNO38g/L，30 mL無氮Mandels營養(yǎng)液為最適培養(yǎng)基配方。發(fā)酵溫度為28～30℃，接種量為1.5 mL/瓶，搖床轉(zhuǎn)速以220 r/min發(fā)酵產(chǎn)酶水平最高，在上述優(yōu)化的條件下基因工程菌A70產(chǎn)酶水平為12 664 U/mL，較優(yōu)化前的3 601 U/mL提高約3.5倍。同源表達(dá)木聚糖酶的黑曲霉菌株A70發(fā)酵產(chǎn)酶水平較高，生產(chǎn)成本低，該實驗為用黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)其他酶類提供了參考。

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