利用酶解-發酵聯用技術提高豬骨泥的功能性*

王帥楠，宗紅，陸信曜，諸葛斌，方慧英，黨藝文，孫進，樓笑笑，馮倩

1(江南大學糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，生物工程學院，工業微生物研究室，江蘇無錫，214122)

3(浙江正味食品有限公司，浙江省調味食品制造工程技術研究中心，浙江義烏，322000)

畜禽鮮骨大約占到胴體的10% ～15%，是肉類加工業中一個非常重要的副產物，隨著我國畜禽養殖業的迅猛發展，畜禽肉類產量逐年遞增，其副產物畜禽骨骼的產量也隨之迅速增加，每年有近約2 000萬t的畜禽骨頭產生。畜禽骨骼除富含蛋白質、脂肪、骨膠原、軟骨素(酸性黏多糖)等營養成分外，還含有多種礦物質，如鋅、磷、鈣、鐵等，含量是鮮肉的數倍，營養極為豐富。

目前，對畜禽骨的加工利用已受到重視。丁小燕［1］等人利用復合風味蛋白酶對雞骨進行深度水解，確定了蛋白酶酶解工藝，獲得含有豐富氨基酸的動物水解蛋白。Quaglia［2］等人研究表明，采用酶解等方法能夠有效地將骨蛋白與不可溶性殘留成分分開，并獲得具有一定功能特性的短肽。秦斌鈺［3］等人利用枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌對豬骨泥進行發酵，使骨蛋白水解度提高到46.1%。利用單一的商品蛋白酶或菌株發酵水解骨蛋白深度有限，回收利用率不高，骨原料得不到充分利用。

本研究將酶解與發酵技術聯用對豬骨中的骨蛋白進行水解處理，為考察該技術對豬骨泥功能性品質的影響，對其可溶性膠原蛋白、可吸收性鈣、小肽、功能性氨基酸、抗氧化活性等進行分析，為畜禽骨類的功能性開發提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)F2，植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)M1，江南大學微生物研究中心保藏。

1.1.2 原料與儀器

新購新鮮畜骨粗粉經高壓蒸煮、烘干、粉碎備用。DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)、4-二甲氨基苯甲醛、羥脯氨酸標準品、異硫氰酸苯酯為sigma公司產;蛋白酶protexTMP購于Genencor;其他試劑為分析純。

MP5002電子天平，上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠;alltech高效液相色譜儀，美國alltech公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業有限公司;多功能高速粉碎機，上海廣沙工貿有限公司;超凈工作臺，蘇州空氣凈化設備廠。

1.1.3 培養基

菌株活化培養基(g/L):牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0;種子培養基(g/L):骨粉 15.0，NaCl 5.0;發酵培養基(g/L):骨粉200.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 豬骨泥加工工藝

酶解:蛋白酶protexTMP在65℃，pH9.0，加酶量為6 000 U/g條件下酶解7 h后，于100℃水浴中加熱3～5 min，酶解液離心后取上清液備用。

發酵:Bacillus subtilis F2和L.plantarum M1種子液按菌株比1.3∶1，以3%接種量接種，37℃，150 r/min的條件下分別發酵36 h。發酵液離心后取上清液備用。

酶解-發酵:豬骨泥進行酶解后，以Bacillus subtilis F2和L.plantarum M1種子液按菌株比2∶1，接種量3%接種，37℃，150 r/min的條件下分別發酵30 h。發酵液離心后取上清液備用。

1.2.2 總氮的測定

采用凱氏定氮法［4］。

1.2.3 小肽含量的測定

采用 TCA 沉淀法［5］。

1.2.4 水解度的測定

采用甲醛滴定法［6］。

1.2.5 氨基酸的測定［7］

1.2.6 羥脯氨酸的測定［8］

1.2.7 發酵液抗氧化性測定

(1)清除DPPH自由基能力的測定

取1.5 mL發酵上清液加入1.5 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L)混合均勻，室溫避光反應30 min，517 nm下測定吸光值Ai，空白組以等體積95%乙醇代替DPPH溶液，記作Aj;對照組以等體積去離子水代替樣品記作Ao。DPPH自由基清除率:

DPPH(%)=［1-(Ai-Aj)/Ao］。

(2)清除羥自由基(·OH)［9］能力、清除超氧自由基(O2-·)［10］能力測定及還原力測定［11］

1.2.8 酶解產物多肽分子量分布

采用高效液相色譜法。色譜條件:色譜柱:TSK-gel2000 SWXL(300 mm×7.8 mm);流動相:V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1;紫外檢測波長:220 nm;流速:0.5 mL/min;柱溫:30℃;進樣量:10 μL。

1.3 數據分析

本實驗所有數據測定均重復3次，所獲結果進行單因素方差分析。采用Duncan新復極差法分析95%的置信區間內不同處理間顯著性差異，所用軟件為 SPSS 19.0(SPSS Inc，Chicago，Illinois，USA)。

2 結果與討論

2.1 酶解-發酵處理豬骨泥可溶性膠原蛋白及可溶性鈣含量分析

膠原蛋白是一類具有獨特結構的功能性蛋白，而羥脯氨酸是其主要成分之一，在正常膠原蛋白中占13.4%［12］。由于豬骨中富含膠原蛋白，水解后骨泥中的羥脯氨酸(Hyp)含量在一定程度上可以反映其可溶性膠原蛋白的含量。不同處理后豬骨泥羥脯氨酸及可吸收性鈣含量如圖1所示。

圖1 不同處理下樣品中Hyp及可溶性鈣含量Fig.1 The contents of soluble hydroxyproline and soluable calciumin different samples

由圖1可知，與酶解樣品相比，酶解-發酵處理樣品中Hyp及可吸收性鈣含量分別提高了68.16%和112.79%;與菌株發酵處理樣品相比分別提高了95.38%和44.09%。表明酶解-發酵聯用技術對產品中可溶性膠原蛋白及可吸收性鈣含量有著顯著性影響(P＜0.05)。利用安全菌株乳酸菌分泌有機酸溶出骨泥中以羥基磷灰石結構存在的鈣，變成利于人體消化吸收的可吸收性鈣，同時骨泥結構疏松多孔，表面積增加，使得未被蛋白酶酶解的骨蛋白在發酵菌株作用下分解為可溶性膠原蛋白及小肽、氨基酸。

2.2 酶解-發酵處理豬骨泥氨基酸含量分析

利用高效液相色譜對不同處理樣品中的氨基酸進行分析，結果如表1。由表1可知，與酶解處理樣品相比，酶解-發酵處理樣品中必需氨基酸、抗氧化性氨基酸、鮮味氨基酸含量分別提高了65.84%、141.9%和112.25%;與菌株發酵處理樣品相比分別提高了37.44%、109.21%和48.18%。可見，酶解-發酵處理提高了樣品中的必需氨基酸、鮮味氨基酸、抗氧化性氨基酸含量，在豐富產品風味的同時又提高產品的營養保健功能特性。

表1 不同處理樣品的氨基酸含量Table 1 Amino acids composition of different hydrolysates

2.3 酶解-發酵處理豬骨泥小肽含量及蛋白水解物分子量分布

豬骨蛋白水解產物中多肽的分子質量大小及分布是決定其功能性重要因素之一，不僅反映蛋白的水解程度，而且與水解物的抗氧化特性有著密切聯系［13］。

由圖2可見，3種加工工藝在其最佳處理條件下，酶解-發酵處理樣品水解度(DH)、小肽含量均高于另兩種處理，分別為61.26%、19.16 mg/mL。由表2可知，豬骨蛋白經酶解-發酵處理后，酶解-發酵技術對分子質量大于5 kDa多肽含量無顯著性影響(P＞0.05)，但對分子質量小于1 000 Da的小肽所占的比例有顯著提高(P＜0.05)，占54.38%。生物活性肽常含有2～20個氨基酸且分子質量越小能夠被腸道吸收呈現生物活性功能的可能性越大［14］。由此可見，酶解-發酵處理技術提升了產物的功能特性。

圖2 不同處理下樣品骨蛋白水解度和小肽含量Fig.2 The DH and the content of peptides in different samples

表2 骨蛋白水解后分子質量分布及其所占比例Table 2 The molecular mass distribution and proportion of peptides of different samples

注:表中數據為3次重復的平均值±標準差。小寫字母表示P≤0.05，不同字母表示差異顯著(Duncan新復極差法分析)。

2.4 酶解-發酵處理豬骨泥抗氧化活性分析

清除DPPH自由基、超氧陰離子(O2-·)、羥基自由基(·OH)的能力和對鐵的還原能力是衡量物質抗氧化活性的常用關鍵指標。對不同發酵樣品進行抗氧化活性的測定，結果見圖3。

由圖3可以看出，酶解-發酵處理對豬骨泥抗氧化活性有著顯著性影響(P＜0.05)。與酶解樣品相比，酶解-發酵處理樣品的清除O2-·的能力、清除·OH的能力和對鐵的還原能力分別提高了約45.32%、73.23%、164.23%，發酵處理樣品的抗氧化活性略高于酶解處理樣品。酶解-發酵處理后的豬骨泥小分子短肽比例大大提高，含有更多可以作為電子供體的底物，能夠與自由基結合轉化為狀態比較穩定的物質終止自由活性鏈反應［15］，使得其抗氧化活性得以提高。

圖3 不同發酵時間樣品的抗氧化活性的分析Fig.3 Analysis of antioxidant capacity in different samples

3 結論

研究發現，與商品酶酶解樣品相比，酶解-發酵技術處理樣品對可溶性膠原蛋白、可吸收性鈣、小肽含量有顯著提高，可溶性膠原蛋白中羥脯氨酸及可吸收性鈣含量分別提高了95.38%和112.79以上;必需氨基酸含量提高了2倍以上，鮮味氨基酸、抗氧化氨基酸分別提高了112%和142%。酶解-發酵處理樣品產物中分子質量小于1 000 Da的小肽所占的比例為54.38%，提高了78.73%，抗氧化活性提高了45.32% ～164.23%。結果表明，酶解-發酵技術不僅提高了豬骨泥原料的利用率，還增強了其營養保健功能，為開發高品質且具有營養保健功能的豬骨基原料品提供了依據。

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