低溫乳酸菌發酵泡白菜工藝與品質分析*

韓新鋒，李小艷，黃道梅，賈秋思，胡露，胡欣潔，何利，劉書亮

1(四川農業大學食品學院，四川雅安，625014)2(農產品加工及貯藏工程四川省重點實驗室，四川雅安，625014)

泡菜是我國一種以乳酸菌發酵為主并具有多種保健功能的食品。乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)作為中溫型微生物，一般在低于15℃的條件下很難生長，目前為止多數乳酸菌為常溫下分離所得，泡菜的工業化生產一般使用的菌劑也多以常溫發酵為主［1-3］，其發酵周期短易過酸和過熟，然而生產上蔬菜的收獲和鹽漬也多集中在冬季，常溫乳酸菌對泡菜的發酵速度過慢從而限制了工業化生產。另外，蔬菜表面的附生微生物中部分為致腐菌甚至可能存在致病菌，在泡菜發酵前期可能生長繁殖影響泡菜的安全性和品質，所以常用12%以上鹽度進行控制。耐低溫乳酸菌的應用，不僅可以解決這一生產問題，而且在一定程度上可以抑制泡菜中雜菌的生長，減少敗壞，降低亞硝酸鹽含量，保持獨特的口感和風味［4］。迄今為止，關于低溫乳酸菌在泡菜中應用的研究還不多見，Choi等［5］從15℃下發酵的泡菜中分離到Leuconostoc citreum，并將其接種于泡菜在15℃條件下發酵，研究了其產酸情況，余文華等［6］研究了耐低溫乳酸菌接種于泡菜在7℃條件下發酵的產酸及亞硝酸鹽降解情況，然而在低溫條件下，低溫乳酸菌接種泡菜發酵的工藝及品質分析這一領域的研究還很薄弱。

本文以2株耐低溫乳酸菌3m-1(Lactobacillus plantarum)和8m-9(Leuconostoc mesenteroides)為研究對象，10℃條件下，拮抗試驗確定了菌株間無拮抗作用，適于混合發酵泡白菜，并確定了白菜發酵的最適菌株配比、工藝條件及發酵時間，比較了10℃和30℃條件下泡菜成品的理化、微生物及感官指標，為低溫泡菜大規模工業化生產奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌株:通過限制低溫(10℃)培養條件，經過產酸能力測試、低溫測試復篩及低溫乳酸菌界定后，從泡菜水中分離得到2株耐冷菌株，經系統鑒定菌株3m-1為植物乳桿菌(L.plantarum)，菌株8m-9為腸膜明串珠菌(L.mesenteroides)。以上菌株由四川農業大學食品微生物實驗室保藏。

培養基:MRS培養基、營養瓊脂、白菜汁培養基［7］、平板計數瓊脂(PCA)、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)、煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)。

主要試劑:蛋白胨等均為生化試劑(BR);檸檬酸氫二銨等均為分析純(AR)。

泡菜原料:白菜、芹菜、花椒等均為市售。

1.2 實驗方法

1.2.1 兩株耐低溫乳酸菌間的拮抗試驗

定量以100 μL/孔加入菌株3m-1(或8m-9)的發酵上清液(10℃下于白菜汁培養基中培養72 h)于含有菌株8m-9((或3m-1)106CFU/mL)的牛津杯雙層瓊脂法制備的檢測平板［8］，同時設重復，4℃冰箱擴散1 h后，10℃正置培養96 h，觀察有無抑菌圈出現，初步確定菌株間的拮抗作用。

將活化菌株3m-1和8m-9，接種于白菜汁培養基，10℃混合培養120 h，每12 h取樣，測定發酵液活菌數，以菌株3m-1和8m-9單獨接種于白菜汁培養基為對照［9］，進一步確定菌株間有無拮抗作用。

1.2.2 泡菜發酵工藝路線

1.2.3 菌株配比的篩選

共分為6組進行篩選，第1組為自然發酵對照組，第2組和第3組為菌株3m-1、8m-9單獨接種發酵組，第4組至第6組為菌株3m-1和8m-9按照1∶1、1∶2、2∶1比例復配接種發酵組。將上述各組在10℃下發酵，每24 h取樣測定pH值、總酸和亞硝酸鹽含量，并對產品進行感官評價，確定發酵菌株及其配比。

1.2.4 10℃條件下耐低溫乳酸菌最適配比接種發酵泡白菜工藝條件的優化

選擇鹽濃度(3%、4%、5%)、糖濃度(2%、4%、6%)、接種量(0.1%、0.2%、0.3%)3因素3水平，進行L9(34)正交試驗，定期取樣測定pH值，并對產品進行感官評價，確定泡菜的最佳工藝參數。

1.2.5 10℃和30℃下泡白菜成品品質特性的比較

按上述步驟確定菌株配比及最佳工藝參數，分別在10℃和30℃下發酵，比較發酵終點泡菜成品的感官、理化及微生物指標。

1.2.6 感官評價

邀請10名具有食品專業背景的研究生組成評定小組依據表1對泡菜的形態、色澤、口感、口味、氣味、脆度進行感官評定(總體得分=形態×10%+色澤×10%+氣味×20%+口味×30%+脆度×30%)。

表1 發酵泡白菜感官評分標準表［10－12］Table 1 Sensory evaluation standard of pickled Chinese cabbage

1.2.7 理化指標的測定

pH值的測定:采用精密pH計測定發酵過程中泡菜pH值。

總酸的測定:參照GB/T 12456-2008采用酸堿中和法測定。

亞硝酸鹽的測定:參照GB 5009.33-2010采用鹽酸萘乙二胺法測定。

鹽度的測定:參照GB/T 5009.51-2003采用Ag-NO3標準溶液滴定法測定。

還原糖的測定:參照GB/T5009.7-2008采用直接滴定法測定。

1.2.8 微生物指標的測定

菌落總數計數:參照GB 4789.2-2010方法測定。

大腸菌群的測定:按照GB 4789.3-2003方法測定。

乳酸菌數的測定:參照GB 4789.35-2010方法測定。

霉菌和酵母菌計數:參照GB 4789.15-2010方法測定。

2 結果與分析

2.1 兩株耐低溫乳酸菌間的拮抗試驗

10℃條件下，菌株3m-1和8m-9間的抑菌試驗無抑菌圈出現，初步確定菌株間無拮抗作用。為了證實抑菌試驗的可靠性，比較了菌株3m-1和8m-9在白菜汁培養基中單獨培養以及混合培養的活菌數(圖1)。菌株3m-1和8m-9混合培養時生長情況良好，活菌數在60 h時即達到109cfu/mL，實驗結果與抑菌試驗結果一致，菌株3m-1和8m-9之間無拮抗作用，可以混合搭配用于發酵泡白菜。

圖1 菌株3m-1和8m-9在白菜汁培養基中單獨培養和混合培養的活菌數動態變化Fig.1 Enumeration of viable plate count of LAB in Chinese cabbage extract medium inoculated alone or simultaneously with LAB strains of 3m-1 and 8m-9

2.2 菌株間配比的確定

接種有菌株8m-9的泡白菜前5天產酸速度快(P＜0.05)，后期產酸量小而慢(P＜0.05)，不易過酸而影響口感;接種有菌株3m-1的泡白菜后期產酸快且量大，發酵15 d pH值降到3.60左右，總酸含量達到0.40%左右，而自然發酵前2天酸度基本無變化(P＞0.05)(圖2)，發酵20 d總酸含量只達到0.22%(圖3)，與楊曉暉等［13］研究結果一致。不同菌株接種發酵泡白菜均出現了亞硝峰，自然發酵泡菜亞硝峰出現在第5天(8.64 mg/kg)，而接種發酵泡白菜的亞硝峰一般出現在第1天(1.67～2.60 mg/kg)(圖4)，均符合DB 51/T975-2009《四川泡菜》的限量要求。不同的菌株配比對泡菜的感官評分有一定的影響，其中組 3(8m-9)和組6(3m-1∶8m-9=2∶1)與其它組有顯著性差異(P＜0.05)，感官評分最高，特別是在泡菜的氣味、口味和色澤方面有顯著性差異(P＜0.05)(表2)。綜合考慮，最終選擇菌株8m-9以及菌株3m-1和8m-9以2∶1復配作為優選菌株及配比進行后續試驗。

圖2 不同菌株接種發酵泡白菜的pH動態變化Fig.2 Variation of pH value in pickled Chinese cabbage fermented with different LAB strain

圖3 不同菌株接種發酵泡白菜的總酸含量動態變化Fig.3 Variation of total acid content in pickled Chinese cabbage fermented with different LAB strains

圖4 不同菌株接種發酵泡白菜的亞硝酸鹽含量動態變化Fig.4 Variation of nitrite content in pickled Chinese cabbage fermented with different LAB strains

表2 不同菌株單獨或復配接種發酵對泡白菜感官評價的影響Table 2 Sensory evaluation of pickled Chinese cabbage fermented with different LAB strains

2.3 10℃條件下發酵泡白菜工藝條件的確定

如表3所示，10℃下，8m-9菌株單獨接種發酵泡白菜中，3因素對泡菜品質影響順序為:鹽加量＞糖加量＞接種量，最優條件為:4%鹽加量、4%糖加量、0.3%接種量，由于菌株8m-9(L.mesenteroides)為異型發酵菌，產酸柔和，當發酵13天pH值降到4.00左右時對泡菜進行感官評價，當發酵20 d pH降到3.70左右時感官評分最高(P＜0.05);菌株3m-1和8m-9以2∶1混合發酵泡白菜中，3因素對泡菜品質影響順序為:接種量＞糖加量＞鹽加量，最優條件為:5%鹽加量、2%糖加量、0.3%接種量，當發酵5天pH值降到3.80左右時對泡菜進行感官評價，當發酵9天pH降到3.60左右時感官評分最高(P＜0.05)(表4)。

表3 優選菌株接種發酵泡白菜正交試驗表Table 3 Orthogonal experiment for pickled Chinese cabbage fermented with preferred LAB strains

表4 優選乳酸菌發酵泡白菜優化工藝的感官評分結果Table 4 Sensory evaluation for pickled Chinese cabbage fermented with preferred LAB strains

2.4 10℃和30℃下泡菜成品品質特性的比較

10℃和30℃下，以優選乳酸菌單獨或混合發酵白菜，成品理化、微生物和感官指標結果見表5。10℃下，泡菜酸度和亞硝酸鹽含量明顯低于常溫(P＜0.05)，發酵周期雖長，但口感清淡風味更佳，且防止了泡菜過酸和過熟;10℃下，菌落總數與乳酸菌數基本一致(乳酸菌可以于PCA平板上生長)，而且酵母菌數明顯低于常溫，說明低溫可以抑制雜菌的生長;10℃和30℃下，霉菌 ＜10 CFU/g，大腸菌群 ＜30 CFU/100 g，符合DB 51/T975-2009規定。

表5 10℃和30℃下泡菜成品理化、微生物和感官指標Table 5 Physicochemical and microbial index，sensory evaluation of pickled Chinese cabbage fermented at 10℃and 30℃

3 討論

我國泡菜的工業化生產以常溫發酵為主，而關于低溫發酵的研究少見報道。本文以2株耐低溫乳酸菌3m-1(L.plantarum)和 8m-9(L.mesenteroides)為對象，在1℃條件下，首先通過拮抗試驗確定2株耐低溫菌在白菜汁培養基中無拮抗作用，可以混菌搭配用于發酵泡白菜;然后確定了發酵菌株的最佳配比，分別為8m-9單獨以及3m-1和8m-9以2∶1復配作為發酵菌種，傳統的發酵技術多以純菌或混菌接種，產品品質也各有不同［14-16］，但兩種乳酸菌同時接種發酵泡菜的報道還不多見;優化了組3和組6的工藝條件，分別為鹽加量4%、糖加量4%、接種量0.3%和鹽加量5%、糖加量2%、接種量0.3%，低溫發酵鹽加量低，口味清淡風味柔和飽滿，而常溫發酵為防止泡菜過酸及抑制雜菌生長，會加大鹽的添加量，影響了泡菜的口感［17］;微酸、酸化和過酸為泡菜發酵3階段，酸化期為泡菜的最佳食用期，所以本文在泡菜pH值降到4.00～3.80時進行感官評價，確定菌株8m-9單獨以及菌株3m-1和8m-9以2∶1復配發酵泡白菜的最佳食用pH值分別為3.70和3.60左右，而報道的研究多對泡菜整個發酵過程(發酵初期雜菌較多同時也未能避開亞硝峰)或成品進行感官評價［18］。

本文比較了10℃和30℃下泡菜成品的理化、微生物和感官評價指標，常溫發酵速度快，泡菜易過酸、變味而風味不佳;低溫發酵周期雖長，但不易過酸，風味濃厚、飽滿、柔和。四川當地蔬菜的收獲和鹽漬多集中在冬季，企業在冬季生產泡菜時，車間溫度一般為10℃左右，選擇此溫度進行發酵試驗，更接近生產實際，也利于對低溫乳酸菌菌株特性和生產性能進行研究。低溫環境中常溫乳酸菌一般不易生存或生長，生產上為防制蔬菜腐敗常會增加鹽使用量等措施，從而加大了生產的成本，同時蔬菜表面附有的微生物部分為致腐菌甚至可能存在致病菌，常溫下發酵前期會大量繁殖而影響泡菜的品質，耐低溫乳酸菌的應用不僅可以解決這一問題，而且為低溫泡菜大規模工業化生產奠定了理論基礎。

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