重組木聚糖酶酶解玉米芯制備低聚木糖*

楊然，朱培華，姚君，李秀婷

1(北京工商大學食品質量與安全北京實驗室，北京，10048)

2(北京工商大學食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京，100048)

3(北京工商大學北京市食品風味化學重點實驗室，北京，100048)

低聚木糖又稱木寡糖，由2～7個木糖以β-1，4-糖苷鍵連接而成，以木二糖、木三糖為主，具有顯著的雙歧桿菌增殖能力，還具有不被消化性、無齲齒性及促進人體對鈣的吸收等特性［1］。在我國，玉米作為重要的糧食經濟作物，每年會產生大量的農業廢棄物玉米芯，而玉米芯中木聚糖的含量高達35% ～40%［2］。采用適宜的提取方式獲得豐富的玉米芯木聚糖資源，并應用酶解技術制備功能性低聚木糖，勢必可以解決環境問題，同時變廢為寶，創造經濟附加值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料、菌種與試劑

玉米芯原料，山東龍力公司饋贈;重組木聚糖酶，實驗室制備重組畢赤酵母GS115發酵所得;木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖標品，購自Sigma公司;其他化學試劑均為國產分析純。

1.1.2 培養基

YPD培養基:葡萄糖2%，胰蛋白胨2%，酵母提取物1%，瓊脂1.5%;BMGY培養基:胰蛋白胨2%，酵母提取物 1%，甘油 1%，YNB 1.34%，生物素0.05%，KH2PO41.2%，KH2PO40.3%;BMMY培養基:胰蛋白胨2%，酵母提取物1%，甲醇0.5%，YNB 1.34%，生物素 0.05%，KH2PO41.2%，KH2PO40.3%。

1.2 實驗方法

1.2.1 木聚糖酶活力的測定

木聚糖酶活力的測定參照DNS法［3］。取0.1 mL適當稀釋的酶溶液，加入到0.9 mL用0.05 mol/L、pH 4.8的醋酸緩沖液配制的10 g/L櫸木木聚糖底物溶液中，55℃反應5 min，用DNS法測定釋放的還原糖量，利用木糖做標準曲線。木聚糖酶活力單位定義為:在上述條件下，每分鐘水解木聚糖生成1 μmol還原糖所需要的酶量。

1.2.2 酶解還原糖含量的測定及組成分析

還原糖含量的測定采用DNS比色法［4］。分別取0.1 mL木聚糖酶水解液加入DNS試劑0.9 mL，沸水浴中煮沸5 min后顯色，迅速冷卻，用蒸餾水定容至刻度搖勻，540 nm波長處測定吸光度。以木糖為標準曲線計算水解液中還原糖含量。

酶解產物組成分析采用薄層層析法。展層劑:V(正丁醇)∶V(乙酸)∶V(高純水)=2∶1∶1，展層 1 次。顯色劑:V(甲醇)∶V(濃 H2SO4)=95∶5，130 ℃烘烤顯色，同時用木糖～木五糖作標準樣品。

1.2.3 玉米芯木聚糖含量的測定

本試驗改進Hashimoto等［5］用地衣酚-鹽酸法測定面粉中總戊聚糖含量的方法，用于玉米芯中木聚糖含量的測定。

稱取1.875 g FeCl3和0.5 g地衣酚，將兩者混合預溶于10 mL重蒸水中，后用30%HCl定容至250 mL備用。取0.5 g待測樣品于研缽中，加入72%的H2SO45 mL，研磨樣品1 h至樣品完全成均勻乳狀，將乳狀物轉入250 mL容量瓶中定容，充分混勻，濾紙過濾，上清液用地衣酚-鹽酸法測總糖含量(mg/L)。

1.3 玉米芯木聚糖的制備

1.3.1 堿法提取玉米芯木聚糖

稱取玉米芯100 g，按料液比1∶10添加去離子水1 000 mL，煮沸1 h，過濾，棄去上清液，以減少雜質對木聚糖得率的影響。再按料液比為1∶10添加10%的NaOH溶液，煮沸2 h，過濾，棄去濾渣，濾液用HCl中和至pH 7，8 000 r/min離心處理15 min，所得沉淀經多次洗滌即為玉米芯粗木聚糖，60℃烘干，待測得率。

1.3.2 蒸煮解法提取玉米芯木聚糖

稱取玉米芯100 g，按料液比1∶10添加濃度為0.1% 的H2SO4溶液1 000 mL，60℃水浴12 h，過濾，棄去上清液，加水1 000 mL，121℃密封蒸煮2 h，過濾，棄去濾渣，調節pH值至7，醇沉，8 000 r/min離心處理15 min，取固體，透析，60℃烘干，待測得率。

1.4 酶解法制備玉米芯低聚木糖

1.4.1 單因素試驗

利用重組畢赤酵母GS115發酵制備木聚糖酶XynA，并對堿法提取的玉米芯木聚糖進行酶解以制備低聚木糖。分別考察不同加酶量(5、10、15、20、25 U/mL;其他酶解條件為底物濃度2%，酶解溫度50℃，酶解時間 4 h);不同底物濃度(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%);不同酶解時間(0.5、1、2、4、6、8 h);不同酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)等條件對還原糖得率的影響。

1.4.2 響應面優化試驗

根據單因素試驗確定影響酶解的關鍵因素，利用Design-Expert軟件設計組合試驗，并采用 Box-Benhnken中心組合設計原理設計3因素3水平共17個試驗點的響應面分析試驗，以確定最佳酶解條件。

1.5 玉米芯木聚糖及低聚木糖制備得率的計算方法

玉米芯木聚糖得率計算公式:

玉米芯低聚木糖(還原糖)得率計算公式:

式中，Xm:玉米芯木聚糖得率，%;XOs:玉米芯低聚木糖(還原糖)得率，%;m:玉米芯粗木聚糖質量，g;M:玉米芯的質量，g;Y:玉米芯中木聚糖含量;Y`:玉米芯粗木聚糖含量;c:酶解液還原糖濃度，g/mL;V:酶解液體積，mL。

2 結果與討論

2.1 玉米芯木聚糖的提取

低聚木糖的生產分為木聚糖的提取與水解，要獲得低聚木二糖、木三糖較高的低聚木糖，木聚糖的提取十分關鍵［6］。根據半纖維素提取所使用的溶劑的不同，提取方法可歸納為三大類，即酸水解、堿水解和熱水解法［7］。其基本原理都是破壞半纖維素與纖維素、木質素及其他成分間的結合鍵，從而使半纖維素游離出來［8］。本文分別考察了蒸煮法及堿提法對玉米芯粗木聚糖提取效果的影響，結果如圖1所示。采用堿提法提取得到的玉米芯粗木聚糖得率為36.7%，此試驗結果高于邵佩蘭等人［9］采用同樣方法提取的玉米芯粗木聚糖得率。而另一種木聚糖提取方法-蒸煮法，相對于堿提法對環境表現溫和，但所得玉米芯粗木聚糖得率較低。

圖1 不同提取方法對玉米芯粗木聚糖得率的影響Fig.1 The effect of different extraction methods on the yield of corn cob xylan

為進一步確定2種提取方法所得木聚糖原料對酶解制備低聚木糖的影響，將2種方法所得粗木聚糖經木聚糖酶酶解，產物經薄層層析展開，結果如圖2所示。蒸煮法和堿提法所得木聚糖原料經木聚糖酶酶解后均可得到以木二糖、木三糖、木四糖及木五糖為主要產物的低聚木糖。然而，蒸煮法所得木聚糖在酶解過程中產生了部分木糖和糖醛類物質［10］，這些產物的生成不利于低聚木糖的生產制備及分離純化。因此，后續試驗以堿提法獲得的玉米芯粗木聚糖為底物制備低聚木糖。

圖2 不同方法提取玉米芯木聚糖酶解產物TLC分析圖Fig.2 TLC analysis of hydrolyzate from corn cob xylan extraction by different menthods

2.2 酶解堿法提取玉米芯粗木聚糖制備低聚木糖

2.2.1 加酶量對還原糖得率的影響

本試驗選擇重組畢赤酵母GS115發酵制備的重組木聚糖酶XynA為酶解實驗用酶。該重組菌株經BMGY培養基富集培養48 h后，無菌重懸至BMMY培養基中。每24 h添加0.5%甲醇誘導培養，至216 h后得到酶活力約為2 235 U/mL的木聚糖酶XynA。經測定，該重組木聚糖酶的最適反應溫度為55℃，最適反應pH值為4.8，有較好的溫度穩定性及耐酸性，適宜低聚木糖的生產應用。分別選擇5、10、15、20、25 U/mL的木聚糖酶添加到酶解試驗體系中，以確定酶解法制備玉米芯低聚木糖的最適加酶量，試驗結果如圖3所示。當加酶量在5～15 U/mL，玉米芯木聚糖的還原糖得率增幅緩慢，繼續提高加酶量至20 U/mL時，還原糖得率最高為13.5%，繼續增加加酶量，還原糖得率沒有明顯提高。

圖3 加酶量對還原糖得率的影響Fig.3 The effects of the dosage of XynA on the yield of reducing suger

2.2.2 底物濃度對還原糖得率的影響

底物濃度對還原糖得率的影響結果如圖4所示，當玉米芯粗木聚糖濃度為1%時，酶解所得還原糖得率最高，而繼續增加底物濃度還原糖的得率明顯降低。張金永等人同樣以玉米芯為原料酶法制備低聚木糖，最適底物濃度為3%［11］。實際生產中，較高的底物濃度有利于生產成本的降低，然而底物濃度的提高往往會導致產品得率的下降。在高底物濃度環境下，體系黏度較大，影響了酶、底物和產物的擴散以及酶與底物的接觸，從而降低了木聚糖酶的酶解效率［12］。

圖4 底物濃度對還原糖得率的影響Fig.4 The effects of the substrate concentration on the yield of reducing suger

2.2.3 酶解溫度對還原糖得率的影響

酶解溫度對還原糖得率的影響如圖5所示。隨著酶解溫度的升高，還原糖得率直線上升，至50℃時達到最大值約33%;繼續升高酶解溫度，還原糖得率反而降低，60℃時得率僅為峰值的41.2%。本試驗所用木聚糖酶為重組酶，前期試驗結果顯示該酶的最適反應溫度為55℃，在50℃左右該酶能保持良好的熱穩定性和水解效果。韓玉潔等人研究以小麥麩皮為底物制備低聚木糖，其研究結果表明該酶解反應的最適溫度為40℃［13］。一般來說，反應溫度對酶解效果的影響是多方面的，在一定范圍內，升高溫度可以加快酶-底物中間體分解轉化為產物的速度，然而溫度過高會降低酶的穩定性，使其失去活性，最終影響酶的酶解效果［14］。

圖5 酶解溫度對還原糖得率的影響Fig.5 The effects of temperature on the yield of reducing suger

2.2.4 酶解時間對還原糖得率的影響

酶解時間對還原糖得率的影響如圖6所示。隨著酶解時間的延長還原糖得率逐漸上升。酶解0.5 h到4 h階段還原糖得率上升速度較快(增長了3.3倍);4 h后反應體系中還原糖的濃度基本保持不變。隨著反應時間的延長，木聚糖酶的活性逐漸降低，酶解效率下降;另一方面，底物的減少和酶解產物引發的反饋抑制效應進一步影響了木聚糖酶的酶解效力［15］。

圖6 酶解時間對還原糖得率的影響Fig.6 The effects of hydrolysis time on the yield of reducing suger

2.2.5 酶解條件的響應面優化

根據Design Expert 8.0.1的中心組合試驗設計原理，依據酶解條件單因素試驗結果選擇對酶解影響最為顯著的3個因素，即木聚糖底物濃度(A)、酶解溫度(B)和酶解時間(C)，以酶解產生還原糖得率為響應值，設計響應面優化試驗，經軟件設計共有17組組合試驗，按各個組合試驗因素要求完成了玉米芯木聚糖的酶解試驗，各組合試驗結果如表1所示。

表1 Box-Behnken實驗設計與結果Table 1 Design and results of Box-Behnken experiment

表2是本試驗模型可信度統計分析結果，經分析可知預測相關系數(Pred-R-Squared)0.912 6與修正相關系數(Adj.R-square)0.971 9數值相近，說明此模型可信度較高。當噪音值大于4時，說明響應面模型擬合度理想，而本試驗中噪音比數值為21.399，進一步說明此模型可操作性強，可用此模型對試驗進行預測和分析。

表2 模型可信度分析表Table 2 Analysis of model reliability

利用Design-Expert軟件對數據(表3)進行二次多項回歸擬合，獲得還原糖得率對底物濃度、酶解溫度及酶解時間的二次多項回歸方程:還原糖得率=33.58-0.19 A-1.50B+1.19C+0.100 A B-0.98AC-0.80BC-1.60 A2-4.08 B2-2.85 C2

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Test and results of significance for simulated regression coefficient

在影響還原糖得率的因素中，一次項B、C及二次項 AC、BC、A2、B2、C2即木聚糖底物濃度、酶解溫度和酶解時間對木聚糖酶解效率的影響都非常顯著。由此可知，各個具體試驗因素對響應值的影響不是簡單的一次線性關系，而符合曲線規律，如回歸方程所示。方差試驗結果分析中，失擬項F值為2.09，而P＞F值為0.244 9，說明本模型可操作性較強，不易引起系統誤差。

圖7為底物濃度與酶解溫度對還原糖得率的影響。當底物濃度為0.5% ～1.1%，酶解溫度為45～51℃范圍時，兩者存在著顯著的增效作用，玉米芯還原糖的得率隨著底物濃度和酶解溫度的增加而增加;而隨著底物濃度和酶解時間的進一步增加，還原糖的得率反而降低。分析響應面曲面可知，底物濃度和酶解溫度對玉米芯還原糖得率的交互影響顯著，而溫度因素的曲面彎曲度較大，說明該因素對還原糖得率的影響更為顯著［17］。

圖7 底物濃度與酶解溫度對還原糖得率的影響Fig.7 The effect of substrate concentration and temperature on the yield of reducing suger

圖8為酶解溫度和酶解時間對玉米芯還原糖得率的影響。當酶解溫度在50℃左右，酶解時間在4 h左右時，響應面曲面出現峰值，說明酶解溫度和酶解時間兩因素對還原糖得率影響顯著，且二者呈現明顯的交互作用。

圖8 酶解溫度與酶解時間對還原糖得率的影響Fig.8 The effect of temperature and hydrolysis time on the yield of reducing suger

利用Design-Expert軟件優化最佳酶解條件為木聚糖底物濃度0.9%、酶解溫度49℃、酶解時間4.5 h，在此條件下得到實際還原糖可達33.9%，較單因素試驗結果提高了約1.1%。歐陽嘉等人研究了重組木聚糖酶C0602生產低聚木糖的制備工藝，還原糖產率為29.76%，低于本試驗研究結果［18］。

2.3 酶解產物組成分析

功能性低聚木糖是由2～7個D-木糖以β-1，4-木糖苷鍵結合而成的，由于低聚合度的糖具有獨特的生理功能和良好的工藝性能，成為了低聚糖的主要功效成分，因此聚合度在2～4之間的低聚木糖在食品行業中的應用較為廣泛［19］。本文按照優化實驗條件酶解堿法提取玉米芯木聚糖，采用TLC分析其酶解產物大致組成。分析結果如圖9所示，畢赤酵母所產重組木聚糖酶XynA酶解玉米芯木聚糖所得酶解產物主要為木二糖、木三糖，無木糖產生。酶解初始階段，隨著酶解時間的增加，木二糖、木三糖含量增加，且有少量木四糖、木五糖產生;8 h后木五糖及木四糖又逐漸酶解轉化為木三糖及木二糖。由此可見，利用重組木聚糖酶XynA酶解玉米芯木聚糖生產低聚木糖具有良好的研究價值和應用前景。近年來，利用木聚糖酶酶解木聚糖制備低聚木糖的研究越來越普遍。汪輝等人利用木聚糖酶酶解豆皮制備低聚木糖，通過離子色譜檢測酶解液中的糖分組成，發現酶解液中含有大量單糖［20］;朱浩擁等人采用響應面法優化玉米芯木聚糖酶解制備低聚木糖的酶解條件，并利用TLC法分析酶解液中產物組成主要為木二糖、木三糖及木四糖且以木二糖、木三糖含量為主［21］，與本試驗結果分析基本一致。

圖9 堿法提取玉米芯木聚糖酶解產物TLC分析圖Fig.9 TLC analysis of hydrolyzate of corn cob xylan by recombinant xylanases from Pichia pastoris

3 結論

(1)本試驗考察了蒸煮法和堿提法對玉米芯木聚糖得率的影響，試驗結果顯示，以堿提法得到的木聚糖得率較高為36.7%，且分析二者酶解產物組成可知，堿提法所得木聚糖經酶解制備獲得的低聚糖以木二糖-木五糖為主，無木糖及糖醛類物質產生，適宜作為酶解底物制備低聚木糖。

(2)通過單因素、響應面試驗確定以堿提玉米芯木聚糖為原料制備低聚木糖的最佳條件:底物濃度0.9%，酶解溫度49℃，酶解時間4.5 h，在此條件下得到實際還原糖量可達33.9%。另外，對酶解液的成分進行TLC分析，結果表明酶解堿提玉米芯木聚糖可產生以木二糖及木三糖為主要成分的低聚木糖溶液。

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