熒光猝滅法測定魚肉中苯胺綠含量*

毛永強，劉艷，楊森，李娜

(遼寧工程技術大學 理學院，遼寧阜新，123000)

苯胺綠(aniline green，AG)別名堿性綠、鹽基塊綠、孔雀綠、維多利亞綠或中國綠，曾作為驅蟲劑和殺菌劑在水產養殖業中預防與治療魚的水霉病、鰓霉病等。但苯胺綠易在魚體內累積，可通過食物鏈進入人體，對人體具有致癌、致畸、致突變等毒副作用［1-2］，因此包括美國、日本、中國等在內的許多國家都將其列為禁用藥物。目前苯胺綠含量的檢測方法主要有紫外光譜法［3］、熒光光譜法［4］、液相色譜法［5］、液相色譜-質譜聯用法［6-7］、酶聯免疫吸附法［8］、化學傳感器［9］等，但這些方法過程復雜、操作耗時，難以普及推廣應用，因此建立一種成本低廉、快速檢測苯胺綠含量的方法具有重要現實意義。

近些年，熒光分光光度法因具有操作簡便、選擇性好、靈敏度高等優點而倍受關注，量子點(quantum dots，QDs)作為一種新型的熒光納米探針，彌補了傳統有機染料的一些缺陷，已經廣泛應用于致病菌［10-11］、生物毒素［12-13］、農藥殘留［14-15］、獸藥殘留［16-17］和重金屬［18-19］等食品安全檢測領域。

本文以巰基乙酸為穩定劑，采用水熱法制備CdTe量子點，基于苯胺綠對CdTe量子點熒光強度的猝滅作用，建立一種熒光分光光度法測定苯胺綠含量的新方法。該方法簡單快速、靈敏度高，已用于魚肉中苯胺綠含量的測定。同時對反應機理進行初步探討，發現苯胺綠與CdTe量子點構建熒光共振能量轉移體系所致。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

F-4500型熒光分光光度計(日本日立公司);UV-3010型紫外-可見分光光度計(日本日立公司);AUX320型電子分析天平(日本島津公司);pHS-3C型pH計(上海精密科學儀器有限公司);DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司);KQ-50DB型數控超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)，3-30K高速臺式冷凍離心機(德國西格瑪有限公司)。

苯胺綠(AG)，購于阿法埃莎化學有限公司;碲粉(Te)，天津市科密歐化學試劑開發中心;硼氫化鈉(NaBH4)，國藥集團化學試劑公司;巰基乙酸(TGA)，百靈威科技有限公司，氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)，天津市科密歐化學試劑開發中心;所用其他試劑均為分析純;實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 CdTe量子點的制備

采用水熱法制備巰基乙酸修飾的CdTe量子點［20］。準確稱取43 mg碲粉和80 mg NaBH4于10 mL比色管中，加入5 mL蒸餾水溶解后，通氮除氧10 min，磁力攪拌下反應至溶液澄清透明，生成NaHTe前驅體溶液。在250 mL三口燒瓶中加入0.285 g CdCl2，100 mL蒸餾水溶解后加入230 μL巰基乙酸溶液，用1 mol/L的NaOH溶液調節溶液pH值為11.0;在氮氣保護和劇烈攪拌條件下，加入新制備的NaHTe溶液，100℃加熱回流反應2 h，得到實驗所需的CdTe量子點。CdTe量子點濃度以溶液中Cd2+濃度計算。

1.3 測定方法

在5 mL比色管中，依次加入1.0 mL CdTe量子點溶液、3.0 mL pH值6.0的Tris-HCl緩沖溶液和一定量的苯胺綠溶液，蒸餾水定容到刻度，混勻。室溫下放置5 min后，在激發波長330 nm、發射波長518 nm條件下(激發和發射狹縫寬度均為5 nm)，測定體系的熒光強度F。以不加苯胺綠的溶液為空白，測定其熒光強度F0，計算體系熒光猝滅強度△F=F0-F。

2 結果與討論

2.1 CdTe量子點和苯胺綠作用的熒光光譜圖

在5.0 mL比色管中分別加入相同量的水溶液和苯胺綠溶液，同時加入CdTe量子點溶液和Tris-HCl緩沖溶液，反應一段時間后測定體系的熒光強度，考察CdTe量子點溶液加入苯胺綠溶液前后的熒光光譜性質(如圖1與圖2所示)。結果發現，CdTe量子點的激發光譜寬而連續，最大熒光發射峰位于513 nm。當CdTe量子點溶液中加入苯胺綠溶液后，CdTe量子點的熒光強度顯著降低;且隨著苯胺綠濃度的增加，CdTe量子點的熒光強度逐漸降低，但熒光發射峰位保持不變，這說明苯胺綠對CdTe量子點熒光強度具有很強的猝滅作用。

圖1 CdTe量子點的激發光譜(a)和發射光譜(b)Fig.1 Excitation spectrum(a)and emission spectrum(b)of CdTe QDs

圖2 不同濃度苯胺綠存在時CdTe量子點熒光光譜的變化Fig.2 Fluorescence emission spectrum of CdTe QDs in the presence AG with various concentrations，the concentration of AG from a to k:0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0(μmol/L);cCdTe=4.5 ×10-6mol/L;pH=6.0;t=5 min

2.2 反應介質及其pH值對體系熒光強度的影響

考察 Tris-HCl、Na2CO3-NaHCO3、檸檬酸-檸檬酸鈉等緩沖溶液對體系熒光猝滅強度的影響。結果發現，在Tris-HCl緩沖溶液中，體系熒光猝滅強度最大且穩定，因此實驗選擇Tris-HCl緩沖溶液調節體系的酸堿度。同時在5.0 mL比色管中加入CdTe量子點溶液和苯胺綠溶液，分別加入不同pH值Tris-HCl緩沖溶液，反應一段時間后測定體系的熒光強度，考察緩沖溶液pH值對體系熒光猝滅強度的影響(如圖3所示)。結果發現，當pH值在5.0～6.0內，體系熒光猝滅強度隨pH值升高而迅速增加;但當pH值大于6.0時，體系熒光猝滅強度逐漸降低。因此實驗選擇Tris-HCl緩沖溶液pH值為6.0。

圖3 pH值對體系熒光猝滅強度的影響Fig.3 Effect of pH value on fluorescence quenching intensity of CdTe QDs in the presence of AG cCdTe=4.5×10-6 mol/L;cAG=5.0 μmol/L;t=5 min

2.3 CdTe量子點濃度對體系熒光強度的影響

在5.0 mL比色管中分別加入不同濃度的CdTe量子點溶液，同時加入Tris-HCl緩沖溶液和苯胺綠溶液，反應一段時間后測定體系的熒光強度，考察CdTe量子點濃度對體系熒光猝滅強度的影響(圖4)。

圖4 CdTe濃度對體系熒光猝滅強度的影響Fig.4 Effect of CdTe concentration on fluorescence quenching intensity of CdTe QDs in the presence of AG cAG=5.0 μmol/L;pH=6.0;t=5 min

結果發現，隨著CdTe量子點濃度的增加，體系熒光猝滅強度逐漸增大，當增大到4.5×10-6mol/L時體系熒光猝滅強度達到最大值;繼續增加CdTe量子點濃度，體系熒光猝滅強度反而逐漸降低。因此實驗選擇CdTe量子點濃度為4.5×10-6mol/L。

2.4 反應時間對體系熒光強度的影響

在5.0 mL比色管中分別加入CdTe量子點溶液、Tris-HCl緩沖溶液和苯胺綠溶液，反應不同時間后測定體系的熒光強度，考察反應時間對體系熒光猝滅強度的影響(如圖5所示)。結果發現，當CdTe量子點溶液加入苯胺綠溶液后，體系熒光猝滅強度迅速增大，反應5 min后趨于穩定，且在25 min內保持不變。因此實驗選擇反應5 min后測定體系的熒光強度。

圖5 反應時間對體系熒光猝滅強度的影響Fig.5 Effect of time on fluorescence quenching intensity of CdTe QDs in the presence of AG cCdTe=3.5×10-6mol/L;cAG=5.0 μmol/L;pH=6.0

2.5 工作曲線、相關系數與檢出限

在最佳實驗條件下，在5.0 mL比色管中分別加入不同濃度的苯胺綠溶液，同時加入CdTe量子點溶液和Tris-HCl緩沖溶液，反應5 min后測定體系的熒光強度，以體系熒光猝滅強度(△F)對苯胺綠濃度(c)作圖(如圖6所示)。

圖6 標準曲線Fig.6 Standard curve

結果發現，苯胺綠濃度在1.0～10.0 μmol/L內與體系熒光猝滅強度呈良好的線性關系，線性回歸方程為△F=13.488c+0.295 5，相關系數r為0.999 3，檢出限為0.018 μmol/L。同時對5.0 μmol/L 的苯胺綠溶液進行11次平行測定，相對標準偏差為2.2%。

2.6 干擾實驗

在最佳實驗條件下，當苯胺綠濃度為1.0 μmol/L時，考察魚肉中常見物質對苯胺綠含量測定的影響。結果發現，在±5%相對誤差允許范圍內，500倍的 K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、NO3-、Cl-、L-精氨酸、L-賴氨酸、L-脯氨酸、L-半胱氨酸、L-甘氨酸、葡萄糖、VC、VE，幾乎對測定結果不造成干擾，表明該方法具有較好的選擇性。

2.7 樣品測定與回收率實驗

鯉魚、鯽魚、鰱魚、青魚、草魚等購自當地市場，經剖殺后去除頭、骨、內臟，取肌肉部分切成小塊狀，用電動絞肉機打成漿狀。分別稱取搗碎的鯉魚、鯽魚、鰱魚、青魚、草魚等魚肉樣品10.0 g于50 mL離心管中，加入5 mL乙腈，超聲水浴提取5 min，渦旋振蕩提取3 min，8 000 r/min轉速離心10 min后，上清液轉移至10 mL容量瓶中;用5 mL乙腈將殘渣按上述操作再提取1次，合并上清液，用乙腈定容，搖勻備用。用5 mL乙腈活化中性氧化鋁萃取柱，氮氣吹干;準確轉移提取液10 mL到中性氧化鋁萃取柱上，100 mL茄形瓶接收流出液;再用5 mL乙腈洗滌中性氧化鋁柱，收集全部流出液，于45℃旋轉蒸發至近干;殘渣用2 mL等體積比乙腈和5 mol/L乙酸銨混合溶液溶解，超聲振蕩清洗5 min，經0.22 μm有機相濾膜過濾，濾液供熒光測定。

吸取一定量待測液，按照實驗方法對10份魚肉樣品進行檢測，為考察該方法的可靠性，同時對其進行加標回收試驗(如表1所示)。結果發現，其中鯉魚、青魚2份樣品中檢出結晶紫，含量在3.7～4.2 nmol/kg，表明市售鮮魚存在濫用結晶紫的情況;同時魚肉樣品中苯胺綠的加標回收率在97.6%～103.2%，相對標準偏差均小于2.3%，表明該方法具有較好的準確度和精密度。

表1 魚肉樣品中苯胺綠含量測定與回收率實驗(n=6)Table 1 Analytical results of AG in fish muscle samples and recovery test(n=6)

2.8 反應機理探討

采用熒光光譜法和紫外可見吸收光譜法，考察CdTe量子點的熒光發射光譜和苯胺綠的紫外-可見吸收光譜(如圖7所示)。結果發現，CdTe量子點熒光發射峰位于513 nm處，而苯胺綠吸收光譜在616 nm處有最大吸收峰，且與CdTe量子點熒光發射光譜在450～600 nm內有相當程度的重疊;同時在pH值6.0條件下，巰基乙酸修飾的CdTe量子點表面帶負電荷，而苯胺綠是帶正電荷的三苯甲烷類陽離子染料，二者可通過靜電引力而結合，從而發生有效的熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)。因此當苯胺綠加入 CdTe量子點溶液后，苯胺綠能夠吸收CdTe量子點的熒光發射能量，導致CdTe量子點熒光強度逐漸降低，從而建立一種測定苯胺綠含量的熒光分析法。

圖7 CdTe量子點的熒光發射光譜(a)和苯胺綠的紫外-可見吸收光譜(b)Fig.7 Emission spectrum(a)of CdTe QDs and UV-Vis absorption spectrum(b)of AG

3 結論

采用水熱法制備巰基乙酸修飾的CdTe量子點，基于苯胺綠對CdTe量子點熒光強度的猝滅效應，建立一種熒光測定苯胺綠含量的新方法。該方法簡單快速、成本低廉、選擇性好、靈敏度高，能用于測定魚肉中苯胺綠含量，其回收率在97.6% ～103.2%，將為苯胺綠含量的快速檢測提供一種參考方法。

［1］ Aydo?an ?，Güllü ?.A study of the rectifying behaviour of aniline green-based Schottky diode［J］.Microelectronic Engineering，2010，87(2):187-191.

［2］ 何丹鳳，王麗敏，初洪濤，等.苯胺綠分子印跡聚合物制備條件對識別能力的影響［J］.化學工程師，2011(8):6-8.

［3］ Pourreza N，Elhami S.Spectrophtometric determination of malachite green in fish farming water samples after cloud point extraction using nonionic surfactant Triton X-100［J］.Analytica Chimica Acta，2007，596(1):62-65.

［4］ CHENG D，LI B X.Simple and sensitive fluorometric sensing of malachite green with native double-stranded calf thymus DNA as sensing material［J］.Talanta，2009，78(3):949-953.

［5］ Afkhami A，Moosavi R，Madrakian T.Preconcentration and spectrophotometric determination of low concentrations of malachite green and leuco-malachite green in water samples by high performance solid phase extraction using maghemite nanoparticles［J］.Talanta，2010，82(2):785-789.

［6］ Martínez Bueno M J，Herrera S，Uclés A，et al.Determination of malachite green residues in fish using molecularly imprinted solid-phase extraction followed by liquid chromatography-linear ion trap mass spectrometry［J］.Analytica Chimica Acta，2010，665(1):47-54.

［7］ TAO Y F，CHEN D M，CHAO X Q，et al.Simultaneous determination of malachite green，gentian violet and their leuco-metabolites in shrimp and salmon by liquid chromatography-tandem mass spectrometry with accelerated solvent extraction and auto solid-phase clean-up［J］.Food Control，2011，22(8):1 246-1 252.

［8］ SHEN Y D，DENG X F，XU Z L，et al.Simultaneous determination of malachite green，brilliant green and crystal violet in grass carp tissues by a broad-specificity indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay［J］.Analytica Chimica Acta，2011，707(1/2):148-154.

［9］ Lee S，CHOI J，CHEN L，et al.Fast and sensitive trace analysis of malachite green using a surface-enhanced Raman microfluidic sensor［J］.Analytica Chimica Acta，2007，590(2):139-144.

［10］ 宋月鵬，康杰，高東升，等.尖孢鐮刀菌碳化硅量子點標記及其長時程熒光成像［J］.農業工程學報，2013，29(17):286-292.

［11］ 王洪江，柳婷，謝躋，等.CdS量子點制備與單增李斯特菌抗體偶聯的研究［J］.分析化學，2010，38(5):632-637.

［12］ 李園園，李培武，張奇，等.量子點標記熒光免疫法檢測花生中黃曲霉毒素 B1［J］.中國油料作物學報，2012，34(4):438-442.

［13］ 楊淑平，金鑫，鄭佳，等.高性能CdTe/CdS核殼型量子點的制備及應用于小麥面粉中嘔吐毒素的熒光免疫檢測研究［J］.化學學報，2011，69(6):687-692.

［14］ 黃珊，馬建強，肖琦，等.油溶性CdSe量子點熒光探針直接檢測農藥水胺硫磷［J］.光譜學與光譜分析，2013，33(10):2 853-2 857.

［15］ LIANG H，SONG D D，GONG J M，et al.Signal-on electrochemiluminescence of biofunctional CdTe quantum dots for biosensing of organophosphate pesticides［J］.Biosensors and Bioelectronics，2014，53:363-369.

［16］ 徐銘澤，廖秀芬，陶慧林，等.基于CdS@ZnS量子點與羅丹明B能量轉移熒光猝滅法檢測牛奶中土霉素［J］.分析測試學報，2013，32(10):1 217-1 221.

［17］ Beloglazova N V，Speranskaya E S，WU A，et al.Novel multiplex fluorescent immunoassays based on quantum dot nanolabels for mycotoxins determination［J］.Biosensors and Bioelectronics，2014，62:59-65.

［18］ 胥月，湯純靜，黃宏，等.熒光碳量子點的綠色合成及高靈敏高選擇性檢測汞離子［J］.分析化學，2014，42(9):1 252-1 258.

［19］ ZHAO J N，DENG J H，YI Y H，et al.Label-free silicon quantum dots as fluorescent probe for selective and sensitive detection of copper ions［J］.Talanta，2014，125:372-377.

［20］ GE S H，LU J J，GE L，et al.Development of a novel deltamethrin sensor based on molecularly imprinted silica nanospheres embedded CdTe quantum dots［J］.Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2011，79(5):1 704-1 709.