高溫高壓提取甜菜廢粕多糖的工藝及其抗氧化性研究

趙亞紅，王文俠，張顯斌，尚慶，李長娟

(齊齊哈爾大學食品與生物工程學院黑龍江省普通高校農產品加工重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾，161006)

在甜菜制糖過程中，甜菜充分提取蔗糖后的菜絲稱為廢粕，甜菜廢粕是甜菜制糖的副產物。2011年我國甜菜總產量1 073.1萬t，占全球總產量的4.3%左右［1］。我國甜菜種植面積高達25萬hm2，主要分布在黑龍江、新疆、內蒙古等北方地區。每噸甜菜制糖后可得到大約0.15 t干渣，我國甜菜廢粕資源極其豐富。甜菜廢粕主要成分是碳水化合物，其中糖醛酸(果膠類)15.7%，中性非淀粉多糖29.1%，纖維素19.2%［2］。多糖除具有增稠性、膠凝性、乳化性等良好的功能性質［3］，還具有多種生理功能，對肥胖病、糖尿病、心血管病、腸道癌癥等疾病有預防和抑制作用，被廣泛應用于食品、醫藥、化工、紡織等行業［4-6］。目前我國國內各甜菜糖廠仍以傳統方法來處理甜菜粕，主要將甜菜粕經過干燥壓榨成小顆粒狀作為牲畜的粗飼料銷售，產品的附加值較低。甜菜渣中有豐富的果膠等非淀粉多糖，是較為理想的多糖生產原料。

常用的甜菜多糖提取方法有很多種，如水提法，酸法、堿法、酶法、超聲法，微波輔助法等［7-10］。水提法是提取多糖的傳統方法，雖然設備簡單，容易操作，適用范圍廣泛，但多糖的得率低，提取時間長。木質素是構成植物細胞壁的成分之一，具有使細胞相連的作用。由于有3%左右的木質素與甜菜細胞壁多糖緊密結合［1］，常壓水提法難以破壞木質素的骨架結構，影響多糖的提取。高壓作用可以破壞木質素與纖維素、半纖維素、果膠形成骨架結構，使甜菜粕中的多糖更易于溶出。

本文對甜菜粕多糖提取工藝條件進行研究，確定高壓法提取甜菜粕多糖的最佳工藝條件，并對甜菜廢粕粗多糖體外抗氧化進行了研究。

1 試劑與儀器

1.1 主要試劑

甜菜粕，博城北方糖業股份有限公司;半乳糖醛酸(生化試劑)，沃凱國藥集團化學試劑有限公司;系列標準葡聚糖，北京拜爾迪生物公司;阿魏酸(色譜純)，上海生工生物工程(上海)有限公司;其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

BFM-6BI型貝利微粉機，濟南倍力粉技術工程有限公司;LDZM-40KCS不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海申安器械廠;TDL-5-A臺式離心機，上海安亭有限公司;722S可見分光亮度計，上海精密科學儀器有限公司;RE-52AA型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠;N2000液相色譜儀，戴安中國有限公司;Heal Force超純水器，力康生物醫療科技控股有限公司。

2 實驗方法

2.1 總多糖測定及其得率計算

采用苯酚-硫酸法［13］測定多糖。

采用間羥基聯苯法［14］測定酸性糖。

總多糖計算:通常糖醛酸含量較低的多糖(中性多糖)樣品采用苯酚-硫酸法即可得到總糖含量。而對于糖醛酸含量較高的樣品，糖醛酸在苯酚試劑中雖然有顯色，但微弱，且在490nm也不是最大吸收，因此無法準確反映總糖的實際含量。由于采用間羥基聯苯法測糖醛酸含量不受中性糖的影響，首先測定糖醛酸含量，然后通過糖醛酸干擾回歸方程，計算糖醛酸對測定中性糖含量時的干擾值，將苯酚-硫酸法測定的多糖OD值減去糖醛酸干擾值，再通過回歸方程求得的糖含量即為樣品的多糖(中性糖)含量，與糖醛酸含量之和即可真實反映樣品的總多糖含量［22］。

其中:c，根據標準曲線得出的葡萄糖或半乳糖醛酸濃度，μg/mL;N，樣品稀釋倍數;V，原樣加水體積，mL;m，樣品質量，g。

總多糖得率的計算:

多糖得率/%=［提取總多糖質量(g)/甜菜粕質量(g)］×100

2.2 蛋白質含量測定

采用Folin-酚法［15］測定粗多糖中蛋白質的含量;

2.3 阿魏酸含量測定

(1)游離阿魏酸測定:經冷凍干燥后的樣品配制成10 mg/mL的溶液，0.45 μm濾膜過濾后進行HPLC分析。色譜條件:色譜柱為SunFireTMC185 μm(4.6 mm×150 mm Column)，柱溫25℃，流動相為V(甲醇)∶V(1% 乙酸)=40∶60，流速為 1.0 mL/min，進樣量20 μL，UV檢測器，檢測波長320 nm。

(2)結合阿魏酸測定:將樣液與0.5 mol/L的NaOH溶液按體積比1∶1混勻后，在暗處室溫下反應24 h，加入與樣液相同體積的0.5 mol/L的H3PO4終止反應。樣液過0.45 μm濾膜后進行HPLC分析。

2.4 多糖相對分子質量分布測定

采用高效液相色譜法測定甜菜粕多糖的相對分子質量分布。

色譜條件為:色譜柱:TSK-GEL G-6000PW xL column(7.8 mm×300 mm)與TSK-GEL G-3000PW xL column(7.8 mm×300 mm)串聯，泵:戴安N2000液相泵，檢測器:示差檢測器，柱溫為35℃，以純水為流動相，流速為0.6 mL/min。

首先將相對分子質量分別為4 000，20 000，50 000，100 000，1 000 000和2 000 000的標準葡聚糖相繼進樣，HPLC記錄各標準樣的保留時間，以保留時間為橫坐標，LgMr為縱坐標繪制標準曲線，求出回歸方程，然后將制得的粗糖樣配制成5 mg/mL，過0.45 μm膜，進樣量為20 μL，根據所得的保留時間，通過上述回歸方程計算出甜菜粕多糖的不同組分的相對分子質量分布。

2.5 多糖的體外抗氧化活性的測定

對DPPH自由基清除能力:采用比色法［17］測定。

對羥自由基清除能力:采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法［18］測定。

還原能力:采用鐵氰化鉀法［19］測定。

配制不同濃度的樣品溶液，以Vc為對照，對高溫高壓法提取的甜菜粕粗多糖進行體外抗氧化活性的測定。

2.6 工藝流程

甜菜粕→粉碎(過60目篩)→ 高溫高壓提取→冷卻，離心(5 000 r/min，10 min)→上清液，過濾→濾液→旋轉蒸發濃縮10倍→1∶4醇沉，靜置1 h→離心(5 000 r/min，10 min)，沉淀冷凍干燥→甜菜粕粗多糖

2.7 高溫高壓法提取甜菜廢粕中多糖的方法

取一定量甜菜廢粕粉，提取劑水按一定配比加入500 mL錐形瓶中，搖勻。用紗布封住錐形瓶口，放入不銹鋼壓力蒸汽滅菌器中。在設定的溫度、時間下提取菜廢粕多糖。冷卻，離心(5 000 r/min，10 min)，按濾液和乙醇1∶4的體積比加入無水乙醇，醇沉1 h后，離心(5 000 r/min，10 min)，棄去上清液，所得沉淀即為粗多糖。

2.8 高溫高壓法提取甜菜廢粕中多糖條件的優化

以多糖得率作為衡量指標，在單因素實驗的基礎上，采用正交實驗設計研究料液比、時間、溫度3個因素對多糖得率的影響，確定最優提取工藝條件。

2.9 數據分析

3 結果與分析

3.1 固液比對甜菜粕多糖得率的影響

分別按固液比(g∶mL)為1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35加入甜菜粕和水，在121℃下提取3 h。測定多糖含量，計算得率。實驗結果見圖1。

由圖1可知，隨著固液比升高多糖得率先降低后上升，當液料比為1∶30時后多糖得率最高。經單因素方差分析，固液比對多糖提取率影響顯著(P＜0.05)。因此，初步選擇固液比為1∶30。

圖1 固液比對甜菜粕多糖得率的影響Fig.1 Effects of the ratio of solid on polysaccharides yield

3.2 時間對甜菜粕多糖得率的影響

按液料比為1∶30(g∶mL)加入甜菜粕和水，在121 ℃下分別提取 1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 h。測定多糖含量，計算得率。實驗結果見圖2。

由圖2可知，提取時間從1 h增加到3 h時，多糖得率隨時間的增加而提高;當提取時間進一步增加至4 h時，提取率下降至17.81%，可能是因為提取出的多糖因為某些作用產生降解，導致多糖提取率降低。經單因素方差分析，提取時間量對多糖提取率影響顯著(P＜0.05)。在較高壓力作用下，細胞內容物與進入細胞內部的溶劑接觸，經過一段時間，有效成分溶于這些溶劑中，有效成分的溶解平衡在3 h左右即可完成。初步選定提取時間為3 h。

圖2 時間對甜菜粕多糖得率的影響Fig.2 Effects of time on polysaccharides yield

3.3 溫度對甜菜粕多糖得率的影響

按液料比為1∶30加入甜菜粕和水，分別在100，105，110，115，121，124 ℃條件下提取 3 h。測定多糖含量，計算得率。實驗結果見圖3。

圖3 溫度對甜菜粕總多糖得率的影響Fig.3 Effects of temperature on polysaccharides yield

由圖3可知，當溫度從100℃增加到121℃時，多糖得率隨著溫度的升高而增加，達到最高值;當溫度超過121℃后，多糖得率下降。經單因素方差分析，提取溫度對多糖提取率影響顯著(P＜0.05)。初步確定提取溫度為121℃。

3.4 正交優化試驗結果分析

為了優化高溫高壓法提取甜菜廢粕中多糖的工藝條件，在以上單因素實驗的基礎之上采用三因素進行L9(34)正交試驗，以確定最佳提取工藝條件。選用因素及水平見表1。正交試驗結果如表2所示。

表1 L9(34)正交因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(34)orthogonal

由表2可知，按照極差大小，三因素中影響多糖得率的主次順序為A＞C＞B，即時間＞固液比＞溫度。由表3方差分析可知，因素A顯著(P＜0.05)，B，C(P＞0.05)不顯著。最優組合為A3B1C2，即時間4h，溫度115℃，固液比1∶30。經驗證該條件下所得多糖的提取率達23.89%。故經優化實驗條件確定最佳工藝條件為:時間4 h，溫度115℃，固液比1∶30。

表2 正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal test on extraction conditions

表3 方差分析Table 3 Orthogonal test analysis of variance table

3.5 甜菜粕多糖的化學組成分析

從表4可以看出，高壓法提取的甜菜粕粗多糖主要含有中性糖和酸性糖，而酸性糖含量略高于中性糖，表明該粗多糖為弱酸性多糖，同時還含有少量的阿魏酸，蛋白質。

表4 甜菜粕多糖的主要化學組成Table 4 The majorcomponets of polysaccharides

3.6 甜菜粕多糖的相對分子質量分布測定

葡聚糖標準品在分子質量為4～2 000 kDa，LgMw-tR呈較好的線性關系，線性回歸方程為:y=-0.331 2x+14.367，R2=0.988 5。甜菜粕粗多糖和酸法提取的甜菜粕粗多糖［22］相對分子質量分布測定結果見圖4。

圖4 多糖的相對分子質量分布Fig.4 The molecular weight of polysaccharides

圖4-(a)為高溫高壓法提取甜菜粕粗多糖的分子質量分布。從左至右各部分分子質量約為337 224.41、33 484.53 及0.74 kDa

圖4-(b)為酸法提取的甜菜粕粗多糖的分子質量分布。從左至右各部分分子質量約為21 254.31及21.55 kDa

根據回歸方程計算出高溫高壓法提取的甜菜粕多糖的主要是相對分子質量為337 224.41、33 484.53 kDa(二者之和占多糖的比例為96.68%)和0.74 kDa(占多糖比例3.32%)。酸法提取的甜菜粕多糖的相對分子質量為21 254.31 kDa(占多糖比例65.71%)和21.55 kDa(占多糖比例34.29%)。高溫高壓法提取的甜菜粕多糖分子質量大于酸法提取的甜菜粕多糖分子量，可能原因是酸法提取的甜菜粕多糖在酸性條件下發生分解，使分子質量減小。

3.7 高溫高壓法提取甜菜粕粗多糖的體外抗氧化活性測定

甜菜粕粗多糖的體外抗氧化活性見圖5。

圖5 甜菜粕粗多糖的體外抗氧化活性Fig.5 The antioxidant activity of polysaccharide

以Vc為對照，比較高溫高壓法提取的甜菜粕粗多糖的體外抗氧化活性，結果分析見表5。

表5 甜菜粕粗多糖的體外抗氧化活性測定結果Table 5 Results ofthe antioxidant activity of polysaccharide

由圖5和表5可知，甜菜粕粗多糖對DPPH、羥自由基和還原能力都有一定的清除作用，并呈現良好的劑量依存關系。其中對DPPH清除能力最強，IC50=601.06 μg/mL，這可能是因為多糖中含有0.82%的阿魏酸，使其具有清除自由基的能力。但甜菜粕粗多糖對DPPH、羥自由基和還原能力的清除能力低于Vc。

4 結論

高溫高壓法提取甜菜粕多糖的最佳工藝條件為:固液比1∶30(g∶mL)，時間 4 h，溫度 115 ℃，該條件下，多糖得率為23.89%。高溫高壓法提取甜菜粕粗多糖對DPPH、羥自由基和還原能力都有一定的清除作用，并呈現良好的劑量依存關系。其中對DPPH清除能力最強，IC50=601.06 μg/mL。多糖含有30.54%的中性糖55.47%糖醛酸和0.82%的阿魏酸及少量的蛋白質。

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