綿陽雞屎藤中總黃酮的提取及含量測定

綿陽雞屎藤中總黃酮的提取及含量測定

劉曉燕，李 彬

(綿陽師范學院化學與化學工程學院，四川綿陽 621000)

摘要[目的]提取和測定綿陽雞屎藤中總黃酮的含量。[方法]采用正交設計試驗，通過醇提取法從雞屎藤中提取出黃酮類物質，對提取黃酮類物質進行驗證，用紫外可見分光光度法測定其含量。[結果]提取雞屎藤中總黃酮的最佳工藝條件：60%的乙醇條件下用1∶30的料液比浸泡12 h后在35 ℃的條件下用超聲波提取25 min，測得雞屎藤中總黃酮的含量為1.37%，平均回收率為91.25%～100.00%。[結論]雞屎藤葉中總黃酮含量大于雞屎藤莖中總黃酮含量。

關鍵詞雞屎藤；正交試驗法；總黃酮；提取；含量

中圖分類號S567

作者簡介劉曉燕(1965- )，女，四川德陽人，副教授，從事無機化學和環境化學研究。

收稿日期2015-06-03

Extraction and Determination of Total Flavonoids in Mianyang Chicken Excrement

LIU Xiao-yan, LI Bin(School of Chemistry and Chemical Engineering, Mianyang Normal University, Mianyang, Sichuan 621000)

Abstract[Objective] The flavonoids in the chicken excrement cane were extracted and characterized. [Method] Using orthogonal test, total flavonoids were extracted from chicken excrement cane with alcohol extraction method and the contents were determined with UV spectrophotometry. [Result] The results of orthogonal experimental indicate the optimum conditions is as follows: the optimum solvent is ethanol, the ratio of material to liquid is 1∶30, the optimum soaking time is 12 h, the optimum temperature is 35 ℃, the optimum ultrasonic extraction is 25 min. The results indicate the content of total flavonoids in chicken excrement cane is 1.37%, the average recovery is 91.25%-100.00%. [Conclusion] The content of total flavonoids in the leaves of the chicken excrement cane is more than in its root.

Key wordsChicken excrement rattan; The orthogonal test; Total flavanone; Extraction; Content

雞屎藤屬于茜草科，這種植物有一種腥腥的味道如雞屎，是我國常見的藥用植物，廣泛地分布在全國各地，常生長于氣候溫熱、肥沃、深厚、濕潤的砂質壤土的溪邊、河邊、路邊、林旁及灌木叢中，也常攀援在其他植物或巖石上，有極強的生命力，環境耐受能力極強[1-3]。因雞屎藤化學成分比較復雜，且含有一定量的黃酮類化合物，所以它有多種藥理作用[4-6]。如有較強的抗腫瘤作用，顯著的消炎、抗菌、鎮痛作用。此外，雞屎藤水煎液對氧自由基有顯著的清除作用。很多病理生理如炎癥、腫瘤、衰老及腦缺血等均與氧自由基過多有密切聯系。

對于植物提取物中總黃酮含量測定[7-14]，常采用紫外分光光度法、高效液相色譜(HPLC)法、一階導數分光光度法和熒光法等。紫外分光光度法是測定總黃酮最常用的方法，該方法以亞硝酸鈉-硝酸鋁為顯色劑，充分利用它們與黃酮類物質生成的紅色螯合物的這一特征，在510 nm處測定其吸光度，并以蘆丁為標準品進行對照，從而得到中草藥中總黃酮含量。有關雞屎藤的化學成分和營養成分的測定已經有文獻報道，但對綿陽雞屎藤黃酮含量的測定尚未見報道。筆者在此采用簡單易行的紫外可見分光光度法測定其總黃酮含量，為開發、利用綿陽雞屎藤藥用提供有用的信息。

1材料與方法

1.1儀器101-2A型恒溫干燥箱(上海滬南電爐烘箱廠)；KQ-300E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；T6新世紀紫外分光光度儀(北京普析通用儀器有限責任公司)；微型高速萬能試樣粉粹機(湖北省黃驊新興電器廠)；SHD-2000型循環水式多用真空泵(河南鞏義市英予華儀器廠)。

1.2試劑雞屎藤草(6月采自綿陽游仙區)；蘆丁標準品(中國藥品生物制品檢定所)；95%乙醇、無水乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、石油醚，均為AR，成都市科龍化工試劑廠。

1.3試驗方法 摘新鮮雞屎藤莖、葉(綿陽市游仙區)→陽光下晾曬備用→莖、葉分離→莖、葉烘干(60 ℃)→粉碎→稱量→溶劑浸泡12 h(乙醇濃度、料比)→超聲波處理(溫度、時間)→減壓抽濾→石油醚萃取→濃縮定容→稀釋→測定吸光度值→計算雞屎藤中總黃酮含量。

1.3.1蘆丁標準溶液的配制。準確稱取10 mg蘆丁標準樣品到25 ml小燒杯中，加入少量的30%乙醇溶液，使標準樣品部分的溶解，將溶解的樣液轉至100 ml容量瓶中，繼續加入少量的30%乙醇溶液使小燒杯中的固體樣品全部溶解，轉入100 ml的容量瓶中，進行旋搖使其充分溶解，直至容量瓶中溶液完全澄清。加30%乙醇溶液定容至100 ml，即得到0.1 g/L的蘆丁標準溶液。

1.3.2建立標準曲線。分別吸取“1.3.1”蘆丁標準溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5于25 ml比色管中，加入0.7 ml 5%亞硝酸鈉溶液混合均勻，靜置7 min后再加入0.7 ml 10%硝酸鋁溶液混合均勻并靜置7 min后，繼續加入5 ml 1 mol/L的氫氧化鈉溶液，搖勻后用30%乙醇溶液定容至刻度線，再充分搖勻，靜置15 min，用紫外分光光度儀在波長為510 nm處比色測定出各樣品溶液的吸光度，試劑空白為參比液，在平行處理的條件下測定3次，求其平均值。

1.3.3正交試驗設計。 以提取溶劑系統即乙醇濃度、溶劑系統的料液比、超聲波處理溫度、超聲波處理時間作為影響提取物雞屎藤中總黃酮含量的4個主要因素，乙醇濃度取4個水平，溶劑系統的料液比、超聲波處理溫度、超聲波處理時間分別取3個水平，選用L943正交試驗表安排試驗，共108組，其中乙醇濃度為95%、80%、60%、0%，料液比為1∶10、1∶20、1∶30，超聲波處理時溫度為25、30、35 ℃，超聲波處理時間為15、25、35 min；超聲波處理功率100 W。稱取粉碎后的雞屎藤莖、葉各2 g，加入4種不同的溶劑系統、3種不同系統的料液比，平行操作條件下，在常溫下密封靜置浸泡12 h，分別在25、30、35 ℃不同溫度下進行15、25、35 min不同時間的超聲波處理，使其更加充分地提取出雞屎藤中的總黃酮，減壓抽濾后，用少量的石油醚萃取3次，萃取液在恒溫水箱中濃縮至20～40 ml后，在室溫下冷卻，冷卻后轉移至50 ml的容量瓶，用30%乙醇溶液定容至50 ml，再移取1 ml待測液于25 ml比色管中，加入0.7 ml 5%亞硝酸鈉混合均勻，靜置7 min后加入0.7 ml 10%硝酸鋁混合均勻并靜置7 min后，再加入5 ml 1 mol/L的氫氧化鈉，搖勻并用30%乙醇溶液定容至刻度后，充分搖勻后，靜置15 min，用紫外可見分光光度儀在波長為510 nm處比色測定出各待測溶液的吸光度，試劑空白為參比液，在平行處理的條件下測定3次，求其平均值，并計算總黃酮的含量。

2結果與分析

2.1蘆丁標準曲線的建立以蘆丁樣品溶液作為橫坐標、吸光度作為縱坐標，繪制出標準曲線(圖1)。用最小二乘法進行線性回歸分析得出標準回歸方程為Y=12.543X+0.000 3(R2=0.999 9)。

2.2正交試驗

2.2.1溶劑系統的優化。雞屎藤中有效成分的提取常用乙醇、水等溶劑，不同溶劑對雞屎藤有效成分的提取有較大影響，由圖2可知，60%的乙醇水溶液對提取雞屎藤中總黃酮效果最佳，用乙醇溶劑不僅可以提取出黃酮苷元還可以提取黃酮苷，提取的產率更高；而用水作提取液，過濾十分的緩慢，對試驗有較大的影響。

2.2.2料液比的優化。在正交設計試驗條件下，通過改變不同料液比來提取雞屎藤中總黃酮含量的分析，從圖3可看出，在1∶10、1∶20、1∶30的料液體條件下，提取雞屎藤中總黃酮含量最佳料液比為1∶30。

2.2.3超聲溫度的優化。在正交設計試驗的條件下，通過對超聲溫度的控制，超聲波在25、30、35 ℃的條件下，經過35 ℃處理后雞屎藤提取液總黃酮含量高(圖4)，由此可以得出提取雞屎藤中總黃酮含量超聲波溫度在35 ℃下效果最佳。

2.2.4超聲時間的優化。在試驗優化的條件下，以最佳溶劑60%乙醇、最佳料液比1∶30、最佳超聲溫度35 ℃的條件下，平行測定出稀釋溶液的吸光度，根據試驗稀釋倍數計算出體積濃度，從圖5可以得出，超聲波最佳時間為25min。

2.3提取物的分析

2.3.1提取物的定性分析。

2.3.1.1紫外可見分光光譜分析。黃酮類的化合物大部分均具有C6-C3-C6的基本結構，在240～400nm紫外光譜下大多數黃酮類化合物具有2個吸收峰，在320～380nm光譜帶Ⅰ是由B環取代基性質決定，240～270nm光譜帶Ⅱ是由環取代基性質決定的。蘆丁標準溶液在經過加入亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉顯色處理后帶Ⅰ和帶Ⅱ轉移至450～510和415～470nm處，而在510nm左右所提取的樣品圖譜(圖6b)的吸收峰與蘆丁標準溶液圖譜(圖6a)相似。

2.3.1.2顯色反應。黃酮類化合物的基本碳架上常含有堿性氧原子，它的絕大多數均帶有酚羥基的衍生物，因此能夠與金屬離子發生絡合反應和與較強的還原性試劑發生顏色反應。根據黃酮類化合物的這些特性可以對樣品進行定性鑒定，結果表明雞屎藤里含有黃酮類物質(表1)。

2.3.2雞屎藤莖、葉中總黃酮含量測定。在試驗優化的條件下，以最佳溶劑60%乙醇、最佳料液比1∶30、最佳超聲溫度35 ℃、最佳超聲波時間25min的條件下，平行測定出稀釋溶液的吸光度，根據試驗稀釋倍數計算出體積濃度。從表2～3可看出，雞屎藤葉中的總黃酮含量大于雞屎藤莖中的總黃酮含量。

表1　樣品顏色反應現象

表2　最佳條件下雞屎藤葉中總黃酮含量

表3　最佳條件下雞屎藤莖中總黃酮含量

2.3.3加標回收試驗。分別取處理過的樣品(雞屎藤莖和葉)各一份，并加入一定量蘆丁標準溶液，按“2.3.2”樣品測定步驟進行回收試驗。結果表明(表4～5)，雞屎藤莖的平均回收率為91.25%～100.00%，雞屎藤葉為95%～100%，RSD分別為3.7%、2.0%。說明這種方法測定雞屎藤莖和葉中的黃酮含量準確可靠，也符合定量分析要求。

表4　雞屎藤莖的加標回收

3結論

通過正交試驗采用超聲波輔助醇提取法從雞屎藤中提取黃酮類物質，得出醇提取雞屎藤中黃酮類化合物最佳試驗條件，根據最佳試驗條件提取雞屎藤中黃酮類物質，對所提取的黃酮類物質進行光譜掃描、顯色反應等表征，用紫外分光光度法測定其含量。結果表明，提取雞屎藤總黃酮的最佳試驗條件：60%乙醇在1∶30的料液比下溫度為35 ℃的超聲波下提取25min，測得雞屎藤中總黃酮的含量為1.37%，平均回收率為91.25%～100.00%。總之，超聲波輔助醇提取

表5　雞屎藤葉的加標回收

法是一種全物理的方法，成本低、高效、無任何污染，是一條理想的提取黃酮類物質的途徑，為雞屎藤的利用和開發提供一定的參考。

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