加味二陳湯對ApoE-/-小鼠炎癥標志物IL-6和 TNF-α的調節作用

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(湖南中醫藥大學仲景學說教研室，湖南 長沙 410208))

加味二陳湯對ApoE-/-小鼠炎癥標志物IL-6和TNF-α的調節作用

謝雪姣1，李亞梅，徐佳，廖端芳*，吳若霞，尹棟梁，陳聰伶

(湖南中醫藥大學仲景學說教研室，湖南 長沙 410208))

目的研究加味二陳湯對ApoE-/-小鼠血清、主動脈壁及瓣膜的IL-6、TNF-α表達的影響。方法40只ApoE-/-小鼠中10只為空白對照組，30只以高脂飼喂養4周構建動脈粥樣硬化(As)小鼠模型，均分成模型組、辛伐他汀組、加味二陳湯組，分別用生理鹽水、辛伐他汀及加味二陳湯對小鼠灌胃給藥，8周后處死小鼠，Elisa法檢測血清中IL-6、TNF-α的含量；免疫組化法檢測IL-6、TNF-α在主動脈壁及瓣膜的表達。結果辛伐他汀組血清IL-6和TNF-α分別為392.06±37.70 pg/mL、189.1±50.4 pg/mL，與模型組相比表達下降(P<0.05)；加味二陳湯組血清IL-6、TNF-α分別為442.41±172.26 pg/mL、47.2±13.3 pg/mL，與模型組相比表達下降(P<0.05)，與辛伐他汀組相比，表達下降(P<0.05)；免疫組化結果顯示加味二陳湯可降低IL-6、TNF-α在主動脈壁內的表達。結論加味二陳湯可降低血清和主動脈壁及瓣膜的IL-6、TNF-α的表達。

加味二陳湯； 動脈粥樣硬化； TNF-α； IL-6

動脈粥樣硬化(atherosc1erosis，As)是嚴重危害人類健康的常見疾病之一，是冠心病、腦血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心腦血管病的主要病理基礎[1],2010年全球死于缺血性心臟病和中風的人數約為1.29億人,且每4個死者中就有1個死于心血管疾病[2]。而我國每年在心血管疾病方面所花費的醫療費用及勞動力損失總約2000億元[3]。他汀類藥物的問世及心臟塔橋手術給冠心病患者帶來了福音，但卻有著不可避免的弊端，中醫藥在改善冠心病患者癥狀及提高生存率方面發揮著重要的作用。已有研究表明二陳湯可顯著降低血中膽固醇、甘油三脂以及低密度脂蛋白的含量[4],而本文研究亦表明加味二陳湯可顯著降低小鼠血清中血清總膽固醇(TCHOL)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平(P<0.01)，但加味二陳湯對冠狀動脈粥樣硬化性心臟病“前炎癥細胞因子”IL-6及TNF-α表達的影響尚未見報道。

1 材料與方法

1,1實驗動物7～8周齡雄性ApoE基因敲除小鼠 44 只，品系為C57BL/6J，體重 19～21 g，來自北京大學醫學部實驗動物中心由美國Jackson實驗室引進、繁育[SCXK(京)：2011-0012][5]。實驗操作在湖南中醫藥大學SPF級動物中心進行【SYXK(湘)：2013-0005】。實驗過程中按照實驗動物3R原則給予人道關懷。

1.1.2 受試藥物 加味二陳湯由茯苓15 g、陳皮10 g、法半夏10 g、甘草6 g、荷葉10 g、山楂15 g、刺五加10 g由湖南中醫藥大學中藥鑒定教研室主任劉塔斯教授鑒定，加水煎煮30 min后趁熱過濾，濃縮至生藥0.5 g生藥/mL，制得煎液。高脂飼料由湖南中醫藥大學實驗動物中心加工制作，配方為豬油5%、膽固醇1%、普通飼料94%。小鼠用墊料由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。

1.1.3 主要試劑 Mouse IL-6 ELISA試劑盒(RD公司，產品編號 EIA05846)，Mouse TNF-α ELISA試劑盒(RD公司，產品編號 EIA05897)，O·C·T compound Tissue-Tek(SaKura Finetek USA,order number 4583)，羊抗兔辣根過氧化物酶標記二抗(PV-6001，北京中杉金橋)，兔源TNF-α抗體(ab9739，abcam公司)，兔源IL-6抗體(ab6672，abcam公司)，DAB試劑盒(753223A，北京中杉金橋)，其他試劑均為國產分析純。

1.1.4 主要儀器 LEICA DM LB2型雙目顯微鏡(德國LEICA公司)，Motic B5型顯微攝像系統(麥克奧迪實業集團公司)，ELISA檢測儀器(基因有限公司，型號biotek-ELX800 )。

1.2實驗方法

1.2.1動物模型的建立及給藥 44只ApoE-/-小鼠先給與適應性喂養1周，后隨機抽取小鼠10只，作為空白對照組(n=10)，給與普通飼料喂養；30只給與高脂飼料(含5%的豬油、1%的膽固醇)喂養，自由飲水，進行造模；余下4只為造模檢驗小鼠，分別與兩組予相同喂養(各2只)。喂養4周后，將造模檢驗小鼠(類空白對照組2只，類模型組2只)，檢測小鼠血脂水平、對小鼠心臟主動脈及主動脈瓣行油紅O染色，綜合分析用于檢驗AS模型是否已制備成功。再將造模組小鼠按小鼠體重采用隨機分組方法將動物分為3組，模型組、加味二陳湯組、辛伐他汀組各10只。

模型組小鼠與空白對照組均給予生理鹽水灌胃，灌胃量與后面用藥組相同，灌胃體積均為每天20 mL/kg。辛伐他汀組小鼠給予辛伐他汀每天3 mg/kg[5]灌胃，加味二陳湯組小鼠給予其浸膏按生藥量每天2.2 g/kg灌胃，配制藥液的溶劑均為生理鹽水。

1.2.2 取材及實驗室檢測 各組動物連續灌胃8周，再與12 h不禁水禁食處理，首先經眼眶靜脈叢取血，將血液靜置2 h后，離心5 min(4 000 rpm)，取上清液即血清，在-20 ℃冰箱中保存，用于IL-6、TNF-α的檢測。用4%多聚甲醛從小鼠左心室灌流30 min，剝離主動脈，將其在常溫條件下保存在4%多聚甲醛中。心臟在4%多聚甲醛中常溫保存24 h，取出以OCT compound包埋，保存在-20 ℃冰箱中，將用于冰凍切片。

1.2.3 小鼠血清IL-6、TNF-α含量的檢測 檢測血清中IL-6、TNF-α的含量，方法按ELISA試劑盒說明書操作。

1.2.4 小鼠主動脈內IL-6、TNF-α表達 冰箱中取出主動脈切片，予以脫蠟，在室溫下采用3%H2O2孵育10 min；先以蒸餾水沖洗，再用PBS洗2次(各5 min)；洗后浸入PBS緩沖液中，微波爐加熱10 min，使液體溫度保持在95℃左右，拿出在室溫中冷卻15 min；予以5%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，在室溫中孵育10 min；除去血清，直接加稀釋后的一抗(IL-6稀釋比例為1∶40；TNF-α稀釋比例為1∶400)，孵育2 h(37℃)；使用PBS洗5 min×3次；滴加PV-6001二抗，孵育30 min(37℃)；再PBS洗5 min×3次；采用DAB顯色2 min；拿出后用自來水充分沖洗，以蘇木精復染，用水洗晾干，給予中性樹膠封片后采集圖像，供后期分析。

1.2.5 免疫組化法檢測IL-6在小鼠主動脈瓣的表達 取小鼠心臟主動脈瓣冰凍切片，放置在60 ℃烘箱中烤30 min，取出來，進行免疫組織化學實驗。按試劑盒說明書操作，檢測IL-6在小鼠主動脈瓣的表達。

2 結 果

2.1加味二陳湯對ApoE-/-小鼠血清IL-6、TNF-α表達的影響由表1可見，模型組血清IL-6和TNF-α的表達與空白對照組相比顯著上升(P<0.01)。與模型組相比，辛伐他汀組血清IL-6和TNF-α表達明顯下降(P<0.01)；加味二陳湯組血清IL-6、TNF-α表達下降；其中TNF-α的表達下降顯著(P<0.01)。

表1加味二陳湯對ApoE-/-小鼠血清IL-6、TNF-α表達的影響

組別nTNF?α(pg/mL)IL?6(pg/mL)空白對照組1054．6±22．3b313．38±121．15b模型組10503．1±95．3a711．18±97．17a辛伐他汀組10189．1±50．4ab392．06±37．70b加味二陳湯組1047．2±13．3bc442．41±172．26bd

與空白對照組相比，a：P<0.05；與模型組相比，b：P<0.05；與辛伐他汀組相比，c：P<0.01，d：P<0.05

2.2加味二陳湯對ApoE-/-小鼠主動脈內IL-6、TNF-α表達的影響主動脈免疫組化結果表明(見圖1、圖2)，空白對照組小鼠主動脈大致無IL-6、TNF-α的陽性表達(黃褐色顆粒物)；模型組小鼠主動脈內IL-6、TNF-α的陽性表達(黃褐色顆粒物)顯著高于空白對照組，而辛伐他汀組、加味二陳湯組主動脈斑塊內IL-6、TNF-α的陽性表達明顯低于模型組。

圖1 ApoE-/-小鼠主動脈TNF-α免疫組化結果(40×) A：空白對照組；B：模型組 ；C：辛伐他汀組； D：加味二陳湯組

圖2 ApoE-/-小鼠主動脈IL-6免疫組化結果(40×) A：空白對照組；B：模型組 ；C：辛伐他汀組； D：加味二陳湯組

2.3加味二陳湯對ApoE-/-小鼠主動脈瓣IL-6表達的影響免疫組化檢測研究顯示，模型組與空白對照組相比，其主動脈瓣斑塊上棕黃顆粒明顯增多。辛伐他汀組和加味二陳湯組較模型組相比，其小鼠主動脈瓣棕黃色顆粒均顯著減少。圖中棕黃色顆粒是IL-6的陽性表達。見圖3。

3 討 論

圖3 各組小鼠主動脈瓣IL-6免疫組化染色病理切片(40×)

迄今為止，As的發病機制存在多種學說，尚未完全清楚，涉及多種危險因素，大量的臨床和基礎研究表明，其危險因素包括高血壓、高脂血癥、高血糖、高半胱氨酸血癥、高纖維蛋白原血癥、高尿酸血癥、腎素—血管緊張素—醛固酮系統(RAAS)活化、肥胖、吸煙、慢性應激等，而As發病機制的學說也眾多，公認的有脂質浸潤學說(脂源性學說)、損傷反應學說、潴留反應學說(潴留一應答學說)、炎癥學說、血小板功能亢進學說、血管平滑肌細胞克隆學說、氧化應激學說、血栓形成學說、免疫功能異常學說、Ca 超負荷學說等[7-8]。在這眾多學說中，炎癥機制學說是相對新的一種學說。眾多的研究提示炎癥反應與As的發生發展具有直接關系,可見動脈粥樣硬化是一種慢性持續性炎癥反應性疾病的觀點由美國華盛頓大學醫學院ROSS教授提出后獲得廣泛認同[9-14]。

研究表明[15]，上述As的多種危險因素如吸煙、高血脂等均可促氧化應激反應，從而導致血管內皮細胞(Endothelial cell，EC)損傷，內皮受損，激活的巨噬細胞分泌IL-6，通過細胞信號轉導IL-6可促使炎癥介質、細胞因子的基因轉錄增加，使中膜平滑肌細胞增殖并發生表型轉化。在此同時釋放更多炎癥介質，使更多單核細胞聚集、浸潤，從而導致動脈粥樣斑塊形成。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種多功能的炎性細胞因子,主要由激活的單核細胞、淋巴細胞分泌，參與炎癥反應，促進As的發展[16]。TNF-α還通過直接的細胞毒性作用，致使中性粒細胞脫顆粒、氧化代謝，破壞內皮細胞結構和功能的完整性[17]；并且可促進IL-6的分泌，參與血管平滑肌細胞增殖、分化和調控，從而促使血管壁增厚，官腔狹窄；此外還刺激內皮細胞激活血小板激活因子，導致損傷部位的血栓形成，加速動脈粥樣硬化進程。隊列研究證實[18]血清中的IL-6、TNF-α及CRP含量指標高的人群發生冠心病等老年性疾病的概率明顯增加，其中IL-6、TNF-α預測急性事件的價值要高于CRP。因此，IL-6和TNF-α作為炎癥標志物，檢測血清IL-6、TNF-α表達水平成為預測心腦血管事件的重要指標，若能降低其活性和表達水平將有利于控制As進程。

二陳湯是中醫藥常用的基礎方，出自宋代《太平惠民和劑局方》，因方中半夏、橘紅以陳久者良而命名為“二陳”，為祛痰的通用方劑。加味二陳湯乃二陳湯去烏梅、生姜，加荷葉、山楂、刺五加組成，方中以法夏為君，取其辛溫性燥，善能燥濕化痰，且又降逆和胃。以陳皮為臣，理氣燥濕祛痰，燥濕以助半夏化痰之力，理氣可使氣順則痰消。痰由濕生，濕自脾來，故佐以茯苓健脾滲濕，俾濕去脾旺，痰無由生；去掉降逆之生姜、酸收之烏梅，加自古奉為瘦身的良藥荷葉利尿通便、涼血消脂，山楂消食健胃、行氣散瘀，刺五加補肝滋腎；活血通脈，使痰濕解而不傷脾陽；以甘草為使藥，調和藥性而兼潤肺和中。諸藥合用，標本兼顧，燥濕化痰，行氣消脂，活血通脈。筆者臨床將其辨證論治用之于單純性肥胖、高脂血癥、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等疾病證屬痰濕郁結者，屢收奇效[19]。

本課題組前期研究顯示[20]，加味二陳湯與模型組相比，其血清TCHOL、LDL-C均明顯降低(P<0.05)；對小鼠主動脈行油紅O大體染色，可見加味二陳湯組小鼠主動脈弓和主動脈干管腔內脂質沉積斑塊均明顯少于模型組，減少ApoE-/-小鼠肝臟脂質沉積，說明加味二陳湯具有明顯的降脂消斑功效。也有研究表明冠心病血瘀證和痰熱證患者其白細胞計數、C-反應蛋白含量、TNF-α和IL-6含量均升高，表明中醫學之“痰”、 “瘀”與炎癥因子密切相關[21]，并得到諸多驗證[22-24]。而本實驗表明，模型組血清IL-6、TNF-α水平明顯高于空白對照組(P<0.01)，這結果也證實了血清IL-6和TNF-α升高成為冠心病重要病理因素之一。而加味二陳湯可明顯下調血清中IL-6、TNF-α的表達(P<0.05)；降低IL-6、TNF-α在主動脈內的表達，這為加味二陳湯辨證論治冠狀動脈粥樣硬化性心臟病和進一步深入研究提供了依據和基礎。

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TheEffectsofModified“ErchenDecoction”ontheExpressionofInflammatoryMarkerIL-6，TNF-αonApoE-/-Mice

XIE Xuejiao,LI Yamei,XU Jia,et al

(HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha,Hunan410208,China)

ObjectiveThis study was to investigate the effects of Modified Erchen Decoction on the expression of IL-6，TNF-α in the aortic wall and serum of ApoE-/-mice，in order to confirm the effect on the regulation of inflammatory factors in atherosclerosis.MethodsApoE-/-mice of the control group (n=10) were fed with normal diet,the others (n=30) were fed with a high-cholesterol diet in 4 weeks to induce atherosclerosis mode,and then were divided into the model group (n=10),the Modified Erchen Decoction group (n=10) and the simvastatin group (n=10).The two treatment groups were given Modified Erchen Decoction and simvastatin by gavage respectively.The expression of IL-6 and TNF-α was measured by ELISA kit after treated with the drugs for 8 weeks continuously.ResultsIL-6 and TNF-α in serum were 392.06±37.70 pg/mL and 189.1±50.4 pg/mL in the simvastatin group and were 47.2±13.3 pg/mL and 442.41±172.26 pg/mL in the Modified Erchen Decoction group respectively.They were decreased by the two drugs,and significant difference was found between each treatment group and the control group.The expression of IL-6 and TNF-α were decreased by the two drugs,which were confirmed by the histopathology.ConclusionModified Erchen Decoction can inhibit the expression of IL-6 and TNF-α effectively in the ApoE-/-mice,which indicates that Chinese formula may reduce atherosclerosis progress.

Modified Erchen Decoction; atherosclerosis; TNF-α; IL-6

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.06.002

2015-08-25；

2015-10-30

全國第五批老中醫藥專家學術經驗繼承項目，湖南省教育廳科研青年項目(編號11B092);湖南省中醫藥科研計劃項目(編號201236);湖南省自然基金項目(編號：2015JJ6076);湖南省中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地資助

*通訊作者，E-mail：dfliao66@aliyun.com.

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(此文編輯：蔣湘蓮)