青錢柳多糖的乙酰化修飾及抗氧化活性

王之珺，張柳婧，鐘瑩霞，闞麗嬌，謝建華，謝明勇

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

青錢柳多糖的乙酰化修飾及抗氧化活性

王之珺，張柳婧，鐘瑩霞，闞麗嬌，謝建華*，謝明勇

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

以青錢柳多糖為原料，使用乙酸酐法制備得到乙酰化青錢柳多糖樣品。以乙酰化多糖取代度為評價指標，采用正交試驗考察乙酸酐-多糖比例、反應時間、反應溫度對乙酰化修飾的影響。在此基礎上，選擇取代度為0.681的乙酰化多糖樣品進行1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除實驗。結果表明，青錢柳多糖乙酰化最優反應條件為：m（多糖）∶V（乙酸酐）＝1∶60、反應時間2 h、反應溫度40 ℃，同時，乙酰化修飾可以顯著提高青錢柳多糖的DPPH自由基清除活性，乙酰化修飾可作為青錢柳多糖改性的方法之一，為青錢柳資源的進一步開發利用提供新的方向。

青錢柳；多糖；乙酰化修飾；抗氧化

青錢柳（Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinskaja）是我國特有的胡桃科青錢柳屬植物，又被稱為青錢李、搖錢樹。青錢柳的活性成分主要包括：多糖、黃酮、氨基酸和三萜類化合物等[1]。青錢柳多糖是提取自青錢柳葉片中的一種雜多糖，主要由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、鼠李糖等單糖組成[2]，并具有抗氧化[3]、降血糖[4]、免疫調節以及抗腫瘤[5]等多種生物活性。由于其出色的保健效果，目前青錢柳已被開發成多種功能性茶飲料。

多糖是一類由10 個以上單糖聚合而成的大分子物質，又被稱作多聚糖[6]。近年來，隨著乙酰基與活性多糖構效關系的研究不斷深入，乙酰化修飾逐漸成為一種對多糖進行結構修飾的有效方法。許多研究表明經乙酰化修飾后的多糖，其抗氧化[7]和免疫調節活性[8]可以得到顯著提高。本實驗以江西修水青錢柳為原料，利用水提醇沉法提取、Sevag法脫蛋白以得到精制多糖，使用乙酸酐法對多糖進行乙酰化修飾，采用正交試驗優化青錢柳多糖乙酰化的最優條件，并利用有機自由基（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH））體系評價乙酰化修飾對多糖體外抗氧化活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青錢柳，由江西神茶實業有限公司提供。

DPPH 美國Sigma公司；抗壞血酸 美國Aladdin試劑有限公司；無水乙醇、乙酸酐 國藥集團化學試劑有限公司；正丁醇、三氯甲烷、氫氧化鈉、濃鹽酸等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；ALPHA1-2冷凍干燥機 德國Martin Christ公司；SHZ-82A恒溫水浴搖床 常州恒隆儀器有限公司；EYELA N-1001旋轉蒸發儀 東京理化器械株式會社；TGL-5-A離心機 上海飛鴿系列離心機廠；TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；PB-10 pH計 德國Sartorius 公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；AL-104 型電子天平 上海梅特勒-托利多儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 青錢柳精制多糖的制備

采用熱水浸提法提取青錢柳多糖[9]。稱取800 g干燥的青錢柳葉片粉末，按照1∶10（m/V）加入8 000 mL體積分數為95%的乙醇，浸泡過夜，除去脂質、單糖、色素等小分子物質。過濾后，揮干乙醇，收集殘渣，在料液比1∶8（m/V）的條件下，將青錢柳置于80 ℃水浴浸提120 min。浸提后過濾，收集濾液，濾渣繼續水浴浸提。反復對濾渣進行兩次浸提后合并所有濾液，置于旋轉蒸發儀中真空濃縮后保存備用。采用Sevag法進行脫蛋白，按照V（正丁醇）∶V（三氯甲烷）=1∶5的比例配制Sevag試劑，以濃縮液體積的1/5加入Sevag試劑，并持續振蕩10 min使濃縮液與Sevag試劑充分接觸，再將混合液放入離心機中離心10 min，反復多次至無蛋白沉淀。合并上清液，真空旋蒸以除去有機溶劑，然后將其轉入截留分子質量8 000～14 000 u透析袋中，依次使用自來水透析48 h，蒸餾水透析24 h，超純水透析24 h。透析后，經濃縮、醇沉、冷凍干燥，即得到精制的青錢柳多糖樣品（CP），干燥保存備用。

1.3.2 優化條件的選擇

本課題組前期研究結果表明，m（多糖）∶V（乙酸酐）、反應時間和反應溫度是3 個影響乙酰化多糖取代度的主要因素[10]。為進一步研究乙酰化修飾青錢柳多糖的最佳工藝條件，根據前期實驗的結果，以及Han Fei[11]、梁少茹[12]和宋逍[13]等多糖乙酰化工藝優化的結果，選取反應時間、反應溫度以及m（多糖）∶V（乙酸酐）進行三因素三水平正交試驗，其中試驗號1～9分別對應乙酰化青錢柳多糖樣品Ac-CP1～Ac-CP9。

1.3.3 乙酰化青錢柳多糖的制備

采用乙酸酐法[10,14]制備乙酰化青錢柳多糖，并使用正交試驗法[11]考察m（多糖）∶V（乙酸酐）、反應時間和反應溫度對乙酰化多糖取代度的影響。稱取一定質量的青錢柳多糖分別用10 mL超純水溶于20 mL的試管中，用NaOH溶液調節pH值至9.0，分兩次加入2 mL的乙酸酐后，磁力攪拌15 min，調節pH值到8.0。之后將配制好的反應液放入恒溫水浴搖床中分別反應1、2、3 h。在40、60、80℃水浴下分別制得乙酰化青錢柳多糖（Ac-CP）。

反應結束后，離心，收集上清液，轉入8 000～14 000 u透析袋中，依次使用自來水、蒸餾水、超純水均分別透析24 h。透析后，將反應液進行濃縮，以V（反應液）∶V（無水乙醇）=1∶4的比例對所有反應液進行醇沉。4 ℃醇沉過夜后，離心，沉淀加水復溶。除去乙醇后，經冷凍干燥即得乙酰化青錢柳多糖，分別命名為：Ac-CP1～Ac-CP9。

1.3.4 乙酰基取代度（degree of substitution，DS）的測定

采用中和滴定法測定DS[11]。取9 支20 mL的試管，分別稱取10 mg乙酰化青錢柳多糖加入試管中。再加入10 mL 0.01 mol/L的NaOH溶液溶解乙酰化青錢柳多糖，將試管放入水浴恒溫振蕩器中，在50 ℃條件下劇烈振蕩2 h。待反應結束之后，用0.012 mol/L的HCl溶液反滴定至pH值為7.0。取代度計算公式如下。

式中：A為乙酰基含量/%；V0為加入NaOH溶液的體積/mL；c0為NaOH溶液的濃度/（mol/L）；V1為反滴定時消耗HCl溶液的體積/mL；c1為HCl溶液的濃度/（mol/L）；m為樣品的質量/g。

1.3.5 乙酰化青錢柳多糖的自由基清除活性的測定

根據正交試驗的結果，選用乙酰化多糖Ac-CP4（DS=0.681）參照文獻[15]方法，測定乙酰化修飾對青錢柳多糖抗氧化活性的影響。準確稱取25 mg乙酰化多糖樣品及未修飾的青錢柳多糖分別定容至25 mL，配制成1 mg/mL溶液，分別稀釋至31.25、62.5、125、250、500 μg/mL。將實驗分為樣品組、對照組和空白組，以抗壞血酸為陽性對照。2 mL 1 mmol/L的DPPH溶液加入10 mL具塞試管中，再加入0.5 mL樣品溶液，然后再加入1.5 mL水充分混勻，靜置30 min后在517 nm波長處測定吸光度。

式中：A2為2 mL DPPH溶液+0.5 mL多糖樣品溶液+ 0.5 mL水的吸光度；A1為2 mL乙醇+0.5 mL多糖樣品溶液+0.5 mL水的吸光度；A0為2 mL DPPH溶液+2 mL水的吸光度。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 正交試驗優化乙酰化青錢柳多糖的制備

表1 乙酰化青錢柳多糖制備的正交試驗優化方案及結果Table 1 Orthogonal array design with experimental results for optimal preparation of acetylated C. paliurus polysaccharides

由表1可知，取代度最高的是Ac-CP4和Ac-CP5，其取代度為0.681；取代度最低的是Ac-CP8，其取代度為0.379，兩者之間多糖取代度相差0.302。反應時間過長或過短時，多糖取代度都呈現出下降趨勢，最佳反應時間為2 h；反應溫度為40 ℃或80 ℃時的多糖取代度比較相近，均高于60 ℃，在本實驗中，最佳反應溫度為40 ℃；m（多糖）∶V（乙酸酐）越高時，多糖取代度越高。根據K值直觀分析，最佳乙酰化工藝條件是：A2B1C3，即反應時間為2 h、反應溫度為40 ℃、m（多糖）：V（乙酸酐）為1∶60。在上述優化條件下進行平行驗證實驗，測得乙酰化多糖平均取代度與理論預測值比較誤差小于3%，結果較為理想。

表2 正交試驗結果方差分析Table 2 Analysis of variance of the experimental results of orthogonal array design

以取代度為指標，根據取代度結果進行方差分析，由表2可知，影響青錢柳多糖乙酰化的主要因素是m（多糖）∶V（乙酸酐）和反應時間，反應溫度對多糖乙酰化的影響相對較小，各因素對取代度影響程度依次為C＞A＞B，即依次是m（多糖）∶V（乙酸酐）、反應時間、反應溫度。

2.2 乙酰化修飾對青錢柳多糖體外抗氧化活性的影響

機體在新陳代謝過程中會產生包括有機自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基等多種自由基[16]，當自由基在體內積累到一定濃度時，便會對機體細胞正常的生命活動造成侵害[17]。現代社會，諸如糖尿病、心血管疾病、高血壓等許多困擾人們身心健康的疾病都與自由基的活動有關[18-19]。許多研究用DPPH自由基清除能力作為天然活性成分抗氧化活性的評價指標[20-21]。

圖1 乙酰化青錢柳多糖Ac-CP4對DPPH自由基的清除作用Fig.1 DPPH radical scavenging activity of acetylated polysaccharide Ac-CP4

由圖1可知，修飾后與未修飾的青錢柳多糖DPPH自由基清除率均隨質量濃度的增加而增加，呈一定的劑量依賴關系，在500 μg/mL時其清除率達到最高，接近85%，之后增幅趨于平緩。有研究證實，較高的取代度可賦予修飾后多糖更強的生物活性[14]，因此根據正交試驗結果，選擇取代度最高的Ac-CP4樣品進行DPPH自由基清除實驗。隨著樣品質量濃度的增加，可以觀察到Ac-CP4清除率與樣品質量濃度成顯著的正相關，并且在較高質量濃度如500 μg/mL和1 000 μg/mL時，乙酰化多糖DPPH自由基清除率分別增加至（91.69±0.51）% 和（93.07±1.28）%，明顯高于未經修飾的同質量濃度青錢柳多糖的清除率（84.42±1.03）%及（86.15±1.73）%（P＜0.05），說明乙酰化修飾可起到增強青錢柳多糖清除DPPH自由基能力的作用。另外，VC作為陽性對照組，顯示出較強的抗氧化性，證明DPPH自由基體系建立成功，可以借助其清除率評價抗氧化物質的活性強弱。

隨著結構修飾逐漸成為多糖構效關系的研究熱點，已經有越來越多的證據表明，合理的結構修飾可以增強包括抗氧化、免疫活性、抗凝血在內的多種生物活性[22-23]。經乙酰化修飾后的南瓜多糖，其DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基清除率均可得到顯著增強，并且與乙酰基取代度成正相關[14]。另外，本實驗結果也與Zhang Zhongshan等[24]對乙酰化紫菜聚糖的研究結果類似。多糖構效關系研究表明，多糖的抗氧化活性可能來自于其糖環上的游離羥基、酚類物質和交聯蛋白的共同作用[25]，這也進一步說明多糖的抗氧化機理比較復雜，可能與其結合組分種類、高級結構有關，多糖經乙酰化修飾后，其空間構象發生變化，使其更易于提供羥基，從而有利于捕捉自由基，提高抗氧化活性。

3 結 論

本實驗采用乙酸酐法對青錢柳多糖進行乙酰化修飾，并使用正交試驗得到了最優的乙酰化條件，即反應時間2 h、反應溫度40 ℃、m（多糖）∶V（乙酸酐）為1∶60。進一步在體外進行的DPPH自由基清除實驗表明，經乙酰化修飾后的青錢柳多糖，其對DPPH自由基的清除能力得到顯著提高，乙酰化修飾可以提高多糖的抗氧化活性。本研究表明乙酰化修飾可用于青錢柳多糖的結構改性，為其構效關系研究提供新的方向。

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Acetylated Modification and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Cyclocarya paliurus

WANG Zhijun, ZHANG Liujing, ZHONG Yingxia, KAN Lijiao, XIE Jianhua*, XIE Mingyong
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Acetylated polysaccharides from Cyclocarya paliurus were prepared by using acetic anhydride method. An orthogonal array design was used to investigate the effects of ratio between acetic anhydride and polysaccharids, reaction temperature and reaction time on the efficiency of acetylated modification as evaluated by degree of substitution (DS). The antioxidant activity of acetylated polysaccharide (DS = 0.681) was investigated by DPPH radical scavenging capacity. The optimal conditions for acetylated modification were determined as 1:60, 2 h and 40 ℃ for ratio between acetic anhydride and polysaccharids, reaction time and reaction temperature, respectively. The results indicated that acetylated modification could enhance the antioxidant activity of Cyclocarya paliurus polysaccharides significantly. In conclusion, acetylation could be considered as an efficient method for the modification of Cyclocarya paliurus polysaccharides which provides a new direction for the development and utilization of Cyclocarya paliurus.

Cyclocarya paliurus (Batal.) Iljinskaja; polysaccharides; acetylation; antioxidation

TQ281

A

1002-6630（2015）21-0006-04

10.7506/spkx1002-6630-201521002

2015-06-25

國家自然科學基金面上項目（31471702）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31201297）

王之珺（1991—），男，碩士研究生，研究方向為食品化學與分析。E-mail：zjwang0916@163.com

*通信作者：謝建華（1982—），男，副研究員，博士，研究方向為食品碳水化合物結構與功能。E-mail：jhxie@ncu.edu.cn