活性氧影響單核細胞增生李斯特菌對7721肝癌上皮細胞的侵襲

陳國薇，吳 嫚，張 超，劉武康，丁承超，吳淑燕，李 森，劉 箐

（上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093）

活性氧影響單核細胞增生李斯特菌對7721肝癌上皮細胞的侵襲

陳國薇，吳 嫚，張 超，劉武康，丁承超，吳淑燕，李 森*，劉 箐*

（上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093）

用還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶抑制劑二苯基氯化碘鹽（diphenyleneiodonium chloride，DPI）處理單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）后，用2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯熒光法測定L. monocytogenes中的活性氧（reactive oxygen species，ROS），結果顯示細胞內源性ROS明顯降低且有DPI濃度依賴性。進而用ROS產生能力降低的L. monocytogenes侵襲7721肝癌上皮細胞，結果顯示：在1～10 μmol/L的DPI濃度范圍內，隨著L. monocytogenes內ROS水平的降低，L. monocytogenes侵襲7721上皮細胞的能力卻隨之增長。本研究提示：L. monocytogenes可能和高等動植物一樣存在類似于負責產生ROS的NADPH氧化酶，由其介導產生的ROS可能調控L. monocytogenes侵襲細胞的能力。

單核細胞增生李斯特菌；活性氧；侵襲；上皮細胞

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一種人畜共患的病原菌[1]，被世界衛生組織列為僅次于大腸桿菌O157、沙門氏菌、志賀氏菌之后的第四大重要的食源性致病菌[2]，廣泛寄生于土壤、污水、人和動物的糞便、飼料及肉類、蛋類、禽類等食品中。食源性L. monocytogenes可以經受高溫烹飪、胃部強酸環境等考驗后隨食物一同到達腸道，首先跨越人體的腸道屏障，通過內化作用進入腸道上皮細胞或吞噬細胞，在宿主細胞內和細胞間進行復制，進而隨淋巴系統和血液循環系統到達胎盤和大腦，越過胎盤屏障、血腦屏障，造成一系列疾病[3]。在食用被單增李斯特菌污染的食物后，將會導致腦膜炎、骨髓炎、心肌炎、孕婦流產以及產褥感染等疾病[4]。在美國，每年至少有500 例因食用L. monocytogenes污染的食品而中毒死亡的事件發生[5]。2004年北京市食品中L. monocytogenes污染狀況調查發現，L. monocytogenes在熟肉制品中檢出率高達48%；2007年珠海市冷凍食品中L. monocytogenes污染狀況調查發現，L. monocytogenes在冷凍水產品中的檢出率達36%[6]。

還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶是動植物細胞中專門產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基最重要的酶之一，該酶由gp91phox、p22phox、p40phox、p47phox和p67phox 5 個亞基組成[7]，由NADPH氧化酶介導產生的內源性ROS主要包括超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化物、烷氧基、以及O2衍生的非自由基物種如過氧化氫[8]。研究表明[9-11]，由NADPH氧化酶介導產生的ROS是高等動植物基因表達調控的重要信號分子。原核生物的呼吸作用一般發生在細胞膜上，由細胞膜上相關的酶催化反應的進行，因此細菌中ROS主要產生部位是細胞膜。細菌中ROS大部分是在呼吸鏈上的酶催化的氧分子連續單價電子的傳遞反應產生的，例如大腸桿菌細胞膜呼吸鏈中所產生的過氧化氫能夠占到總量的87%左右[12]。此外，生長環境也對ROS的產生有影響，例如電離、紫外輻射以及環境中某些小分子物質等作用于細菌時，也會對ROS的產量造成影響[13-14]。Lam等[15]發現由NADPH氧化酶介導產生ROS在L. monocytogenes侵染吞噬細胞過程中首先激發了吞噬細胞NADPH氧化酶活力，進而產生應答。Adolph等[16]研究發現NADPH氧化酶產生ROS是宿主細胞受到外源信號刺激時激活細胞自身凋亡程序的一個關鍵因素。但是，由NADPH氧化酶介導產生的ROS對于L. monocytogenes侵襲上皮細胞過程中所起到的作用，在此方面研究還較少。本實驗主要通過改變L. monocytogenes的ROS水平，在此基礎上去侵襲7721肝癌上皮細胞，然后統計侵襲水平，進行對比，進而確定ROS在L. monocytogenes侵襲上皮細胞中是否具有一定作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：L. monocytogenes（ATCC 43251） 上海慧耘生物科技有限公司；Li英諾克李斯特菌株（CICC 10297） 中國工業微生物菌種保藏管理中心。

細胞：人肝癌上皮細胞7721。

腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養基 北京陸橋技術有限責任公司；改良Eagle培養基（Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco，DMEM）細胞培養基 美國Gibco公司；二苯基氯化碘鹽（diphenyleneiodonium chloride，DPI）、2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichloro fluorescein diacetate easter，DCFH-DA）、聚乙二醇辛基苯基醚（octyl phenoxy poly ethoxy，Triton X-100） 美國Sigma公司；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）熒光染料 美國Vector公司；四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 上海碧云天生物技術有限公司；硫酸慶大霉素 上海世澤生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SpectraMax M2多功能酶標儀 美國分子儀器公司；Nikon A1激光掃描共聚焦顯微鏡 日本尼康公司；Eppendorf 5424離心機 德國艾本德公司。

1.3.1 L. monocytogenes的DPI處理及ROS含量的測定

挑取L. monocytogenes單菌落接種于滅菌BHI液體培養基中，37 ℃條件下搖床培養過夜。培養完成后再吸取少量新鮮菌液于新鮮滅菌BHI液體培養基中繼續培養至光密度（OD600nm）為0.3。取1 mL菌液分別加入終濃度為0、1、5、10、100 μmol/L的DPI，37 ℃條件下靜置1 h后離心并用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）清洗3 次后重懸（下同）。吸取重懸菌液100 μL添加到96 孔細胞培養板中，用酶標儀檢測OD600nm值，以檢測細菌的初始濃度。將培養板于37 ℃條件下靜置培養24 h后用酶標儀檢測培養板中菌液的增殖狀況（OD600nm）和熒光值（激發光波長488 nm，發射光波長530 nm，下同），再向每個孔中添加20 μmol/L的DCFH-DA，密封避光置于37 ℃溫度下，30 min后用酶標儀檢測每孔菌液的熒光值[17]，結果以相對未處理組的百分比表示。

1.3.2 DPI對細菌活性及生長狀況影響的測定

細菌DPI處理及PBS清洗同上1.3.1節，24 h后測量細菌濃度（OD600nm）以確定細菌的增殖狀況，之后向每孔添加20 μL、5 mg/mL的MTT，密封后置于37 ℃條件下反應4 h后離心，棄去上層液體后添加二甲基亞砜（dimethylslphoxide，DMSO），振蕩溶解藍色結晶后在570 nm波長處測量各孔光密度值。該MTT方法可確定細菌自身的活性，這是因為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。DMSO能溶解細胞中的甲瓚，用多功能酶標儀在570 nm波長處測定其光密度值，可間接反映細胞活性。生長狀況則是在DPI處理細菌并清洗后，使用生理鹽水進行稀釋，均勻涂布于BHI固體培養基上于37 ℃條件下靜置培養過夜，統計菌落總數。細菌活性（OD570nm）和生長狀況（OD600nm）結果均以相對未處理組的百分比表示。

1.3.3 細胞培養基對細菌生長影響的測定

細菌DPI處理及PBS清洗同1.3.1節，清洗后重懸，取適量菌液接種于不含胎牛血清的DMEM不完全細胞培養基中培養，每30 min為一組，測定OD600nm及MTT活性測試（同1.3.2節）。根據結果選取不同DPI處理組分之間細菌活性及數量差異很小的最大時間點，以確定細菌侵襲細胞時間。

畜牧獸醫動物防疫問題一直是畜牧業發展的重難點問題，畜牧獸醫防疫工作能否順利開展是衡量一個國家農業現代化程度的重要指標，因此受到了各國政府的重視。但是，現階段我國基層畜牧獸醫動物防疫工作存在一系列問題，嚴重制約了我國農業現代化的發展。因此，對畜牧獸醫動物防疫工作存在的問題進行深入的研究，并在此基礎上提出改進畜牧獸醫動物防疫工作的建議顯得尤為重要。

1.3.4 抗生素及Triton X-100對細菌的作用檢測

使用慶大霉素處理細菌，設置不同質量濃度慶大霉素加于BHI固體培養基中，然后取培養的新鮮L. monocytogenes稀釋并涂布于固體培養基，37 ℃條件下靜置過夜培養后統計菌落數。選取合適的慶大霉素質量濃度并加入到新鮮菌液中，37 ℃條件下靜置1 h后稀釋涂布，進行驗證。取新鮮培養的L. monocytogenes及L. monocytogenes菌液于離心管內，加入1%的Triton X-100于25 ℃條件下處理0、45、60 min后，稀釋并涂于BHI固體培養基，37 ℃條件下靜置培養過夜，統計菌落總數，結果以相對未處理組的百分比表示。

1.3.5 細菌侵襲細胞及免疫組化

細菌DPI處理及清洗同1.3.1節細菌清洗后使用不含胎牛血清的不完全DMEM細胞培養基重懸，細胞已在此之前已計數并接入24 孔細胞培養板并貼壁。取適量重懸菌液于孔板中，控制感染復數（multiplicity of infection，MOI）為100∶1（細菌數量∶細胞數量）[18]。于37 ℃、體積分數5% CO2條件下培養1.5 h后，加入終質量濃度為700 μg/mL的慶大霉素，37 ℃條件下作用1 h后用PBS清洗3 次。加入1% Triton X-100 25 ℃條件下處理30 min，然后進行稀釋并涂布于BHI固體培養基，37 ℃條件下靜置培養過夜后統計菌落數[19]。免疫組化則為提前在細胞培養板中接入細胞爬片，將7721貼壁細胞接種于細胞爬片上進行侵襲實驗，完成后清洗，進行免疫組化。

2 結果與分析

2.1 DPI處理后對細菌生長狀況及ROS的影響

圖1 DPI處理后對細菌生長狀況及ROS的影響Fig.1 Effect of DPI on bacterial growth and ROS production

將L. monocytogenes在其最適生長條件下使用DPI處理1 h后，檢測其生長增殖、活性及ROS的變化。如圖1A所示，用DPI處理1 h后，細菌生長沒有受到較大影響，OD600nm及MTT活性（OD570nm）相對比較穩定。當DPI濃度增至100 μmol/L時，細菌生長狀況大幅降低。圖1B是ROS相對值隨著DPI抑制濃度的增大而逐漸降低，當DPI濃度為10、100 μmol/L時，ROS相對值分別下降38%、59%。由此可見，當DPI達到100 μmol/L時，L. monocytogenes生長受到了較大的抑制，活菌數量降低明顯，但是在低于DPI濃度10 μmol/L情況下，活菌數量并未有較大差異，結合圖1B，ROS相對值卻有了明顯的降低，所以選取細菌侵襲細胞DPI抑制濃度最大到10 μmol/L。圖1C為L. monocytogenes在被不同濃度DPI處理后稀釋涂BHI平板后生長狀況的直觀結果。

2.2 不完全細胞培養基對細菌增殖及活性的影響

由于在細菌侵襲實驗過程中需要細菌與細胞在細胞培養基中共培養一定時間，而胎牛血清營養成分復雜并難以分析，所以使用不含胎牛血清的不完全DMEM細胞培養基作為營養源。不同的細菌在不完全細胞培養基中生長速率及活性變化是不一樣的，并且隨著共培養時間的增長，細菌數量將發生較大的改變，將會改變設定好的MOI＝100∶1，所以把DPI抑制處理過的細菌洗掉DPI后接種于DMEM細胞培養基中，37 ℃條件下靜置培養，選取不同時間點進行OD600nm及MTT活性測試。

由圖2A可知，3 種細菌在不完全細胞培養基中培養1.5 h后檢測其OD600nm和MTT活性，在這5 個濃度階梯內，OD600nm及MTT并未發生明顯變化，但是在100 μmol/L時有較為明顯的降低。圖2B為培養4 h后OD600nm和MTT活性值，發現在DPI濃度為100 μmol/L時，OD600nm和MTT活性發生了明顯的降低，但其他組分之間差異并不明顯。因此，當細菌與細胞共培養到4 h時，細菌數量及活性已經發生了非常大的變化，干擾細菌侵襲細胞數量的統計，但是1.5 h時細菌能夠進入細胞并且數量及活性并未發生較大變化，所以侵襲時間確定為1.5 h，DPI濃度則選取0～10 μmol/L。

圖2 不完全細胞培養基對細菌增殖及活性的影響Fig.2 Effect of incomplete cell culture medium on bacterial growth and activity

2.3 抗生素質量濃度及Triton X-100作用時間的確定

在細菌與細胞共培養1.5 h后，已經有部分活性較好的細菌進入細胞，但是在外部還是存有大量的細菌，需將細胞外部細菌最大程度的滅活并且不影響細胞活性。設置不同質量濃度的慶大霉素固體培養基，將已經生長到飽和狀態的新鮮菌液涂布于含不同質量濃度的慶大霉素固體培養基上，基于不完全細胞培養基對慶大霉素作用有所抵消，故要適當加大慶大霉素的質量濃度。最終確定慶大霉素質量濃度為700 μg/mL，將新鮮飽和菌液接種于含有慶大霉素700 μg/mL的培養基中，于37 ℃條件下作用1 h后稀釋涂板，對照組為接種于不含慶大霉素的培養基，于37 ℃條件下靜置過夜培養后統計菌落總數（圖3A）。使用慶大霉素處理1 h后的L. monocytogenes涂布于BHI平板培養基，已經基本不會生長細菌，證明在700 μg/mL的慶大霉素處理下，細菌已經基本全部被殺死，和對照組形成鮮明對比。因此，在細菌侵襲細胞實驗中選擇慶大霉素700 μg/mL殺死胞外細菌。

選取1%的Triton X-100，經過臺盼藍染色證明在0.5 h內細胞已被破碎掉，胞內菌得到釋放。由于Triton X-100處理細胞的過程時組分較多，會造成一定的時間誤差，為確保在誤差范圍內不會對胞內細菌的生長造成影響，故設置不同時間梯度的組分，將新鮮菌液直接暴露于1%的Triton X-100中，然后分別稀釋涂板。如圖3B所示，L. monocytogenes 43251處理60 min后，數量都沒有發生較大變化，說明L. monocytogenes在被1%的Triton X-100作用長達1 h后生長狀況沒有受到影響，保證可以破壞細胞使細菌完整釋放。圖3C為使用Triton X-100處理不同時間后稀釋涂平板結果。

圖3 抗生素質量濃度及Triton X-100作用時間的確定Fig.3 Screening of optimal concentration of antibiotics and optimal treatment duration with Triton X-100

2.4 細菌侵襲細胞

由圖4A可知，在ROS被抑制到不同程度后，L. monocytogenes侵襲細胞的能力也有所改變，隨著ROS的降低，細菌侵襲細胞的數量卻隨之增加。在DPI濃度為10 μmol/L時，侵襲比率增至4 倍。圖4B為L. monocytogenes侵襲細胞后，免疫組化處理后采用共聚焦顯微鏡拍攝圖片，并使用Li英諾克李斯特菌株作為對照。

圖4 細菌侵襲細胞實驗Fig.4 Observation of bacterial invasion of epithelial cells

3 討 論

本研究證實，在L. monocytogenes中存在有類似高等動植物的NADPH氧化酶，由其介導產生的ROS在其侵襲上皮細胞時具有一定的作用。在一定濃度范圍內，L. monocytogenes侵襲7721上皮細胞的能力呈現的趨勢為隨著細菌攜帶ROS水平的降低而升高。ROS對致病菌致病力一般有上調或是下調兩種影響，根據細菌的種類不同影響程度也有所不同。Corcionivoschi等[20]在研究ROS與空腸彎曲菌（致病力時發現，黏膜免疫過程中釋放的ROS會擾亂磷酸酪氨酸信號，從而下調了該細菌的致病力）。Bao Gaihong等[21]在研究硫色鐮刀菌對馬鈴薯塊莖造成干腐病的致病性時發現，該細菌的ROS過量生成以及消除ROS的相關還原性酶活力降低，使馬鈴薯塊莖的細胞脂質過氧化且細胞膜失去完整性，是其侵襲和致病的機理之一。在益生菌方面，Lin等[22]的研究發現對出生后腸道發育未成熟的小鼠使用鼠李糖乳桿菌灌胃可以明顯降低感染性腸炎的發病率，其機理是該種益生菌可以使腸道上皮細胞局部的ROS產量增加，使與炎癥信號產生相關的酶類被氧化后失活，大大降低炎癥發生的概率。并且較高的ROS水平會對細菌本身的生長造成影響，但是環境中少量的ROS會激發細菌的防御體系，增殖減緩并非細菌本身受到殺傷，而可能是細菌的主動行為，目的是為了減少突變的發生和原發性損傷[23]，較小范圍抑制ROS并不會對細菌的生長造成較大影響。

但是，由NADPH氧化酶介導產生的ROS并不是調控L. monocytogenes侵襲上皮細胞的唯一因素，已有研究[24-25]表明在L. monocytogenes侵染進入各種上皮細胞的過程中，L. monocytogenes分泌的內化素A和B是起關鍵作用的毒力因子，通過與宿主細胞上的受體E-cadherin和Met分別配位，實現L. monocytogenes與宿主細胞間的相互識別。并且也有研究[18]證實L. monocytogenes分泌的毒力因子RecA可以幫助L. monocytogenes抵御胃酸和膽汁的侵害，并能加速侵染腸道上皮細胞。L. monocytogenes作為致死率極高的胞內寄生菌，其跨越人體內腸道屏障的機制是其侵害人體的關鍵步驟。本實驗表明，ROS對于L. monocytogenes進入上皮細胞是有影響的，從細菌內部的ROS入手，通過摸索菌的ROS水平及生長特性，調控ROS水平后進行侵襲實驗。在改變ROS水平后，L. monocytogenes的侵襲能力發生了一定的變化，但是在細菌中ROS水平可能并不是完全由NADPH氧化酶所決定的，所以可能是ROS在L. monocytogenes侵襲上皮細胞的過程中起到了“信號分子”的作用。本研究是從細菌的ROS水平入手進行研究，在研究過程中，7721肝癌上皮腫瘤細胞本身的ROS水平具體的變化并未具體探明，是否在細胞ROS及細菌ROS之間存在一定的關系還需要進一步研究說明。但是，總體來說，本研究在2.1～2.3節結果穩定的條件下，精選細菌后調控了其ROS水平，在組分之間細胞水平一致的情況下，確實證明L. monocytogenes的ROS水平與L. monocytogenes對上皮細胞的侵襲有關聯，隨著ROS水平的降低，侵襲能力隨之增加。

綜上所述，L. monocytogenes中主要由NADPH氧化酶調控的ROS在被改變的情況下，L. monocytogenes侵襲上皮細胞的能力也有所改變，可能是作為一種信號分子而發揮作用。這一觀點對研究L. monocytogenes如何在人體內對身體造成嚴重的危害提供了新思路，對于食源性致病菌L. monocytogenes的致病機理也有一定的探索，并且啟發了對于其他食源性致病菌侵害人體的機理的研究，以便更好地控制食源性致病菌L. monocytogenes對人類健康造成的影響。

[1] NAKAMA A, MATSUDA M, ITOH T, et al. Molecular trying of Listera monocytogenes isolated in Japan by pulsed-field gelelectrophoresis[J]. Journal of Veterinary Medical Science, 1998, 60(6): 749-752.

[2] de AGUIRRE CARCER D, CUIV P O, WANG Tingting, et al. Morrison M: numerical ecology validates a biogeographical distribution and gender-based effect on mucosa-associated bacteria along the human colon[J]. Isme Journal, 2011, 5(5): 801-809.

[3] HOLCH A, GOTTLIEB C T, LARSEN M H, et al. Gram L: poor invasion of trophoblastic cells but normal plaque formation in fibroblastic cells despite actA deletion in a group of Listeria monocytogenes strains persisting in some food processing environments[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(10): 3391-3397.

[4] 王為黎, 馬景紅, 牟榮, 等. 食源性單核細胞增生李斯特菌的帶染研究[J]. 中國醫學理論與實踐, 2002, 3002(4): 501-502.

[5] MEJLHOLM O, GUNVIG A, BORGGAARD C, et al. Dalgaard P: predicting growth rates and growth boundary of Listeria monocytogenes: an international validation study with focus on processed and ready-to-eat meat and seafood[J]. International Journal of Food Microbiology, 2010, 141(3): 137-150.

[6] 李愛華, 葉長蕓. 單核細胞增生性李斯特菌致病相關機制的研究進展[J]. 疾病監測, 2011, 26(11): 914-919.

[7] 韓曉燕, 高麗萍, 劉箐. NOX家族蛋白的研究進展[J]. 生命科學, 2012, 24(6): 568-577.

[8] MOBARAK A M, BILLION A, MOHAMED W, et al. Adaptation of Listeria monocytogenes to oxidative and nitrosative stress in IFN-γ-activated macrophages[J]. International Journal of Medical Microbiology, 2011, 301(7): 547-555.

[9] AHNMAD P, SARWAT M, SHARMA S. Reactive oxygen species, antioxidants and signaling in plants[J]. Journal of Plant Biology, 2008, 51(3): 167-173.

[10] KRESLAVSKI V D, LOS D A, ALLAKHVERDIEV S I, et al. Signaling role of reactive oxygen species in plants under stress[J]. Russian Journal of Plant Physiology, 2012, 59(2): 141-154.

[11] MATSUNAGA Y, KAWAI Y, KOHDA Y, et al. Involvement of activation of NADPH oxidase and extracellular signal-regulated kinase(ERK) in renal cell injury induced by zinc[J]. The Journal of Toxicological Sciences, 2005, 30(2): 135-144.

[12] GONZáLEZ-FLECHA B, DEMPLE B. Metabolic sources of hydrogen peroxide in aerobically growing Escherichia coli[J]. Journal of Biological Chemistry, 1995, 270(23): 13681-13687.

[13] SANTOS A L, GOMES N C, HENRIQUES I, et al. Contribution of reactive oxygen species to UV-B-induced damage in bacteria[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B Biology, 2012, 117(5): 40-46.

[14] SUBRAMANIAN M, GOSWAMI M, CHAKRABORTY S, et al. Resveratrol induced inhibition of Escherichia coli proceeds via membrane oxidation and independent of diffusible reactive oxygen species generation[J]. Redox Biology, 2014, 2: 865-872.

[15] LAM G Y, FATTOUH R, MUISE A M, et al. Listeriolysin O suppresses phospholipase C-mediated activation of the microbicidal NADPH oxidase to promote Listeria monocytogenes infection[J]. Cell Host Microbe, 2011, 10(6): 627-634.

[16] ADOLPH S, SCHOENIGER A, FUHRMANN H, et al. Unsaturated fatty acids as modulators of macrophage respiratory burst in the immune response against Rhodococcus equi and Pseudomonas aeruginosa[J]. Free Radical Biology Medicine, 2012, 52(11/12): 2246-2253.

[17] 馮飛飛, 張強, 王莉, 等.毒力基因調控蛋白PrfA促進單核細胞增生李斯特菌生物被膜的形成[J]. 微生學通報, 2011, 38(9): 1450-1457

[18] van der VEEN S, ABEE T. Contribution of Listeria monocytogenes RecA to acid and bile survival and invasion of human intestinal Caco-2 cells[J]. International Journal of Medical Microbiology, 2011, 301(4): 334-340.

[19] WILBER Q T, DANESH C, ARTHEE J, et al. Nontoxic radioactive Listeria at is a highly effective therapy against metastatic pancreatic cancer[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013, 110(21): 8668-8673.

[20] CORCIONIVOSCHI N, ALVAREZ L A, SHARP T H, et al. Mucosal reactive oxygen species decrease virulence by disrupting Campylobacter jejuni phosphotyrosine signaling[J]. Cell Host Microbe, 2012, 12(1): 47-59.

[21] BAO Gaihong, BI Yang, LI Yongcai, et al. Overproduction of reactive oxygen species involved in the pathogenicity of Fusarium in potato tubers[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology, 2014, 86: 35-42.

[22] LIN P W, MYERS L E, RAY L, et al. Lactobacillus rhamnosus blocks inflammatory signaling in vivo via reactive oxygen species generation[J]. Free Radical Biology Medicine, 2009, 47(8): 1205-1211.

[23] HAN Xuelin, YU Rentao, JI Lei, et al. InlB-mediated Listeria monocytogenes internalization requires a balanced phospholipase D activity maintained through phospho-cofilin[J]. Molecular Microbiology, 2011, 81(4): 860-880.

[24] YESILKAYA H, ANDISI V F, ANDREW P W, et al. Streptococcus pneumoniae and reactive oxygen species: an unusual approach to living with radicals[J]. Trends Microbiology, 2013, 21(4): 187-195.

[25] GRUNDLER T, QUEDNAU N, STUMP C, et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the bloodcerebrospinal fluid barrier[J]. Microbes and Infection, 2013, 15(4): 291-301.

Effect of Reactive Oxygen Species (ROS) on the Invasion of Listeria monocytogenes to 7721 Epithelial Cells

CHEN Guowei, WU Man, ZHANG Chao, LIU Wukang, DING Chengchao, WU Shuyan, LI Sen*, LIU Qing*
(School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)

Diphenyleneiodonium chloride (DPI), which can inhibit the activity of NADPH oxidase and reduce endogenous reactive oxygen species (ROS), was used to reduce the generation of ROS in Listeria monocytogenes, which was then allowed to invade 7721 epithelial cells of human hepatocellular carcinoma. The results showed that the endogenous ROS in L. monocytogenes was markedly decreased in the presence of DPI in a concentration-dependent way. Within the DPI concentration range of 1-10 μmol/L, as the level of ROS in reduced, its ability to invade 7721 epithelial cells increased. This illustrates that L. monocytogenes may have a NADPH oxidase similar to that of higher plants and animals, which is responsible for the production of ROS and regulates the invasion ability possibly by mediating ROS production, suggesting that NADPH oxidase may be an important signal molecule for L. monocytogenes to invade 7721 epithelial cells.

Listeria monocytogenes; reactive oxygen species (ROS); invasion; epithelial cells

Q932

A

1002-6630（2015）21-0117-06

10.7506/spkx1002-6630-201521023

2014-12-31

國家自然科學基金面上項目（31371776）

陳國薇（1989—），女，博士研究生，研究方向為食源性致病菌致病機理。E-mail：vickey5895@126.com

*通信作者：李森（1982—），女，講師，博士，研究方向為食源性致病菌治病機理。E-mail：lisen_1027@126.com

劉箐（1970—），男，教授，博士，研究方向為食源性致病菌致病機理及安全控制。E-mail：liuq@usst.edu.cn