耐酸耐膽鹽乳酸菌的鑒定及篩選

李 利，孔 麗，張 寧，趙偉超，肖亦農，李炳學,*，韓曉日

（1.沈陽農業大學土地與環境學院，土肥資源高效利用國家工程實驗室，遼寧 沈陽 110866；2.沈陽農業大學生物科學技術學院，遼寧 沈陽 110866）

耐酸耐膽鹽乳酸菌的鑒定及篩選

李 利1，孔 麗2，張 寧2，趙偉超2，肖亦農1，李炳學1,*，韓曉日1

（1.沈陽農業大學土地與環境學院，土肥資源高效利用國家工程實驗室，遼寧 沈陽 110866；2.沈陽農業大學生物科學技術學院，遼寧 沈陽 110866）

從自然發酵的酸奶中分離出2 株細菌，經16S rDNA分子鑒定為Lactobacillus plantarum SN1和Lactobacillus rhamnosus SN6，并對其生長曲線、產酸速率、耐酸耐膽鹽能力進行了研究。L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6在2 h后進入對數期，16 h后達到穩定期，其OD600nm值分別為8.47、7.43。L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6的產酸速率較快，ph值在8 h后就降到了4.2以下，48 h后降到3.3左右。L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6在ph 4的培養基培養16 h后，其相對OD600nm值分別為49.29%、47.14%，具有較強的耐酸能力。L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6在0.3 g/L膽鹽質量濃度下培養16 h后，相對OD600nm值分別為57.7%、69.48%；在0.6 g/L膽鹽質量濃度下的相對OD600nm值分別為48.22%、29.56%，具有較強的耐膽鹽能力。結果表明：L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6是生長性能好、產酸能力強、耐酸耐膽鹽的益生菌株。

乳酸菌；耐酸耐膽鹽；16S rDNA序列分析

乳酸菌是發酵葡萄糖，主要代謝終產物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏陽性細菌的總稱[1]，包括乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、肉桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、漫游球菌屬、明串球菌屬、酒球菌屬、四聯球菌屬等[2]，具有促進營養物質消化和吸收、降低血清膽固醇、調節腸道菌群平衡、激活機體免疫系統、改善食品風味和預防癌癥等生理功能[3]，在工業、農業、食品及醫療保健等與人類密切相關的領域中有很高的應用價值[4]。自然界中乳酸菌種類很多，分布極廣，在乳制品、肉制品、水果、蔬菜及植物制品上都有發現，有些種類甚至存在于人體的口腔、胃腸中[5]。

分離自開菲爾粒的植物乳桿菌Lp27[6]，發酵酸肉的消化乳桿菌SR10[7]，奶豆腐的屎腸球菌M1-1、植物乳桿菌M1-2、乳酸片球菌M1-3[8]，人腸道的屎腸球菌、食竇魏斯氏菌、干酪乳桿菌、發酵乳桿菌[9]、鼠李糖乳桿菌Lr10[10]，均具有降膽固醇的益生作用。分離自發酵食品和糞便的植物乳桿菌CCFM8661和干酪乳桿菌CCFM1566[11]，奶豆腐的鼠李糖乳桿菌M6-1[8]具有抗氧化能力。從風干香腸中分離的明串珠菌既有去除膽固醇能力、又有抗氧化能力[12]。分離自開菲爾粒的乳酸乳球菌乳亞種hUCM 201[13]，人腸道的植物乳桿菌L2[14]對腸道細胞表現出了良好的黏附性。從酸菜中分離的植物乳桿菌[15]，傳統乳制品、仔豬糞便及雞腸道分離的短乳桿菌、糞腸球菌、嗜酸乳桿菌[16]對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等有害菌株，均有明顯的抑菌效果。分離自奶酪的植物乳桿菌具有調節腸道菌群的功能[17]，分離自傳統乳制品中的保加利亞乳桿菌LJJ自溶活性較強[18]。

乳酸菌在人體內發揮益生作用的前提是其可在人體腸道中存活并定殖，而乳酸菌能否在人體內存活定殖主要與其耐酸耐膽鹽能力有關[19]。因此，耐酸耐膽鹽能力是篩選益生性乳酸菌的一個重要指標[20]。本實驗從自然發酵的酸奶中分離出2 株乳酸菌，并對其生長曲線、產酸速率、耐酸耐膽鹽能力進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料、培養基與試劑

酸奶是將鮮牛奶封閉于滅菌容器內，經37 ℃自然發酵1 d制成。Lactobacillus plantarum subsp. plantarum CGMCC 1.555、Lactobacillus brevis CGMCC 1.558、Lactobacillus acidophilus CGMCC 1.1878、Lactobacillus casei CGMCC 1.2435、Lactobacillus pentosus CGMCC 1.2439、Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.2466購自中國普通微生物保藏管理中心。

MRS液體培養基（g/L）：蛋白胨10.0、牛肉膏10.0、酵母粉5.0、葡萄糖20.0、檸檬酸二鈉2.0、吐溫-80 1.0、K2hPO42.0、乙酸鈉5.0、(Nh4)2SO41.63、MgSO40.58、MnSO40.25，ph值為6.5，115 ℃滅菌30 min。

DNA 2000 Marker 寶生物工程（大連）有限公司；2×Taq MasterMix 北京康為世紀生物科技有限公司；GoodView核酸染料 北京賽百盛基因技術有限公司。其他試劑均為進口或國產分析純產品。

1.2 儀器與設備

TC-412型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 英國Techne公司；Bio-Rad universal hoodⅡ型凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；Lambda Bio35 紫外-可見分光光度計 美國Perkin Elme公司；GNP-9080型電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備公司；ph計 美國Orion公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離及初步鑒定

稱取5 g自制酸奶樣品，用45 mL無菌水均質，然后做10 倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-63 個稀釋度，各稀釋度取0.1 mL液體分別涂布于固體MRS培養基平板上，37 ℃厭氧培養48～72 h。根據形態特征挑選典型菌落，反復劃線獲得純菌株，進行革蘭氏染色鏡檢和過氧化氫酶實驗。

1.3.2 乳酸菌16S rDNA分子鑒定

1.3.2.1 引物的設計與合成

16S rDNA通用引物：7F：5’-CAGAGTTT GATCCTGGCT-3’；1540R：5’-AGGAGGTGA TCCAGCCGCA-3’。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.2.2 總DNA的提取[21]

取過夜培養的菌液1 mL置于1.5 mL EP管中，4 000 r/min離心5 min 后，棄上清收獲菌體。在沉淀物中加入100 μL裂解液（100 mmol/L Tris、30 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、0.5%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）），沸水浴15 min后，加入100 μL的2.5 mol/L醋酸鉀后，置于冰上30 min。再加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）劇烈振蕩后，12 000 r/min離心10 min，取上清加入等體積的冷的異丙醇，－20 ℃靜置15 min；13 000 r/min離心15 min；用100 μL 體積分數70%的乙醇洗滌沉淀，13 000 r/min離心5 min，用100 μL 無水乙醇再次洗滌沉淀，將沉淀置于真空干燥器中抽干，加入50 μL ddH2O溶解，即為DNA。將提取的DNA于－20 ℃條件下保存備用。

1.3.2.3 PCR 擴增

反應體系為DNA模板1.5 μL；2×Taq MasterMix 12.5 μL；10 μmol/L 7F、1540R上下游引物各0.5 μL；加無菌水至總體積為25 μL。PCR條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共35 個循環；第35個循環72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。按照以上條件設定程序，使用PCR儀進行PCR擴增。

1.3.2.4 PCR擴增產物的凝膠電泳

配制1%的瓊脂糖凝膠，以5∶1（V/V）的比例加入PCR產物和6×Loading buffer，在100 V電壓條件下電泳30 min，利用紫外凝膠成像系統進行觀察與分析。最后，將PCR產物送到生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序結果在GenBank中進行BLAST分析，構建系統發育樹。

1.3.3 乳酸菌生物學性質研究

1.3.3.1 生長曲線測定

將活化的菌株，按3%接種量接種于MRS 液體培養基中，37 ℃厭氧培養36 h，每隔2 h取樣，在600 nm波長處測定樣品的光密度（OD）值，繪制生長曲線圖。

1.3.3.2 產酸性實驗

將活化的菌株，按3%接種量接種于MRS 液體培養基中，37 ℃厭氧培養30 h，每隔2 h取樣測ph值。

1.3.3.3 耐酸性實驗

將活化的菌株，按3%接種量接種于ph值分別為2.0、4.0、6.0、6.5和7.0的MRS液體培養基中，37 ℃厭氧培養16 h，測各組菌液的OD600nm值。

1.3.3.4 耐膽鹽實驗

將活化后的菌株，按3%接種量接種于膽鹽質量濃度分別為0、0.3、0.6 g/L的MRS液體培養基中，37 ℃厭氧培養16 h，測各組菌液的OD600nm值。

2 結果與分析

2.1 菌落形態及細胞形態的初步鑒定

從酸奶中共分離出2 株革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的桿菌，分別命名為SN1、SN6。菌落形態為乳白色或白色、表面光滑、邊緣整齊、大小不一的圓形菌落。細胞形態為短桿狀，一般呈單個、成對或鏈狀排列。

2.2 乳酸菌16S rDNA基因序列分析

圖1 分離株16S rDNA基因PCR擴增產物電泳結果Fig.1 Electrophoresis of PCR-amplified 16S rDNA gene fragmentsfrom two isolates

由圖1可知，PCR擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，分離株在1 500 bp處均出現特異性條帶，與預期擴增大小一致，說明擴增成功。

測序后，將各菌株的16S rDNA基因測序結果在GenBank中進行BLAST分析，各菌株與參考菌株的同源性均達到99%以上（表1）。為顯示菌株之間的親緣關系及系統地位，MEGA5構建系統發育樹（圖2）。

表1 16SrDNA序列的BLAST分析結果Table 1 16S rDNA sequence analysis results of BLAST

圖2 分離株16S rDNA 序列系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of two isolates

如圖2所示，分離株中1 株與L. plantarum有較近親緣性，1 株與L. rhamnosus有較近的親緣性，且與相似菌株的相似性達到100%，故SN1鑒定為L. plantarum（NCBI登錄號為KP296678），SN6鑒定為L. rhamnosus（NCBI登錄號為KP296679）。

2.3 乳酸菌生物學性質

2.3.1 乳酸菌生長曲線

圖3 乳酸菌的生長曲線Fig.3 Growth curves of lactic acid bacteria

由圖3可知，各菌株生長迅速，L. plantarum subsp. plantarum CGMCC 1.555、L. rhamnosus CGMCC 1.2466、L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6、L. casei CGMCC 1.2435在2 h后進入對數期，L. plantarum subsp. plantarum CGMCC 1.555在12 h后達到穩定期；L. rhamnosusCGMCC 1.2466在14 h后達到穩定期，SN1、SN6在16 h后達到穩定期，L. casei CGMCC 1.2435在18 h后達到穩定期。L. pentosus CGMCC 1.2439在4 h后進入對數期，16 h后進入穩定期。L. brevis CGMCC 1.558在6 h后進入對數期，14 h后進入穩定期。L. acidophilus CGMCC 1.1878在10 h后進入對數期，16 h后進入穩定期。

L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6、L. pentosus CGMCC 1.2439、L. rhamnosus CGMCC 1.2466、L. casei CGMCC 1.2435、L. plantarum subsp. plantarum CGMCC 1.555、L. brevis CGMCC 1.558、L. acidophilus CGMCC 1.1878對數期的OD600nm值分別為8.47、7.43、6.93、6.76、4.67、3.94、2.09、1.43。

2.3.2 產酸性實驗

產酸速率是乳酸菌活力良好的重要特征之一，也是篩選優良菌株的重要指標。由圖4可知，L. rhamnosus 1.2466和L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6產酸最快，8 h后ph值降到4.2以下；L. plantarum subsp. plantarum CGMCC 1.555、L. pentosus CGMCC 1.2439在10 h后ph值下降到4.2以下；L. casei CGMCC 1.2435在12 h后下降到4.2，L. brevis 1.558、L. acidophilus CGMCC 1.1878產酸相對較慢，36 h后ph值下降到4以下。以上菌株顯示了較好的產酸能力。

圖4 乳酸菌的產酸性Fig.4 Acid production rates of lactic acid bacteria

2.3.3 耐酸性實驗結果

圖5 乳酸菌在不同pH值培養基中培養16 h后的OD600nm值Fig.5 OD600nmvalues of lactic acid bacteria cultivated in media at different pHs for 16 h

由圖5可知，L. acidophilus CGMCC 1.1878、L. pentosus CGMCC 1.2439、L. plantarum SN1在培養基ph值為6.0時OD600nm值最大，L. plantarum subsp. plantarum CGMCC 1.555、L. brevis CGMCC 1.558、L. casei CGMCC 1.2435、L. rhamnosus CGMCC 1.2466在培養基ph值為6.5時OD600nm值最大，而L. rhamnosus SN6在ph值為6.0和6.5時均達到了最大的生長量，說明培養基在ph 6.0左右為各菌株的最佳培養條件。 ph 2.0的培養基中各菌株基本不生長；在ph 4.0的培養基中，L. plantarum subsp. plantarum CGMCC 1.555、L. brevis CGMCC 1.558、L. acidophilus CGMCC 1.1878、L. casei CGMCC 1.2435、L. pentosus CGMCC 1.2439、L. rhamnosus CGMCC 1.2466、SN1、SN6的相對OD600nm分別為3.98%、31.91%、13.58%、31.50%、56.53%、45.98%、49.29%、47.14%。綜上結果，L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6均較參考菌株的相對OD600nm值高，說明L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6具有較強的耐酸能力。

2.3.4 耐膽鹽實驗

耐膽鹽能力是乳酸菌的重要特征之一，乳酸菌要到達并定殖于腸道，必須對膽鹽有一定的耐受性。由圖6可知，隨著膽鹽質量濃度的升高，各菌株的生長受到不同程度的抑制。將菌株在0.3 g/L的膽鹽質量濃度下培養16 h后，與培養基中沒添加膽鹽的OD600nm值相比，L. plantarum subsp. plantarum 1.555、 L. brevis 1.558、L. acidophilus 1.1878、L. casei 1.2435、 L. pentosus 1.2439、L. rhamnosus 1.2466、L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6的相對OD600nm值分別為12.81%、57.31%、34.00%、53.40%、53.66%、89.02%、57.70%、69.48%；在0.6 g/L的膽鹽質量濃度下培養16 h后，與培養基中沒添加膽鹽的OD600nm值相比，各菌株相對OD600nm值分別為3.31%、48.84%、14.33%、 28.53%、 35.58%、27.36%、48.22%、29.56%。與參考菌株相比，L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6具有較強的耐膽鹽能力。

圖6 乳酸菌在不同膽鹽含量培養基中培養16 h后的OD600nm值Fig.6 OD600nmvalues of lactic acid bacteria cultivated in media with different bile salt concentrations for 16 h

3 結論與討論

酸奶經自然發酵會保留許多具有優良特性的乳酸菌，如植物乳桿菌、發酵乳桿菌、干酪乳桿菌、戊糖乳桿菌、消化乳桿菌、詹氏乳桿菌、耐酸乳桿菌、德氏乳桿菌、玉米乳桿菌、糞腸球菌、嗜熱鏈球菌、植物乳球菌和腸膜明串珠菌[22-23]。鼠李糖乳桿菌多分離于人的糞便[24-25]、人群腸道[10]、乳酪[26]、以及發酵橄欖[27]等。本研究從自然發酵的酸奶中分離到2 株細菌，進行革蘭氏染色、過氧化氫酶及16S rDNA鑒定為L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6。

乳酸菌作為發酵劑被廣泛應用到食品行業，如酸奶、奶酪、風干香腸、酸菜等的生產。在發酵初期，乳酸菌快速生長且能夠足量的產酸，使ph值迅速降低，這不僅對產品色澤的形成有促進作用，還能夠提高產品的穩定性[28-29]和安全性[30]。本研究通過生長曲線和產酸速率指標篩選出生長迅速、產酸較快L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6初步可作為具有潛在發酵特性的菌株。

乳酸菌作為益生菌能否在人體內發揮益生作用，關鍵在于其能否在胃液的酸性環境和腸道的膽鹽環境中存活下來。正常人的胃液在ph 1.5～4.5之間，其ph值的大小因食物結構不同而波動[31]。在ph 2.0時，所有菌株基本不生長；在ph 4.0時，各菌株均表現出不同程度的耐受性，L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6相對OD600nm值分別為49.29%、47.14%，且均較參考菌株的相對OD600nm值高，說明L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6具有較強的耐酸能力。這種耐酸特性是多種機制共同作用的結果，包括雙組分信號轉導系統、維持胞內外ph值平衡，細胞膜組成變化，蛋白質、DNA 損傷修復等[5]。

L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6具有較強的耐酸能力，能夠保證一定數量的活菌體順利通過胃酸環境到達腸道內。人體小腸中膽鹽質量濃度在0.3～3 g/L之間波動，能夠在正常生理膽鹽質量濃度中生長和代謝的菌株才可能在腸道消化過程中存活[32]。本研究中L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6在0.3 g/L膽鹽質量濃度下培養16 h后，相對OD600nm值分別為57.7%、69.48%； 在0.6 g/L膽鹽質量濃度下的相對OD600nm值分別為48.22%、29.56%，均表現出一定的耐受力，且均較參考菌株的相對OD600nm值高，由此可見，L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6具有較強的耐膽鹽能力。耐膽鹽特性主要與自身的膽鹽水解酶、表層蛋白有關[5]。

乳酸菌作為益生菌對人體具有重要的生理功能，它對胃腸道的耐受性是其發揮生理功能的基本前提。本研究所鑒定的兩株乳酸菌有較強的耐酸耐膽鹽能力，具有在人體內定殖的潛力，可以廣泛應用在酸奶、豆類、谷物等乳酸發酵制品中，也可應用在發酵肉制品、青貯飼料中。目前，對于乳酸菌耐酸耐膽鹽機制的研究已有諸多報道，但尚不完全清楚[5]。本課題組將運用同源基因克隆方法研究L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6中的膽鹽水解酶基因等，深入分析其耐酸耐膽鹽的機制。

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Identification and Selection of Lactic Acid Bacteria Resistant to Acid and Bile Salt

LI Li1, KONG Li2, ZHANG Ning2, ZHAO Weichao2, XIAO Yinong1, LI Bingxue1,*, HAN Xiaori1
(1. National Engineering Laboratory for Efficient Utilization of Soil and Fertilizer Resources, College of Land and Environment, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2. College of Biological Science and Technology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Two strains of lactic acid bacteria were isolated from naturally fermented yogurt. The 16S rDNA sequence analysis indicated that the two strains were Lactobacillus plantarum SN1 and Lactobacillus rhamnosus SN6. These strains were studied for growth curve, acid production rate, acid and bile salt tolerance. Both of them reached a logarithmic growth phase after 2 h and a stable period after 16 h with OD600nmvalues of 8.47 and 7.43, respectively. The pH value dropped to 4.2 at 8 h and 3.3 at 48 h. L. plantarum SN1 and L. rhamnosus SN6 had strong resistance to acid, and the relative OD600nmvalue was 49.29% and 47.14% at pH 4.0 after 16 h of culture, respectively. After being cultured for 16 h at a bile salt concentration of 0.3 g/L, the relative OD600nmvalues of L. plantarum SN1 and L. rhamnosus SN6 were 57.7% and 69.48%, respectively, compared to 48.22% and 29.56% when the concentration of bile salt was 0.6 g/L. These results show that both L. plantarum SN1 and L. rhamnosus SN6 are probiotic strains with strong growth performance, acid production and tolerance to acid and bile salt.

lactic acid bacteria; acid and bile salt tolerance; 16S rDNA sequence analysis

Q935

A

1002-6630（2015）21-0123-06

10.7506/spkx1002-6630-201521024

2015-01-05

國家自然科學基金面上項目（31271818）；沈陽市科技創新農業科技攻關專項（F13-143-3-00）；

中國博士后科學基金項目（2012M510836；2013T60299）

李利（1989—），女，碩士研究生，研究方向為微生物生理與遺傳。E-mail：lili2008aa@163.com

*通信作者：李炳學（1973—），男，教授，博士，研究方向為微生物生理與遺傳。E-mail：libingxue1027@163.com