重組枯草芽孢桿菌分泌表達腺苷酸脫氨酶

郭自濤，張 梁，李由然，李 贏，顧正華，丁重陽，石貴陽

（糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

重組枯草芽孢桿菌分泌表達腺苷酸脫氨酶

郭自濤，張 梁*，李由然，李 贏，顧正華，丁重陽，石貴陽

（糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

目的：利用基因重組技術，構建腺苷酸脫氨酶高效表達的重組菌株。方法：以前期構建的產腺苷酸脫氨酶重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET28α-AMPD中來源于鼠灰鏈霉菌（Streptomyces murinus）目的基因為模板，設計特異性引物擴增腺苷酸脫氨酶基因，亞克隆至游離型表達載體pHY-WZX，轉化枯草芽孢桿菌WB600。結果：成功篩選獲得了一株產腺苷酸脫氨酶重組枯草芽孢桿菌WB600/pHY-AMPD，進一步在搖瓶中探究了發酵培養基成分對重組酶發酵的影響。獲得了較優發酵培養基為：葡萄糖10 g/L、 酵母膏30 g/L、CaCl20.5 g/L、檸檬酸三鈉1 g/L、NaH2PO410 g/L、K2HPO410 g/L、(NH4)2SO45 g/L，37 ℃、200 r/min發酵60 h搖瓶發酵液酶活力可達到（2 230±50） U/mL。結論：本研究實現了鼠灰鏈霉菌來源的腺苷酸脫氨酶基因在枯草芽孢桿菌中表達。

腺苷酸脫氨酶；鼠灰鏈霉菌；枯草芽孢桿菌；重組表達

腺苷酸脫氨酶（adenosine deaminase，AMPD，EC 3.4.5.6）廣泛存在于各種生物體內，包括微生物、動物以及人體內，它在真核生物能量代謝中起著非常重要的作用[1]。腺苷酸脫氨酶是一種氨基水解酶，在嘌呤代謝循環中起著至關重要的作用。在一定反應條件下，它能催化腺苷酸脫去氨基產生肌苷酸（inosinic acid，IMP）和NH3[2]，IMP是一種在核糖核酸（RNA）中發現的核苷酸，可用作食品調味劑和藥品。其二鈉鹽與谷氨酸鈉（味精）混合使用，呈味作用比單用味精高數倍，有“強力味精”之稱；在醫藥方面，適用于各種原因引起的白細胞減少癥、血小板減少癥、各種心臟疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外尚可治療中心視網膜炎、視神經萎縮等。

伴隨著食品、醫藥等領域的不斷發展，人類對腺苷酸脫氨酶需求量不斷增大。早期主要應用哺乳動物細胞進行生產腺苷酸脫氨酶，不僅生產工藝復雜，生產成本高，而且效率低，產量不高，不能滿足需求。目前，工業生產腺苷酸脫氨酶通常使用微生物進行固態或液態發酵，所使用的微生物多數為經過篩選得到的可產生腺苷酸脫氨酶的野生菌株，如蜂蜜曲霉[3]、米曲霉[4-5]、酵母[6]等，但是酶活性普遍較低。例如，普為民等[7]從青霉和曲霉中篩選到一株產AMPD的蜂蜜曲霉，通過紫外誘變處理和優化后，該菌所產的脫氨酶活性達到1 300 U/mL。梅光明等[8]從自然發酵乳中篩選出AMPD活性最高的菌株進行初步鑒定，結果為毛霉菌屬，經發酵優化后，酶活力達到472.3 U/mL。王普行等[9]從曲霉菌中篩選到一株產AMPD較高的菌株，對其發酵培養基以及發酵條件進行研究后，該菌株酶活力為600 U/mL。同時，在生產過程中存在諸多問題，如固態發酵過程中發酵培養基中的蛋白質、色素等物質混入酶液，造成酶的提取純化工藝復雜，生產成本增加；液態發酵時酶活力提高困難和發酵穩定性問題等。目前，國內外使用基因重組技術構建重組菌株進行生產方面的研究較少，公開的報道主要由日本天野酶株式會社[10]和江南大學發布的專利[11-13]。利用基因重組技術，尋找合適的微生物來源的AMPD基因以及合適的表達體系，從而獲得AMPD高效表達，具有十分重要的學術意義和應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

菌株：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）WB600/ pHY-WZX，產腺苷酸脫氨酶重組大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）/pET28α-AMPD，腺苷酸脫氨酶基因來源于鼠灰鏈霉菌（Streptomyces murinus）（菌種保藏號：MCCC 1A01641），為江南大學國家工程實驗室構建和保藏。

質粒：pHY-WZX，為江南大學國家工程實驗室構建和保藏。

1.1.2 培養基

種子培養基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、四環素0.03 g/L，蒸餾水1 L，115 ℃滅菌20 min。

初始發酵培養基：麥芽糊精10 g/L、棉籽粉40 g/L、NaH2PO410 g/L、K2HPO410 g/L、檸檬酸三鈉2 g/L、(NH4)2SO45 g/L、CaCl20.5 g/L、四環素0.03 g/L，蒸餾水1 L，115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

Taq DNA聚合酶、限制性內切酶 加拿大Fermentas公司；酵母膏、胰蛋白胨、腺苷酸（5’-AMP） 美國Sigma公司；質粒小量提取試劑盒、DNA片段純化試劑盒、膠回收試劑盒 北京博大泰克生物技術公司；Ex Taq DNA聚合酶 日本TaKaRa公司；四環素、溶菌酶與RNase 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 AMPD基因的克隆

以美國國立生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）報道的鼠灰鏈霉菌（Streptomyces murinus）AMPD基因為模板，設計聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物：前端序列EcoRI：5’-TTAGAATTCGCGCCGCCGCCCCGGC AGGC-3’，末端序列KpnI：5’-TTAGGTACCTCACCCCC GGGCGTGCGCCC-3’（下劃線為EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位點）。

以已構建好的E. coli BL21（DE3）/pET28-AMPD的染色體為模板，以SE up EcoRⅠ，SE up KpnⅠ為引物進行PCR擴增。PCR擴增體系為：模板4 μL，2×GC buffer 50 μL，上下游引物各2 μL，Ex Taq 1 μL，dNTPmix 10 μL，滅菌的ddh2O 31 μL。PCR擴增條件為：96 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，30 個循環；72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳進行結果分析。PCR產物通過純化試劑盒純化后用于表達質粒的構建。

1.3 枯草芽孢桿菌WB600感受態制備

參照方煒[14]方法制備。

1.4 重組枯草芽孢桿菌表達質粒的構建

將經過EcoRⅠ-KpnⅠ線性化的載體pHY-WZX與經EcoRⅠ-KpnⅠ消化的PCR基因片段用純化試劑盒純化后，按照質量比1∶10的比例加入10 μL體系，于16 ℃培養箱連接過夜。向剛準備好的枯草芽孢桿菌wB600感受態中加入適量的質粒，輕輕混勻于37 ℃、200 r/min搖床培養2.5 h。以5 000 r/min離心3 min收集菌體，棄部分上清后留100 μL重懸菌體，涂布含有四環素的LB培養基平板，37 ℃過夜培養10 h。挑取轉化子用SE up EcoRⅠ/SE down KpnⅠ為引物進行菌落PCR，挑取菌落PCR正確的轉化子提取質粒，用EcoRⅠ-KpnⅠ酶切驗證目的基因的大小。

1.5 AMPD酶活力測定[15-16]

準確稱取13.9 mg腺苷酸溶于1 mL 0.08 mol/L的NaHCO3溶液中作為原始底物，然后用399 mL的0.1 mol/L琥珀酸-NaOH緩沖液（pH 5.9）將其稀釋400 倍，最終得到終濃度為0.1×10－3mol/L的反應底物。移取3 mL反應底物在35 ℃保溫5 min，加入預稀釋的AMP脫氨酶酶液0.1 mL，立刻計時反應15 min，15 min后加入3 mL 10 g/100 mL的過氯酸溶液終止反應。

對照組實驗方法同上，反應底物保溫后用冰水預冷，加過氯酸溶液后再加酶液。反應結束后，在265 nm波長處，用光程10 mm的石英比色皿，以水為參比測量吸光度。

酶活力單位定義：在上述條件下每分鐘吸光度改變0.001，定義為一個酶活力單位。計算公式為：

式中：ΔA265nm為反應液與對照吸光度的差值；K為粗酶液的稀釋倍數；t為酶反應時間/min。

1.6 重組菌生長曲線的測定

從平板上挑取重組枯草芽孢桿菌單菌落接種于裝有50 mL的含有四環素終質量濃度30 μg/mL的LB培養基中，37 ℃、200 r/min過夜培養。之后，以10%的接種量接種于若干裝有50 mL的含有四環素的LB培養基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養，每隔2 h取樣測OD600nm值。以時間為橫坐標，OD600nm為縱坐標作圖。

1.7 重組蛋白的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

將篩選得到的陽性枯草芽孢桿菌重組子WB600/pHYAMPD以及枯草芽孢桿菌WB600/pHY-WZX接種于50 mL LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min培養24 h，然后取發酵上清進行SDS-PAGE分析。

1.8 重組枯草芽孢桿菌搖瓶發酵研究[17-20]

1.8.1 考察不同碳源對重組菌發酵的影響

分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘油、麥芽糊精各10 g/L為碳源對重組菌進行搖瓶發酵。

1.8.2 考察不同氮源對重組菌發酵的影響

確定碳源后，分別以40 g/L的魚粉蛋白胨、酵母膏、玉米漿、牛肉膏、硫酸銨、魚粉蛋白胨+酵母膏（質量比1∶1）復合氮源替代初始發酵培養基中棉籽粉為氮源進行搖瓶發酵。

1.8.3 考察不同金屬離子對重組菌發酵的影響

在確定碳源和氮源的基礎上，分別向培養基中添加0.5 g/L的CaCl2、FeSO4·7H2O、ZnSO4、MgSO4·7H2O、MnSO4、CuSO4，以不添加任何其他金屬離子的培養基為空白對照進行搖瓶發酵。

1.8.4 考察不同質量濃度檸檬酸鹽對重組菌發酵的影響

分別向培養基中加入質量濃度分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L的檸檬酸三鈉，以不加檸檬酸三鈉的培養基為空白對照進行搖瓶發酵實驗。

1.8.5 正交試驗優化[21-23]

通過以上4 種培養基成分的探究，為了選擇出一個最佳的培養基組合，進行了四因素三水平的正交試驗。

2 結果與分析

2.1 產AMPD重組枯草芽孢桿菌的構建與表達

2.1.1 AMPD基因的克隆與分析

擴增片段的瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示，在1 100～1 700 bp中間部分有單一的擴增片段，與目的基因片段大小（1 476 bp）基本一致。

的PCR擴增結果Fig.1 PCR product of the AMPD gene圖1 AMPD 基因

2.1.2 重組表達質粒的構建與驗證

挑取陽性克隆菌的質粒經EcoRⅠ-KpnⅠ酶切驗證，如圖2所示，pHY-WZX質粒大小為6 702 bp，目的基因片段為1 476 bp，結果表明目的片段已經成功插入到pHY-WZX質粒中。

Ⅰ酶切驗證結果Fig.2 Restriction enzyme digestion of the recombinant vector pHY-AMPD by EcoRI-KpnI圖2 pHY-AMPD用EcoRⅠ-Kpn

2.1.3 重組枯草芽孢桿菌表達產物的SDS-PAGE分析

圖 3Bacillus subtilis /pHY-AMPD的SDS-PAGE蛋白電泳分析結果Fig.3 SDS-PAGE of pHY-AMPD Bacillus subtilis

如圖3所示，轉化子的發酵上清液在60 kD出現一條明顯的條帶，而對照菌株（Bacillus subtilis WB600/pHY）在該處沒有條帶。該條帶的分子質量與日本專利文獻[7]報道中的大小相吻合，說明目的基因已經得到了表達。

2.1.4 重組菌生長曲線

圖4 重組枯草芽孢桿菌WB600/pHY-AMPD生長曲線Fig.4 The gorwth curve of recombinant Bacillus subtilis WB600/pHY-AMPD

如圖4所示，0～2 h為適應期，2～12 h為對數生長期，12～17 h為穩定期，17～24 h菌體逐漸衰亡。

2.2 重組菌搖瓶發酵培養基成分的優化

2.2.1 培養基碳源的優化

圖5 不同碳源對菌體生長和酶活力的影響Fig.5 Effect of different carbon sources on the growth and AMP deaminase activity of recombinant strain

由圖5可知，各種碳源對重組菌的酶活力影響較大。其中以葡萄糖為碳源時，目標菌的酶活力水平最高，超過了1 500 U/mL。而以麥芽糊精為碳源的基礎發酵培養基酶活力為1 240 U/mL。說明在所有碳源中，葡萄糖是最有利于目標菌的產酶。同時，葡萄糖與蔗糖對細胞的生長均有明顯的促進作用，但蔗糖對目標菌的產酶相對較低。因此，培養基的碳源選擇葡萄糖。

2.2.2 培養基氮源的優化

圖6 不同氮源對菌體生長和酶活力的影響Fig.6 Effect of different nitrogen sources on the growth and AMP deaminase activity of recombinant strain

如圖6所示，無機氮源產酶能力較低且菌體生長相對較差；有機氮源更有利于促進產酶和菌體的生長。在有機氮源中，酵母膏相對來說能夠更好地促進該重組菌的生長和產酶。因此，選取酵母膏作為氮源。

2.2.3 培養基金屬離子的優化

圖7 不同金屬離子對菌體生長和酶活力的影響Fig.7 Effect of different metal ions on the growth and AMP deaminase activity of recombinant strain

如圖7所示，在0.5 g/L的質量濃度下，Ca2+對細胞生長及產酶有較大的促進作用，而其他的金屬離子則沒有表現出對目標菌的生長及產酶很好的促進作用，甚至出現了一定程度的抑制作用。而當培養基中加入Cu2+時，盡管OD600nm值很高，但是酶活水平卻很低，而酶活水平又與細胞量成正相關。因此，可能的原因是：Cu2+抑制了酶與底物的反應，或者Cu2+抑制了細胞的產酶過程。

2.2.4 檸檬酸鹽質量濃度的優化

圖8 不同質量濃度檸檬酸鹽對菌體生長和酶活力的影響Fig.8 Effect of citrate concentration on the growth and AMP deaminase activity of recombinant strain

由圖8可知，在實驗選定的檸檬酸鹽質量濃度范圍內，與空白對照組相比，細胞的生長量及酶的產量均有一定程度的提高，此結果說明，檸檬酸對目標菌的生長及產酶是有促進作用的。當檸檬酸鹽質量濃度為2 g/L時產酶活力最高，比不添加檸檬酸鹽時酶活力提高了78.8%。

2.2.5 正交試驗優化培養基配方

由表1可知，最優的培養基組合方案為：葡萄糖10 g/L、酵母膏30 g/L、CaCl20.5 g/L、檸檬酸三鈉1.0 g/L。在該培養基組合下，酶活力最高可達2 100 U/mL，相對于初始發酵培養基的酶活力（1 240 U/mL），提高了近70%。

根據正交試驗得出的最優培養基組合，進行對試驗結果的驗證實驗，以驗證該最優培養基是否能使目標菌達到菌體生長量及酶活力水平都有較大地提高。該驗證實驗中，最高酶活力在2 230 U/mL，最高OD600nm值可達到8.0，說明正交試驗得到的結論是有效的。

表1 培養基配方的正交試驗設計方案及結果Table 1 Orthogonal array design with experimental results for optimizing medium components

3 討 論

本實驗通過基因重組技術，成功地將來源于鼠灰鏈霉菌的目的基因通過克隆構建載體，轉化枯草芽孢桿菌進行表達；利用單因素和正交試驗對重組枯草芽孢桿菌搖瓶發酵培養基成分進行了研究，確定了較優培養基組成，最高酶活力可達（2 230±50） U/mL，約為原始菌株鼠灰鏈霉菌AMPD表達水平的3.7 倍（原始菌株酶活力約為600 U/mL）。利用基因重組技術構建重組菌生產的酶的活性明顯優于野生菌株，更能夠滿足AMPD未來在行業內的需求。

本實驗實現了鼠灰鏈霉菌來源的AMPD在枯草芽孢桿菌中的表達，該研究對國內通過基因重組技術生產AMPD具有一定的指導意義，但是距離工業化應用的要求還有一定的差距。后續工作將著重于生產放大工藝的研究，以期通過研究提高酶活水平，為AMPD的工業化生產提供參考。

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Expression of Adenosine Deaminase in Recombinant Bacillus subtilis

GUO Zitao, ZHANG Liang*, LI Youran, LI Ying, GU Zhenghua, DING Zhongyang, SHI Guiyang
(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, College of Biological Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Objective: To construct a recombinant strain to express adenosine deaminase (AMPD) efficiently. Methods: The AMPD gene from Streptomyces murinus was expressed in E. coli DE3/pET28α-AMPD. Specific primers were designed to amplify the AMPD gene. The PCR product was cloned into the plasmid pHY-WZX, and the recombinant plasmid was transformed into Bacillus subtilis WB600. Results: The recombinant Bacillus subtilis WB600/pHY-AMPD was successfully constructed to express AMPD. Furthermore, the fermentation medium was optimized to contain 10 g/L glucose, 30 g/L yeast extract, 0.5 g/L CaCl2, 1 g/L sodium citrate, 10 g/L NaH2PO4, 10 g/L K2HPO4, and 0.5 g/L (NH4)2SO4. The enzyme activity reached (2 230 ± 50) U/mL after shake flask cultivation at 37 ℃ for 60 h with a shaking speed of 200 r/min. Conclusion: The AMPD gene from Streptomyces murinus has been successfully expressed in Bacillus subtilis.

adenosine deaminase; Streptomyces murinus; Bacillus subtilis; recombinant expression

Q815

A

1002-6630（2015）21-0135-05

10.7506/spkx1002-6630-201521026

2014-11-26

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2011AA100905）；教育部“新世紀優秀人才支持計劃”項目（NCET-11-0665）；

江南大學食品科學與技術國家重點實驗室自由探索課題（SKLF-ZZA-201201）

郭自濤（1987—），男，碩士研究生，研究方向為發酵過程工程。E-mail：hnpygzt@163.com

*通信作者：張梁（1978—），男，教授，博士，研究方向為酶工程與技術和農業益生菌。E-mail：zhangl@jiangnan.edu.cn