河豚魚16S rRNA基因部分DNA序列分析及應用

陳文炳，翁國柱，陳融斌，繆婷玉，邵碧英，江樹勛，彭 娟

（1.福建出入境檢驗檢疫局技術中心，福建 福州 350001；2.莆田出入境檢驗檢疫局，福建 莆田 351100；3.集美大學水產學院，福建 廈門 361021）

河豚魚16S rRNA基因部分DNA序列分析及應用

陳文炳1，翁國柱2，陳融斌3，繆婷玉1，邵碧英1，江樹勛1，彭 娟1

（1.福建出入境檢驗檢疫局技術中心，福建 福州 350001；2.莆田出入境檢驗檢疫局，福建 莆田 351100；3.集美大學水產學院，福建 廈門 361021）

應用16S rRNA基因聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增通用引物，對3 屬13 種福建省搜集的河豚魚樣品與9 個未知物種的河豚魚樣品的16S rRNA基因序列中的部分片段進行PCR擴增與脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）堿基序列測定，各物種序列長度在611～614 bp之間。應用DNAMAN V6軟件進行樣品間DNA序列同源性比對分析，建立樣品間系統關系同源樹。供試13 個樣品被劃分為4 個類群組，群間的同源率為87%，群內同源率為94%～100%。根據序列同源性分析結果，9 個未知種名的樣品被歸類到3 個類群組中，推測9 個未知種名的樣品為東方鲀屬或腹刺鲀屬。探討了16S rRNA基因部分DNA序列測試及同源性分析技術在河豚魚種屬鑒別中應用的可能性。

河豚魚；聚合酶鏈式反應；16S rRNA基因；DNA測序；物種鑒定

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增技術獲得的特異性基因片段（DNA）堿基序列作為物種的特異性分子標記，在食品中動植物成分的鑒別方面已得到廣泛應用[1-3]，在食品中魚類物種成分的鑒別也有不少研究與應用[4-5]。隨著基因條形碼技術的發展，作為基因條形碼主要DNA序列的線粒體16S rRNA與細胞色素氧化酶Ⅰ（COⅠ）的基因序列分析越來越多地被應用于水產品的物種鑒別[6-10]。在河豚魚物種鑒定研究領域，陳超等[11]應用隨機擴增多態DNA（random amplification of polymorphic DNA，RAPD）標記對東方鲀屬、紅鰭東方鲀、假睛東方鲀、暗紋東方鲀和從日本引進的紅鰭東方鲀4 種河豚魚進行遺傳標記鑒別與聚類分析研究。邵愛華等[12-16]對暗紋東方鲀（Takifugu fasciatus）進行細胞色素b（Cytochrome b，Cyt b ）基因（Cyt b）及其側翼tRNA基因、線粒體細胞色素氧化酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（COⅠ、COⅡ、COⅢ）3 種亞基、16S rRNA基因進行了克隆與序列分析等一系列研究。但這些研究都只局限于東方鲀屬內。本實驗優化并建立了河豚魚成分的PCR檢測方法、對3 個屬8 個物種的河豚魚成分進行PCR方法檢測限與檢出率的實驗[17]，還對3 屬9 種河豚魚的Cyt b基因部分序列進行測定[18]，通過序列同源性分析，探討樣品間的同源性關系，并對應用PCR-限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）和芯片生物分析系統、鑒別河豚魚品種[19]與限制性內切酶、確證河豚魚成分PCR檢測結果等進行了探討[20]。

本實驗在13 個已知物種名稱的河豚魚的線粒體16S rRNA基因的部分DNA的PCR產物測序基礎上，進行DNA序列同源性比對分析、建立樣品間的系統關系樹、并將9 個未知種名的河豚魚樣品16S rRNA基因的部分DNA的序列與13 個已知物種名稱的樣品進行同源性比對分析、推測其種屬劃分，為16S rRNA基因的部分DNA序列測試及同源性分析技術在河豚魚物種鑒別中的應用提供科學依據，也為基因條形碼技術在河豚魚物種成分鑒定中的應用研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

13 個已知物種名稱的河豚魚樣品來自福建省集美大學水產學院近海捕撈與廈門、莆田等水產養殖場；未知物種名稱的5 個河豚魚干樣品來自福建福州沿海，4 個新鮮個體來自海南省?？谑校ū?）。

表1 13個已知種名與9 個未知種名的河豚魚供試樣品Table 1 The samples from 13 species and 9 unknown species of puffer fish tested in this study

1.2 試劑與儀器

十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB） 上海博亞生物技術有限公司；2×Taq PCR Master Mix、蛋白酶K、DNA MarkerⅠ 天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖 英國Oxoid公司；16S rRNA基因PCR擴增通用引物[21]序列：正向L2510-16S：5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’，反向H3059-16S：5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

Ultrospec 1100 pro核酸蛋白分析儀 瑞典Amersham公司；T-Gradient梯度PCR儀 德國Biometra公司；Power Pac 1000電泳儀 美國Bio-Rad公司；GL212 PRO凝膠成像儀 美國Carestream公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取與PCR擴增

用CTAB裂解DNA提取方法[17]，以個體為測試樣品進行DNA提取、PCR產物電泳。PCR擴增體系為20 μL體系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），DNA模板量2 μL（200 ng/μL），雙蒸水（ddH2O）6 μL；擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，反應循環35 次；最后72 ℃延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后浸于0.2% EB溶液中染色45 min，用清水漂洗，最后置于凝膠成像系統下觀察結果，并拍照保存。

1.3.2 DNA堿基序列測定

用通用引物對所有收集到的共13 個河豚魚種與9 個未知名的河豚魚干樣品（表1）進行PCR擴增。PCR擴增產物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行克隆、測序，每個樣品重復3 次，選用最有代表性的序列。得到的結果用DNAMAN V6進行整理分析，以.seq格式輸出。

1.3.3 序列比對與同源性分析

本研究利用DNAMAN V6對各個樣品所測序列進行堿基序列比對與同源性分析，比對結果以MASED Document/DNAMAN1格式輸出。

2 結果與分析

2.1 部分河豚魚的16S rRNA基因PCR擴增

從13 種河豚樣品與9 個未知學名的河豚魚干樣品中提取的DNA，進行16S rRNA基因的PCR擴增，部分樣品結果如圖1。結果表明供試22 個樣品的DNA PCR擴增是成功的，PCR產物用于序列測定。

圖1 部分河豚魚的16S rRNA基因 PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification of 16S rRNA gene in puffer fish

2.2 PCR產物測序結果與序列比對

2.2.1 各樣品序列的堿基基本信息

提供各樣品PCR擴增產物3 個重復，經過克隆、測序，根據兩端引物序列，進行整理，各樣品測序結果如有差異，則選取有代表性的序列，用于結果分析，并向美國國家生物技術信息中心（The National Center for Biotechnology Information，NCBI）基因銀行（GenBank）提交。13 個已知物種名稱的樣品序列的基本信息統計分析結果與GenBank登錄號見表2。

表2 PCR產物堿基序列的基本信息Table 2 Basic information about base sequences of PCR products

從表2可以看出，不同物種的河豚魚的PCR擴增產物長度在611～614 bp之間，從A、C、G、T 4 種堿基的含量來看，A含量最高，在29.3%～30.5%， 其次是C與T，含量分別在23.5%～24.8%與22.9%～24.8%，G含量較低，在21.7%～23.4%之間。從各樣品4 個堿基含量差異來看，黃鰭東方鲀、暗鰭腹刺鲀、月腹刺鲀、雙斑東方鲀、菊黃東方鲀、鉛點東方鲀6 個種的G含量最低，均在22%以下，與各自A的含量相差8%以上。黃鰭東方鲀、紅鰭腹刺鲀、雙斑東方鲀、菊黃東方鲀、鉛點東方鲀5 個種所含堿基數均為614 個； 暗紋東方鲀、棕斑腹刺鲀、橫紋東方鲀3 個種的堿基數最少，為611 個；暗鰭腹刺鲀堿基數為613 個；黑腮兔頭鲀、兔頭鲀、月腹刺鲀、蟲紋東方鲀堿基數均為612 個。

2.2.2 已知物種樣品DNA測序與序列比對分析

已知種名的河豚魚樣品PCR產物的DNA測序以.seq格式輸出，再以DNAMAN V6軟件進行比對，分析結果以MASED Document/DNAMAN1格式輸出（圖略）。從結果可知：4、6、10～12號（樣品序號與表1同）等5 個樣品的第39號堿基缺失；3、5、9號等3 個樣品的第296號堿基缺失；1～3、5、7～9、13號等8 個樣品的第388號與438～439號堿基均缺失；除了3 個片段（位置處在約第30～40號、第272～294號、第423～39號堿基）有明顯的變異外，其余差異多是個別堿基的置換，可見供試河豚魚物種間的分化主要源于堿基缺失、插入、置換等遺傳變異。

圖2 13個已知種樣品的PCR產物序列同源樹Fig.2 Phylogenetic tree based on sequence homology among 13 species known samples

基于DNA序列分析結果，建立的PCR產物序列同源樹（圖2）表明，13 個已知物種的樣品PCR擴增片段的序列整體同源率為87%（樣品號與表1同），表明盡管13 個種樣品的來源于四齒鲀科（Tetraodontidae）的兔頭鲀屬（Lagocephalus）、腹刺鲀屬（Gastrophysus）與東方鲀屬（Takifugu）3 個不同的屬，其保守的16S rRNA基因序列同源性仍然較高，13 個樣品可劃分為4組（圖2），其中Ⅰ組含1號（黑腮兔頭魨）、2號（兔頭魨）、13號（蟲紋東方鲀）3 個樣品，堿基數均為612 個；Ⅱ組含3號（暗紋東方鲀）、5號（棕斑腹刺鲀）、9號（橫紋東方鲀）3個樣品，堿基數均為611 個；Ⅲ組含7號（暗鰭腹刺鲀）與8號樣品（月腹刺鲀）2 個樣品，堿基數為613與612 個；Ⅳ組含4號（黃鰭東方鲀）、6號（紅鰭東方鲀）、10號（雙斑東方鲀）、11號（菊黃東方鲀）、12號（鉛點東方鲀）5 個樣品，堿基數均為614 個。可見DNA序列的堿基個數與物種同源性有一定的關系。前3組間同源性為94%，各組內同源率在98%～100%。Ⅳ組內5 個樣品之間的同源率為99%～100%，Ⅳ組與其余3組間的同源率為87%。

2.3 應用序列同源性分析推測未知樣品物種歸屬

圖3 22個樣品的序列同源樹Fig.3 Phylogenetic tree based on sequence homology among 22 samples

9 個未知種名的樣品（序列未出示）與13 個已知種樣品序列經DNAMAN V6軟件的同源性比對分析，獲得同源性矩陣（略）與同源樹（圖3）。聚類結果表明：與圖2相同，22 個樣品序列可劃分為4組，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組之間同源率為94%，它們與Ⅳ組之間的同源率為86%。第Ⅰ組與圖3相同，海南未知樣品HNW2歸到Ⅱ組，因與7號樣品（暗鰭腹刺魨）同源率為99%，與8號樣品（月腹刺魨）同源率為100%，推測該未知樣品可能是腹刺魨屬河豚魚；有3 個福建未知種名河豚魚樣品（FJW2、FJW3、FJW5）和3個海南未知種名河豚魚樣品（HNW1、HNW3、HNW4）歸到Ⅲ組，因為與3號暗鰭東方鲀、5號棕斑腹刺魨、9號橫紋東方鲀的同源率在97%以上，故推測該6 個樣品可能是東方鲀屬或腹刺鲀屬；福建未知種名樣品FJW1與FJW4歸到第Ⅳ組，與4號（黃鰭東方鲀）、6號（紅鰭東方鲀）、10號（雙斑東方鲀）、11號（菊黃東方鲀）、12號（鉛點東方鲀）5 個樣品的同源率為98%以上，推測該2種樣品為東方鲀屬河豚魚。

3 結論與討論

運用生物信息學專業軟件DNAMAN V6，比對分析了河豚魚16S rRNA部分片段PCR擴增產物序列。13 個已知物種名稱的樣品序列經DNAMAN V6軟件的同源性分析，獲得同源樹，把13 個樣品序列劃分為4 組，各組內樣品間同源率均為94%～100%，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組之間的同源率為94%，它們與Ⅳ組間同源率為87%。圖2表明，1號黑腮兔頭魨與2號兔頭魨、7號暗鰭腹刺鲀與8號月腹刺鲀分別歸為一類，與形態學分類吻合。應用同源性分析推斷9 個未知種屬名稱的河豚魚樣品可能所屬的分類單位（屬）。序列比對分析發現，河豚魚物種間的分化主要源于堿基缺失、插入、置換等遺傳變異結果。但是，本研究結果發現基于序列同源性分析的類群劃分與形態學分類不完全吻合，原因可能是形態學分類存在瑕疵，比如同種異名或同名異種的情況，這些情況在動植物系統分類學領域時有發生；也可能是16S rRNA序列趨向保守，一定種群內遺傳變異較小，加上所獲得基因信息有限，因而還無法具體鑒定到河豚魚的物種。理論上，動植物分類標記信息包括形態學與分子遺傳學標記的信息量越大，其分類定位越接近實際情況。因此，盡管16S rRNA序列趨向保守，一定種群內遺傳變異可能較小，但作為重要的分子標記與遺傳信息，對河豚魚等水生生物的親緣關系與分類的研究探討，無疑有積極的作用[11,16,18]。當然，為了進一步判別到具體的物種，還須通過線粒體的其他基因如Cyt b、COⅠ和核糖體基因18S/28S rDNA等片段的測序，建立DNA條形碼數據庫，應用多種基因序列組合互相彌補缺陷，達到精準鑒別河豚魚物種成分的目的。

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Partial DNA Sequence Analysis of 16S rRNA Gene in Puffer Fish

CHEN Wenbing1, WENG Guozhu2, CHEN Rongbin3, MIAO Tingyu1, SHAO Biying1, JIANG Shuxun1, PENG Juan1
(1. Inspection and Quarantine Technology Center, Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001, China; 2. Putian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Putian 351100, China; 3. Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China)

Partial fragments of the 16S rRNA gene of puffer fish from 13 species belonging to 3 genus collected from Fujian province and 9 samples from unknown species were amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the universal 16S rRNA gene primers. The PCR products were sequenced, and the length of the obtained DNA fragments were 611-614 bp in all samples. The homology of DNA sequences among samples was analyzed with the DNAMAN V6 software, and the phylogenetic tree among samples was established. Thirteen samples were divided into 4 groups, with a homology of 87% among groups and 94%-100% between any two samples within the same group. Nine samples of unknown puffer fish species were classed into 3 groups which belonged to the Gastrophysus or Takifugu genus. The results obtained in this study can provide references for the application of 16S rRNA gene sequencing and homological analysis to identify puffer fish at genus and species levels.

puffer fish; polymerase chain reaction; 16S rRNA gene; DNA sequencing; species identification

S917.4；Q78

A

1002-6630（2015）21-0140-05

10.7506/spkx1002-6630-201521027

2015-06-30

國家質量監督檢驗檢疫總局科技計劃項目（2013IK149）

陳文炳（1962—），男，研究員，博士，研究方向為農產品、食品分子生物學檢測技術。E-mail：621213wbc@163.com