芫荽酸性磷酸酶的提取、純化及酶學性質研究

王 丹，萬 驥，傅 婷，唐云明

（西南大學生命科學學院，淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室，三峽庫區生態環境教育部重點實驗室，重慶 400715）

芫荽酸性磷酸酶的提取、純化及酶學性質研究

王 丹，萬 驥，傅 婷，唐云明*

（西南大學生命科學學院，淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室，三峽庫區生態環境教育部重點實驗室，重慶 400715）

采用硫酸銨分級沉淀、CM-Sepharose離子交換層析、Superdex-200凝膠過濾層析法，從新鮮芫荽中分離純化出電泳純的酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）。該酶的酶活回收率為14.20%、純化倍數為238.60、酶比活力為295.87 U/mg、亞基分子質量約為53.8 kD；芫荽ACP酶學性質研究結果表明：該酶的最適反應溫度為55 ℃，在50 ℃以下時較穩定，因此該酶對溫度較敏感；該酶的最適反應ph值為5.8，在ph 4.0～7.0之間較穩定，表明該酶耐受于酸性環境；芫荽ACP的對硝基苯酚磷酸二鈉Km值為0.63 mmol/L，表明該酶與底物對硝基苯酚磷酸二鈉具有較高的親和力；甲醇、乙醇、異丙醇、抗壞血酸、草酸、Cu2+、Pb2+、Ag+對該酶具有強烈的抑制作用；Mg2+、Mn2+、Ba2+、K+對該酶具有一定的激活作用。

芫荽；酸性磷酸酶；分離純化；酶學性質

芫荽（Coriandrum sativum L.），俗稱香菜，是傘形科一年生或二年生草本植物，常用作調味品，具有藥用價值和豐富的營養價值[1]。酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）是一類在酸性條件下催化磷酸單酯水解生成無機磷酸的巰基酶，廣泛存在于動植物、微生物體內以及人類的肝臟、前列腺等器官中[2]，是調控生物體中磷代謝的重要酶類[3]。ACP不僅參與了生物體的生長與代謝調節、信號轉導途徑，也可增強植物對缺磷、干旱、低溫、水分、鹽分等逆境的抗性；該酶可作為檢測土壤重金屬污染度的指標，重金屬汞、銅、鋅引起酶分子色氨酸、酪氨酸殘基微環境產生變化，使酶活性中心的構象發生改變，進而對酶的催化活性產生影響[4-5]；該酶還可以作為食品及飲料的添加劑[6]；ACP也可以用來檢測蛋白質類食品中的微生物指標，通過對食品中ACP活性的變化判斷其被細菌污染的程度，從而保障食品安全[7]。因此，該酶在多個領域中均具有應用價值。目前，已有關于不同來源ACP的研究報道，江琰等[8]從意大利蜂工蜂體內分離提純出ACP，并對其氨基酸組成成分進行了分析；楊立紅等[9]從草魚肝臟中提取出ACP，并研究了多種金屬離子對其酶活性的影響；張國慶等[10]以樹狀多節孢為材料，研究了ACP的理化性質及生物學特性。本實驗選取芫荽為材料，從中分離純化出ACP，并對其酶學性質進行研究，旨在為從植物中提取ACP提供理論參考，為進一步對農作物進行遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮芫荽，購于重慶北碚永輝超市。

Superdex-200、CM-Sepharose、蛋白質十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）標準品與凝膠過濾分子質量標準品 美國GE Healthcare公司；甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺 瑞士Fluka公司；考馬斯亮藍R-250 美國Bio-Rad公司；牛血清白蛋白 美國Sigma公司；對硝基苯酚磷酸二鈉（p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate，PNPP） 美國Amresco公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 芫荽ACP粗酶液的制備

取新鮮芫荽嫩葉，用去離子水洗凈，用吸水紙擦干，稱取45 g并剪碎，按1∶3（m/V）的比例加入預冷的50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（ph 5.0，內含2 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、10 mmol/L β-巰基乙醇、5 mmol/L MgSO4，下同），勻漿后，4 ℃冰箱中靜置抽提3 h，經紗布過濾后濾液在4 ℃條件下10 000 r/min離心40 min，收集上清液，即為芫荽ACP粗酶液。

1.2.2 硫酸銨分級沉淀

向芫荽ACP粗酶液中加入硫酸銨至30%飽和度，4 ℃冰箱中靜置3 h，10 000 r/min離心40 min，收集上清液，再向其中加入硫酸銨至60%飽和度，4 ℃冰箱中靜置3 h，10 000 r/min離心40 min，棄上清液；沉淀用50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液完全溶解，于4 ℃條件下透析24 h后3 000 r/min離心10 min，收集上清液即為初步純化的芫荽ACP酶液。

1.2.3 CM-Sepharose離子交換層析

CM-Sepharose離子交換層析柱經50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（ph 5.0，內含10 mmol/L β-巰基乙醇）平衡后，取10 mL初步純化后的芫荽ACP酶液上樣，用0～1 mol/L的NaCl溶液（由50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液配制，ph 5.0，內含10 mmol/L β-巰基乙醇）進行線性梯度洗脫，流速為0.5 mL/min，每管收集5 mL，紫外檢測波長為280 nm。測定各管ACP的酶活力和蛋白質含量，收集活性較高的酶液。

1.2.4 Superdex-200凝膠過濾層析

Superdex-200凝膠層析柱經50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（ph 5.0，內含10 mmol/L β-巰基乙醇）平衡后，取經離子交換層析后所收集的活性較高的酶液上樣，每次5 mL，用50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（ph 5.0，內含10 mmol/L β-巰基乙醇）進行洗脫，流速為0.5 mL/min，每管收集3 mL。測定各管ACP的酶活力和蛋白質含量，收集活性較高的酶液，4 ℃條件下透析24 h，冷凍干燥后，得到ACP純品，置于－20 ℃冰箱保存，用于電泳及酶學性質研究。

1.2.5 芫荽ACP純度鑒定及分子質量測定

通過SDS-PAGE對凝膠過濾層析后獲得的ACP進行純度鑒定，分別制備質量分數為5%的濃縮膠和12%的分離膠，上樣量為10 μL，經SDS-PAGE和凝膠過濾層析分別測定芫荽ACP的亞基分子質量和全酶分子質量[11]。

1.2.6 芫荽ACP活力的測定

芫荽ACP活力測定方法參照文獻[12]略有改進：體系包含1 mL 5 mmol/L PNPP、1 mL 10 mmol/L MgSO4、3 mL 0.2 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（ph 5.2，內含5 mmol/L β-巰基乙醇）、100 μL酶液；混勻后，于35 ℃條件下反應10 min后加入2.5 mL 0.2 mol/L NaOH終止反應。以滅活的酶液代替原酶液做為對照調零，在420 nm波長處測定吸光度。根據對硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP）標準曲線[12]計算產物生成量。酶活力單位（U）定義為在以上反應條件下，每10 min催化底物PNPP水解生成1 μmol對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活力單位。

1.2.7 芫荽ACP蛋白質含量測定

采用紫外分光光度法和考馬斯亮藍染色法（Bradford法）對芫荽ACP的蛋白質含量進行測定[11]。

1.2.8 芫荽ACP酶學性質研究

1.2.8.1 最適反應ph值和ph值穩定性

將反應體系中的緩沖液替換為不同ph值（3.0、4.0、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、7.0、8.0）的緩沖液，其他條件均保持一致，測定芫荽ACP酶活力，以酶活力最高值為100%，計算其他各ph值條件下的相對酶活力，以確定芫荽ACP的最適反應ph值。將純化后的芫荽ACP酶液分別置于不同ph值（3.0、4.0、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、7.0、8.0）的緩沖液中靜置4 h后，測定芫荽ACP的酶活力，以酶活力最高值為100%，計算其他各ph值條件下的相對酶活力，以研究該酶的ph值穩定性。

1.2.8.2 最適反應溫度與熱穩定性

在不同反應溫度 （20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85 ℃）條件下，其他條件均保持一致，測定芫荽ACP的酶活力，以酶活力最高值為100%，計算其他溫度條件下的相對酶活力，以確定芫荽ACP的最適反應溫度。將純化后的芫荽ACP酶液分別置于不同溫度（20、30、40、50、60、70 ℃）條件下保溫不同時間后，測定芫荽ACP的酶活力，以酶液不保溫時的酶活力為100%，計算不同反應溫度條件下的相對酶活力，以研究該酶的熱穩定性。

1.2.8.3 米氏常數（Km）的測定

配制不同濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mmol/L）的PNPP，在55 ℃、ph 5.8的條件下測定芫荽ACP的酶活力，采用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法[13]計算出芫荽ACP的Km值。

1.2.8.4 不同有機溶劑對芫荽ACP活性的影響

將體積分數為10%、20%、30%、40%、50%的甲醇、乙醇、異丙醇和純化后的芫荽ACP酶液等體積混合，于4 ℃冰箱中靜置1 h，測定酶活力，以酶液中不加有機溶劑時的活力為100%，計算在不同條件下，芫荽ACP的相對酶活力。

1.2.8.5 不同金屬離子對芫荽ACP活性的影響

將11 種不同濃度（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L）的金屬離子溶液和純化后的芫荽ACP酶液等體積混合后，于4 ℃冰箱中靜置1 h，測定酶活力，以酶液中不加金屬離子時的活力為100%，計算在不同條件下芫荽ACP的相對酶活力。

1.2.8.6 不同化合物對芫荽ACP活性的影響

將不同濃度（10、20、30、40、50 mmol/L）的EDTA、草酸、尿素、抗壞血酸和純化后的芫荽ACP酶液等體積混合，于4 ℃冰箱中靜置1 h，測定酶活力，以酶液中不加化合物時的活力為100%，計算在不同條件下，芫荽ACP的相對酶活力。

2 結果與分析

2.1 芫荽ACP的分離純化結果

圖1 芫荽ACP的CM-Sepharose離子交換層析結果Fig.1 CM-Sepharose ion-exchange chromatography of ACP from cilantro

芫荽ACP粗酶液經CM-Sepharose離子交換層析以及Superdex-200凝膠過濾層析后，結果如圖1、2所示，經過CM-Sepharose離子交換層析后，酶活性較高的峰主要集中在第38～46管，其中第42管的酶活力最高；由圖2可知，經過Superdex-200凝膠過濾層析后，酶活性較高的峰主要集中在第31～37管，其中第33管酶活力最高；收集酶活性較高的各管酶液；經透析、冷凍干燥及濃縮后上樣SDS-PAGE檢測，顯示為單一條帶（圖3），表明芫荽ACP達到了電泳純；該酶的整個純化過程及其結果如表1所示，最終得到芫荽ACP純品的酶比活力為295.87 U/mg、酶活回收率為14.20%、純化倍數為238.60 倍。

圖2 芫荽ACP的Superdex-200凝膠過濾層析結果Fig.2 Superdex-200 chromatography of ACP from cilantro

圖3 芫荽ACP的SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE of ACP from cilantro

表1 芫荽ACP的純化結果Table 1 Purification of ACP from cilantro

2.2 芫荽ACP的分子質量

經過SDS-PAGE測得芫荽ACP的亞基分子質量約為53.8 kD，經過Superdex-200凝膠層析測得其全酶分子質量約為56.2 kD（圖4），由此可推測芫荽ACP為單亞基酶。

圖4 Superdex-200凝膠過濾層析測得芫荽ACP全酶分子質量Fig.4 Molecular weight estimation of ACP by Superdex-200 gel filtration chromatography

2.3 芫荽ACP的酶學性質

2.3.1 芫荽ACP的最適反應ph值和ph值穩定性

圖5 芫荽ACP的最適pH值和pH值穩定性Fig.5 Effect of pH on the activity of ACP from cilantro and its pH stability

如圖5A所示，在ph 5.0～6.0之間，芫荽ACP具有較高的活力，當ph值為5.8時，芫荽ACP活力最高，因此，該酶的最適ph值為5.8；當ph值小于3.0和大于8.0時，芫荽ACP幾乎完全失活。其原因可能是過高或過低的ph值會影響酶分子側鏈上極性基團以及帶電狀態，從而導致該酶活性中心構象發生改變；影響酶與底物的結合，因為當酶催化底物反應時，底物分子上的某些基團需處于一定的解離狀態，而ph值的改變抑制了這些基團的解離，從而使酶的催化速率急劇降低[14]。如圖5B所示，芫荽ACP在ph 4.0～7.0范圍內放置4 h后，依然保持了較高的活性，這表明芫荽ACP耐受酸性環境。

2.3.2 芫荽ACP的最適反應溫度與熱穩定性

如圖6A所示，芫荽ACP在20～55 ℃之間，酶活力隨著溫度的升高而增大，當溫度為55 ℃時，芫荽ACP活力最高，當溫度高于55 ℃后，酶活力逐漸降低，因此，該酶的最適反應溫度為55 ℃，在50～70 ℃范圍內，芫荽ACP活力均保持較高水平（90%左右）。如圖6B所示，將芫荽ACP在不同的溫度體系中保溫不同時間，隨著保溫時間的延長，芫荽ACP均表現出活力減小的趨勢，在20～50 ℃范圍內，保溫2 h后芫荽ACP活力均保持在50%以上；在60 ℃體系中保溫2 h后，芫荽ACP活力幾乎完全喪失；當溫度超過60 ℃時，芫荽ACP活力急劇下降，1 h之內活力完全喪失。原因是該酶在適當的溫度條件下會降低反應的活化能，從而提高反應速率，然而酶的本質是具有催化功能的蛋白質，所以過高的溫度會使酶蛋白分子的天然構象被破壞，導致酶分子變性，從而催化功能喪失[15]，由此可推斷，該酶對溫度較敏感，在50 ℃以下時較穩定。

圖6 芫荽ACP的最適溫度和熱穩定性Fig.6 Effect of temperature on activity of ACP from cilantro and its thermal stability

2.3.3 芫荽ACP的米氏常數

圖7 雙倒數法測得芫荽ACP的米氏常數Fig.7 Kmof ACP from cilantro estimated by Lineweaver-Burk plot

如圖7所示，芫荽ACP的Km值為0.63 mmol/L，表明該酶在反應過程中，與底物PNPP具有較高的親和力。

2.3.4 不同有機溶劑對芫荽ACP活性的影響

圖8 不同有機溶劑對芫荽ACP活力的影響Fig.8 Effects of various organic solvents on the activity of ACP from cilantro

如圖8所示，隨著有機溶劑甲醇、乙醇、異丙醇體積分數的增加，芫荽ACP活力均出現下降趨勢，主要原因可能是芫荽ACP與底物的接觸受到擴散限制的影響；酶分子的構象主要由靜電作用力、范德華力、疏水作用以及氫鍵構成一個復雜的網絡來維持，有機溶劑缺乏提供多種氫鍵的能力，而且由于它們的低介電常數往往會導致蛋白質帶電基團之間更強的靜電作用，因而酶在有機溶劑中活性較低[16]。

2.3.5 不同金屬離子對芫荽ACP活性的影響

圖9 不同金屬離子對芫荽ACP活力的影響Fig.9 Effects of various metal ions on the activity of ACP from cilantro

如圖9所示，在不同濃度條件下，同一種金屬離子和不同金屬離子對芫荽ACP均表現出不同的作用結果。Mg2+、Mn2+、Ba2+、K+對該酶具有一定的激活作用，且隨著濃度的增加，激活作用越顯著，主要原因可能是這4 種金屬離子在酶與底物之間起到了橋梁的作用，形成了酶-金屬離子-底物的三元復合物，從而更有利于底物與酶活性中心的結合；Li+、Co2+、Ca2+、Cd2+隨著其濃度的增加，對該酶的抑制作用越顯著，主要原因可能是這些金屬離子影響了酶的空間結構，從而使酶活性降低；Cu2+、Pb2+、Ag+對該酶具有強烈的抑制作用，原因可能是這3 種重金屬離子破壞了酶的二級結構或者與酶形成了絡合物，從而導致該酶變性失活。

2.3.6 不同化合物對芫荽ACP活性的影響

圖10 不同化合物對芫荽ACP活力的影響Fig.10 Effects of various compounds on the activity of ACP from cilantro

如圖10所示，低濃度的EDTA對芫荽ACP活性具有激活作用，但當EDTA濃度超過10 mmol/L時，對該酶開始表現出抑制作用，原因可能是EDTA是一種金屬螯合劑，高濃度時會螯合對該酶的催化活性具有促進作用的Mg2+，從而導致芫荽ACP活性的降低；尿素對該酶的抑制作用較弱；抗壞血酸對該酶具有較強的抑制作用；草酸對該酶具有強烈的抑制作用，當濃度達到40 mmol/L時，該酶的活性已經完全喪失。

3 討 論

本實驗選取的材料為新鮮芫荽，經過一系列的純化過程從中分離純化出了ACP。在純化過程中，由于經過CM-Sepharose離子交換層析后所收集到的酶液活性較高，未經冷凍干燥即可直接上Superdex-200凝膠過濾層析柱，實驗步驟更為簡便，同時減少了酶活力的損失，酶活回收率達到14.20%，高于綠豆（4%）[12]、韭菜（10.5%）[17]及甘薯葉（3.5%）[18]中的ACP酶活回收率；純化倍數達238.60，高于綠豆（156.3 倍）[12]，甘薯葉（169.07 倍）[18]中的ACP純化倍數。

芫荽ACP的亞基分子質量為53.8 kD，與斑玉蕈（65 kD）[19]、韭菜（58.97 kD）[17]中的ACP亞基分子質量相接近，但低于海參（147.9 kD）[20]、蚯蚓（113 kD）[21]和意大利蜂工蜂（135 kD）[8]中的ACP亞基分子質量，這表明來源不同的ACP分子結構具有物種特異性；芫荽ACP對PNPP的Km值為0.63 mmol/L，高于草魚（0.232 mmol/L）[9]與甘薯葉（0.258 mmol/L ）[18]中ACP的Km值，接近于韭菜（0.896 mmol/L）[17]和背角無齒蚌（0.73 mmol/L）[22]中ACP的Km值，這表明不同來源的ACP對底物的親和力具有一定的差異性，可能是因為生物體為了更好地適應環境以及滿足生長代謝的需求，從而產生出了多種ACP同工酶[17]。

芫荽ACP的最適反應ph值為5.8，與綠豆和甘薯葉（ph 5.2）[12,18]、洋蔥（ph 5.7）[23]、韭菜（ph 5.4）[17]、麥芽（ph 5.0）[24]中的ACP最適反應ph值相近，高于刺參（ph 4.4）[25]、背角無齒蚌（ph 4.8）[22]和樹狀多節孢（ph 3.0）[10]中的ACP最適反應ph值，這表明不同來源的ACP對ph值的適應性具有一定的差異，且通過對芫荽ACP的ph值穩定性研究發現其對酸堿具有較廣的耐受范圍；該酶的最適反應溫度為55 ℃，低于韭菜和甘薯葉（65 ℃）[17-18]中ACP的最適反應溫度，高于綠豆（40 ℃）[12]、草魚和刺參（45 ℃）[9,25]、背角無齒蚌（50 ℃）[22]中的ACP最適反應溫度，且通過對芫荽ACP的熱穩定性研究發現其對溫度的敏感性較強。

本研究表明，不同的金屬離子對芫荽ACP的活性有不同的影響：Mg2+、Mn2+、Ba2+、K+對芫荽ACP具有一定的激活作用，與文獻報道中草魚ACP[9]、仿刺參ACP[26]以及甘薯葉ACP[18]一致；Li+、Co2+、 Ca2+、Cd2+對該酶的具有一定的抑制作用；Cu2+、Pb2+、Ag+對該酶具有強烈的抑制作用，且在低濃度時就已導致該酶完全失活，與斑玉蕈ACP[19]以及海參ACP[20]相符；而在關于洋蔥[23]和黑綠豆[27]ACP的報道中，Mg2+對其具有抑制作用，這表明同一種金屬離子對不同物種來源的ACP活性有著不同的影響。

通過對芫荽ACP與來源于不同動植物組織中的ACP進行比較后，發現ACP在酶學性質上存在一定的差異性，可能是因為不同物種中的ACP會隨著生物體組織器官代謝環境的變化而變化，以滿足不同的生長代謝需求以及更好地參與動植物體內生理功能的調節過程，這是生物體在自然選擇過程中基因選擇性表達的結果。

[1] 劉香榮, 魯海波, 朱海泉, 等. 芫荽的研究進展[J]. 中國調味品, 2012, 37(6): 17-19.

[2] SCHENK G, GUDDAT L W, GE Y, et al. Identification of mammalian-like puple acid phosphatases in a wide range of plants[J]. Gene, 2000, 250(1/2): 117-125.

[3] MACDONALD K. The hydrolysis of phenyl phosphate by mouseliver acid phosphatase[J]. Biochemical Journal, 1961, 80(1): 154-161.

[4] MILLER S S, LIU J, ALLAN D L, et al. Moleular control of acid phosphatase secretion into the rizosphere of proteoid roots from phosphorus-stressed white lupin[J]. Plant Physiology, 2001, 127(2): 594-606.

[5] 徐冬梅. 土壤酸性磷酸酶性質及汞、銅、鋅對其影響的機理研究[D].杭州: 浙江大學, 2003: 16-19.

[6] 吳應文. 大麥芽中酸性磷酸酯酶的分離[J]. 甘肅科學學報, 1991(4): 69-71.

[7] 吳信法. 酶和食品品質的指示[J]. 肉品衛生, 1994(11): 30-31.

[8] 江琰, 劉克武, 楊守忠, 等. 意蜂工蜂酸性磷酸酶的分離純化及動力學研究[J]. 四川大學學報: 自然科學版, 2001, 38(5): 776-780.

[9] 楊立紅, 肖波, 王曉潔, 等. 草魚酸性磷酸酯酶的性質及金屬離子對其活性的影響[J]. 中國水產科學, 2010, 17(5): 970-976.

[10] 張國慶, 王有志, 王守現, 等. 樹狀多節孢酸性磷酸酶的分離純化與性質研究[J]. 菌物學報, 2011, 30(5): 753-759.

[11] 李建武, 余瑞元. 生物化學實驗原理和方法[M]. 北京: 北京大學出版社, 1994: 71-223.

[12] 高亞鵬, 蘇茉, 梁建榮, 等. 綠豆酸性磷酸酶的分離純化和部分性質研究[J]. 中國糧油學報, 2011, 26(5): 92-96.

[13] 陳鈞輝, 陶力, 朱婉華, 等. 生物化學實驗[M]. 北京: 科學出版社, 2004: 92-93.

[14] SUDhARShAN E, SRINIVASULU S, RAO A G A. ph-induced domain interaction and conformational transitions of lipoxygenase-1[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology, 2000, 1480(1/2): 13-22.

[15] 何立超, 趙見營, 田甜, 等. 櫻桃谷鴨胸肉脂肪氧合酶的分離純化及其酶學特性研究[J]. 食品科學, 2013, 34(7): 166-170. doi: 10.7506/ spkx1002-6630-201307035.

[16] 彭立鳳. 有機溶劑對酶催化活性和選擇性的影響[J]. 化學進展, 2000, 12(3): 296-304.

[17] 孫芳, 任美鳳, 胡瑞斌, 等. 韭菜酸性磷酸酶的分離純化及酶學性質[J].食品科學, 2013, 34(17): 187-191. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201317040.

[18] 李星, 王潔, 王紅揚, 等. 甘薯葉酸性磷酸酶的分離純化及部分性質和功能基團的研究[J]. 食品科學, 2015, 36(3): 152-157. doi: 10. 7506/spkx1002-6630-201503029.

[19] 楊立紅, 高興喜, 繆靜, 等. 斑玉蕈酸性磷酸酯酶的酶學性質研究[J].菌物學報, 2011, 30(5): 744-752.

[20] ZHU Beiwei, YU Jianwei, ZHANG Zongshen, et al. Purification and partial characterization of anacid phosphatase from the body wall of sea cucumber Stichopus japonicus[J]. Process Biochemistry, 2009, 44: 875-879.

[21] STUBBERUD H E, H?NSI T G, STENERSEN J. Purification and partial characterisation often tatively classified acid phosphatase from the earthworm Eisenia veneta[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2000, 126: 487-494.

[22] 魏煒, 張洪淵, 石安靜. 背角無齒蚌酸性磷酸酶的分離、純化及部分性質研究[J]. 四川大學學報, 1999, 36(3): 570-572.

[23] GUO Jie, ThOMAS C. Purification and characterization of an acid phosphatase from the bulb of Allium cepa L. var. sweet spanish[J]. Journal of Plant Physiology, 1997, 151: 520-527.

[24] 陸珊. 麥芽酸性磷酸酶的部分性質研究[D]. 成都: 四川大學, 2006: 9. [25] 楊立紅, 孫振興, 王曉潔, 等. 刺參酸性磷酸酯酶的分離純化及部分性質研究[J]. 食品科學, 2008, 29(10): 441-442.

[26] 于建偉, 李冬梅, 李吉龍, 等. 仿刺參酸性磷酸酶的提取及粗酶性質研究[J]. 水產科學, 2009, 28(1): 6-7.

[27] ASADUZZAMAN A K M, RAHMAN H M, YEASMIN T. Purification and characterization of acid phosphatase from a germinating black gram (Vigna mungo L.) seedling[J]. Archives of Biological Sciences, 2011, 63(3): 747-756.

Isolation, Purification and Characterization of Acid Phosphatase from Cilantro

WANG Dan, WAN Ji, FU Ting, TANG Yunming*
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development, Ministry of Education, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Electrophoresis-purity acid phosphatase (ACP) from cilantro was obtained by homogenization, buffer solution extraction, ammonium sulfate fractional precipitation, CM-Sepharose ion exchange chromatography and Superdex-200 gel filtration. The results showed that after purification the recovery rate of ACP activity was 14.20% with a purification fold of 238.60, and the specific activity of ACP was 295.87 U/mg. The subunit molecular mass of the enzyme was approximately 53.8 kD. The characterization of ACP illustrated that the optimal reaction temperature was 55 ℃, and it was stable in the range of 20–50 ℃. Therefore, the enzyme was sensitive to temperature. The optimal reaction pH was 5.8, and it was relatively stable in the range of pH 4.0–7.0. The enzyme showed tolerance to acidic environment. Its Kmwas 0.63 mmol/L towards p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate, indicating high affinity between the enzyme and the substrate. The enzyme activity of ACP could be strongly inhibited by methanol, ethanol, isopropanol, ascorbic acid, oxalic acid and Cu2+, Pb2+and Ag+, while it could be enhanced to some extent by Mg2+, Mn2+, Ba2+and K+.

cilantro; acid phosphatase; isolation and purification; enzymatic properties

Q946.5

A

1002-6630（2015）21-0162-06

10.7506/spkx1002-6630-201521031

2014-12-23

重慶市科委重點攻關項目（CSTC, 2011AB1027）

王丹（1991—），女，碩士研究生，主要從事蛋白質與酶工程研究。E-mail：wdswu911@163.com

*通信作者：唐云明（1960—），男，教授，博士，主要從事蛋白質與酶工程研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn