不同培養條件對禾谷鐮刀菌產玉米赤霉烯酮的影響

甄玉萍，裴世春，高建偉，王 巖，蔣媛媛

（齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

不同培養條件對禾谷鐮刀菌產玉米赤霉烯酮的影響

甄玉萍，裴世春*，高建偉，王 巖，蔣媛媛

（齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

研究不同培養條件對禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）產玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）能力的影響。選取不同的培養基配比、培養時間、培養溫度、搖床轉速及光暗反應對禾谷鐮刀菌進行培養。在單因素試驗的基礎上，分別采用正交試驗設計和響應面設計的方法進行統計學分析。結果表明：禾谷鐮刀菌的最適培養基為每升超純水含葡萄糖60 g、KNO31.5 g、酵母浸出膏1.0 g、蛋白胨20 g、NaNO36.0 g、MgSO40.5 g、K2HPO4·3H2O 1.0 g、KCl 0.5 g、Fe2(SO4)30.025 g；當搖床轉速為92 r/min、照明時間為10 h/d、培養溫度為22.9 ℃時，20 d毒素質量濃度可達到249.80 μg/L。

禾谷鐮刀菌；玉米赤霉烯酮；酶聯免疫吸附分析法；真菌毒素

禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）是禾本科作物的重要病原菌之一[1-3]，中國北方地區的谷物均受到其不同程度的污染[4-7]。同時，禾谷鐮刀菌在侵染過程中會產生對人體和動物有害的玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）等真菌毒素[8-9]。現今國內外諸多研究者都在致力于玉米赤霉烯酮的檢測及其在生物和化學領域脫毒及拮抗性的研究[10-11]，使得該毒素的需求越來越大。但現階段，國內沒有專門生產高純度玉米赤霉烯酮毒素的機構，國內研究者所使用的玉米赤霉烯酮標準品多數來自國外進口，不僅購買價格昂貴，而且進口程序復雜，這為國內真菌毒素研究帶來諸多不便。因此，為了促進玉米赤霉烯酮生產的國產化進程，有必要開展不同培養條件對禾谷鐮刀菌產玉米赤霉烯酮能力的影響研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄糖、K2HPO4·3H2O、蛋白胨、NaNO3、酵母浸出膏、Fe2(SO4)3、KCl、MgSO4均為分析純 天津市光復科技發展有限公司；110250 5B-05-3-3禾谷鐮刀菌標準菌株（Fusarium boothii） 荷蘭漢福生物科技公司；玉米赤霉烯酮標準品、吐溫-20、3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB） 美國Sigma公司；玉米赤烯酮BSA抗原 北京中科匯文遺傳技術發展中心；山羊抗小鼠IgG/辣根酶標記 北京中杉金橋生物技術有限公司；抗玉米赤霉烯酮抗體 實驗室自行制備。

1.2 儀器與設備

HZQ-Q全溫振蕩器 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；ZHJH-C1109B超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；VICTOR X4多功能酶標儀、Wahser400 96孔洗板機 美國GE公司；SHP-250生化培養箱 上海森信實驗儀器有限公司；MILLIPOREPEFERENCE超純水系統 美國密理博公司；FA1004N電子天平 上海菁海儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ZEN的添加回收率及酶聯免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法的檢出限

隨機抽取10 個新配制的液體培養基，將每個培養基平均分為3 份，在每組培養基中分別添加1 mL標準ZEN溶液，質量濃度為5、50、500 μg/L，分別采用ELISA方法[12]和超高壓液相色譜質譜-串聯質譜（ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）法[13-18]進行檢測，多次重復該實驗。對ELISA方法進行檢測限及靈敏度的分析[19]：計算10 個陰性孔OD450nm的平均值（）和標準差（s），以±s從標準曲線中找到該相應值的最低濃度，即為方法的檢測限（limit of detection，LOD）。根據標準曲線的線性范圍確定定量限（limit of quantity，LOQ），并確定該方法的線性相關性。

1.3.2 菌株活化及液體培養

對菌種進行2 次活化，第1次活化是從購買的標準品中挑取菌絲放入制備好的PDA平板培養基內；第2次活化是從該平板培養基內挑取小塊菌絲放入下一個制備好的PDA平板培養基中央，再放入25 ℃培養箱內培養7 d。在超凈工作臺內用直徑為2 cm的打孔器取1 個活化菌種的外圈菌餅，接種到滅菌后的液體培養基內，塞好棉塞，用牛皮紙包扎好后放入搖床進行培養。

1.3.3 液體培養基配方篩選

1.3.3.1 液體培養基配方的單因素試驗

綜合相關文獻中的多種液體培養基配方[20-23]，以培養基成分中的葡萄糖、KNO3、酵母浸出膏、蛋白胨、NaNO3的質量濃度為單因素自變量，以ZEN的產量為指標，進行單因素試驗，每組單因素試驗水平重復進行3 次。以葡萄糖30 g/L、KNO33.0 g/L、酵母浸出膏2.0 g/L、蛋白胨10 g/L、NaNO33.0 g/L、MgSO40.5 g/L、K2HPO4·3H2O 1.0 g/L、KCl 0.5 g/L、Fe2(SO4)30.025 g/L、1.0 L超純水為基準，培養時間為4 d，分別考察葡萄糖為0、10、20、30、40 g/L，KNO3為0、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L，酵母浸出膏為0、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L，蛋白胨為0、10、15、20、25 g/L，NaNO3為0、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L時對ZEN產量的影響。

1.3.3.2 液體培養基配方的正交試驗

綜合以上單因素試驗，確定了培養基的主要成分，根據確定的因素和水平設計正交試驗。

1.3.4 培養條件的確立

1.3.4.1 產ZEN培養條件的單因素試驗

通過結合文獻[24-26]，確定以照明時間、培養時間、培養溫度、搖床轉速為單因素變量，以ZEN的產出量為指標，進行單因素試驗，每組單因素試驗水平重復進行3 次，以白熾燈照明時間12 h/d、培養時間15 d、培養溫度25 ℃、搖床轉速90 r/min為基準，分別考察白熾燈照明時間為0、3、6、12、24 h，培養時間為3、6、12、24、48 d，培養溫度為5、10、20、30、40 ℃，搖床轉速為0、30、60、90、120 r/min時對ZEN產量的影響。將培養液于1 000 r/min離心5 min，取上清液進行ZEN產量的測定。

1.3.4.2 響應面法優化生產ZEN的培養條件

綜合以上所做的單因素試驗，選取培養中最主要的幾個外界因素為自變量，以ZEN的產出量為響應值，根據Box-Behnken[27-29]設計原理，設計響應面曲面分析試驗，確定最佳培養條件。

2 結果與分析

2.1 液體培養基中ZEN的添加回收率及ELISA方法的檢出限

表1 玉米赤霉烯酮添加回收率Table 1 Spiked recovery of ZEN

通過在液體培養基中添加不同水平的毒素用ELISA和UPLC兩種檢測方法進行添加回收實驗，結果如表1所示。當添加水平為5、50 μg/L時，兩種檢測方法無顯著性差異，故僅對ELISA方法進行檢測，其LOD為0.01 μg/L，LOQ為0.1 μg/L，線性回歸方程為y = －0.544 8x +1.896 6（相關系數R2＝0.920 9），因R2＞0.9，可說明ZEN質量濃度在0.01～10 μg/L范圍內與OD450nm值之間具有很強的線性相關性，表明通過ELISA方法來進行菌液中ZEN產量的檢測是可行的。

2.2 產ZEN培養基配方的單因素試驗

圖1 培養基各單因素對ZEN產量的影響Fig.1 Effect of culture medium components on the yield of ZEN

由圖1a可知，隨著葡萄糖添加量的增加，ZEN的產量逐漸上升，當葡萄糖添加量達到30 g/L以后，ZEN產量仍增加，但整體趨勢平緩，差異不顯著（P＞0.05）。由圖1b可知，隨著KNO3添加量的增加，ZEN的產量逐漸上升，當KNO3添加量達到3.0 g/L以后，整體趨勢平緩，差異不顯著（P＞0.05）。由圖1c可知，隨著酵母浸出膏添加量的增加，ZEN的產量呈上升趨勢，當酵母浸出膏添加量達到3.0 g/L以后，ZEN產量仍有增加的趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）。由圖1d可知，隨著蛋白胨添加量的增加，ZEN的產量呈上升趨勢，當蛋白胨添加量達到20 g/L以后，ZEN產量變化趨于平緩，差異不顯著（P＞0.05）。由圖1e可知，隨著NaNO3添加量的增加，ZEN的產量呈上升趨勢，當NaNO3添加量達到3.0 g/L以后，ZEN產量仍增加，但整體趨勢平緩，差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 產ZEN最佳培養基配方的正交試驗及結果

通過結合文獻[20-23]以及前面所做的單因素試驗得出葡萄糖、KNO3、酵母浸出膏、蛋白胨、NaNO3的添加量為主要培養基配方，固定其他培養基成分，對5 種因素進行正交試驗設計，如表2所示。

表2 培養基配方的正交試驗L16(45)結果Table2 L16(45) Orthogonal array design with experimental results for optimization of culture medium components

根據表2極差R的大小進行因素的主次排列，5 個影響因素的主次順序是：A（葡萄糖添加量）＞D（蛋白胨添加量）＞B（KNO3添加量）＞C（酵母浸出膏添加量）＞E（NaNO3添加量）。

從試驗的綜合衡量指標ZEN產量及各水平的平均值ki可直觀看出，培養基配方的最優水平組合為A4B2C2D4E4，即葡萄糖添加量為60 g/L、KNO3添加量為1.5 g/L、酵母浸出膏添加量為1.0 g/L、蛋白胨添加量為20 g/L、NaNO3添加量為6.0 g/L。

2.4 產ZEN培養條件的單因素試驗

圖2 各單因素培養條件對ZEN產量的影響Fig.2 Effect of culture conditions on the yield of ZEN

由圖2a可知，隨著每天照明時間的延長，ZEN的產量逐漸升高，當照明時間達到12 h以后，ZEN產量有所下降，說明12 h為可參考的照明時間。由圖2b可知，隨著培養時間的加長，ZEN的產量迅速升高，當培養時間達到24 d以后，ZEN產量的趨勢保持不變，說明24 d左右為可參考的培養時間。由圖2c可知，隨著培養溫度的升高，ZEN的產量先升高后下降，溫度超過30 ℃后，可明顯看出，液體培養基中的菌絲逐漸停止生長，由此可說明20 ℃左右為可參考的培養溫度。由圖2d可知，隨著搖床轉速的加快，ZEN的產量逐漸升高，當轉速為90 r/min時，ZEN產量達到最大值，其后有下降的趨勢，但差異不顯著（P＞0.05），說明90 r/min左右為可參考的搖床轉速。

2.5 響應面法優化生產ZEN的培養條件

2.5.1 Box-Behnken設計試驗

通過結合文獻[24-26]以及前面所做的單因素試驗得出影響禾谷鐮刀菌產ZEN的主要外界條件為照明時間、培養時間、培養溫度、搖床轉速，因此本實驗以照明時間（X1）、培養時間（X2）、培養溫度（X3）、搖床轉速（X4）為自變量，以菌液中測得的ZEN含量為響應指標，采用Box-Behnken方法設計響應面分析試驗，試驗設計及結果如表3所示。

表3 培養條件優化響應面試驗設計方案及結果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis for optimization of culture conditions

2.5.2 模型建立與方差分析

根據表3的試驗結果，利用Design Expert v8.0.6軟件對試驗數據進行分析，所得主要分析結果如表4所示。

對表3試驗結果進行回歸分析，得到如下方程：

Y＝235.68+10.01X1+68.42X2－19.81X3+7.68X4+ 3.36X1X2－1.87X1X3－2.83X1X4－18.23X2X3+6.43X2X4+

因素X2、X3、、、、對ZEN產量效果的線性效應極顯著，因素X1、X2X3對ZEN產量效果的線性效應顯著，因素X4、X1X2、X1X3、X1X4、X2X4、X3X4對ZEN產量效果的線性效應不顯著。

比較影響ZEN產量顯著程度大小的各因素可知，其影響程度由大到小依次為培養時間、培養溫度、照明時間、搖床轉速，模型的回歸值F＝46.888＞F0.01（14,4）＝14.24，P＜0.000 1，表明該模型極顯著；相關系數R2＝0.979 1，調整R2＝0.958 2，說明該模型能解釋95.82%響應值的變化，因而表明該模型對試驗實際情況擬合較好，可以用此模型對影響ZEN產量的培養條件進行預測和分析。

表4 回歸方程方差分析結果Table 4 Analysis of variance of regression equation

2.5.3 響應面分析與條件優化

圖3 培養時間與溫度及其交互作用對ZEN產量影響的響應面和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots for the effect of culture time and temperature on the yield of ZEN

由圖3可知，響應曲面的坡度陡峭，表明ZEN產量對培養時間與培養溫度的變化敏感。固定每天照明時間為12 h，搖床轉速90 r/min，當培養溫度處于較低和較高水平時，隨著培養時間的延長，ZEN產量呈先升高后趨于平緩下降的趨勢；當培養時間處于較低水平時，隨著培養溫度的升高，ZEN產量先升高后下降，且變化較大。從等高線可看出對ZEN產量的影響，培養時間大于培養溫度，培養時間與溫度之間的交互作用顯著，與表4中交互項P值的分析結果一致。

圖4 照明時間與培養溫度及其交互作用對ZEN產量影響的響應面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of light irradiation time and culture temperature on the yield of ZEN

由圖4可知，響應曲面的坡度較為陡峭，表明ZEN產量對照明時間與培養溫度的變化較為敏感。固定培養時間為16 d，搖床轉速為90 r/min，在照明時間不變的條件下，隨著培養溫度的逐漸升高，ZEN產量先升高后下降，且趨勢緩慢；在培養溫度不變的條件下，隨著照明時間的逐漸加長，ZEN產量先升高后下降。從等高線可看出二者之間對ZEN產量的影響，培養溫度大于照明時間，與表4分析中影響ZEN產量顯著程度大小的各因素分析結果一致。

由圖5可知，響應曲面的坡度略為陡峭，表明ZEN產量對照明時間與搖床轉速的變化略為敏感。固定培養時間為16 d，培養溫度為25 ℃，在照明時間不變的條件下，隨著搖床轉速的逐漸加快，ZEN產量呈先升高后下降的變化趨勢；在搖床轉速不變的條件下，隨著照明時間的逐漸加長，ZEN產量先升高后下降。從等高線可看出二者之間對ZEN產量的影響，照明時間大于搖床轉速，與表4分析中影響ZEN產量顯著程度大小的各因素分析結果一致。等高線略偏圓形，表明兩因素之間的交互作用強度較弱，影響不顯著。

圖5 照明時間與搖床轉速及其交互作用對ZEN產量影響的響應面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of light irradiation time and shaking speed on the yield of ZEN

通過模型優化得出ZEN生產的最優培養條件為：照明時間每天9.58 h、培養時間20.38 d、培養溫度22.85 ℃、搖床轉速91.71 r/min，在此條件下ZEN的產量為244.97 μg/L。

2.6 驗證實驗

為了檢驗正交試驗與響應面法所得結果的準確性，采用上述培養基與培養條件進行禾谷鐮刀菌在液態培養基中的培養，并在該優化條件下進行3 次平行實驗，考慮到實際操作的情況，將條件參數修正為培養溫度22.9 ℃、培養時間20 d、照明時間10 h/d、搖床轉速92 r/min。培養基配方為每升超純水中含葡萄糖60 g、KNO31.5 g、酵母浸出膏1.0 g、蛋白胨20 g、NaNO36.0 g、MgSO40.5 g、K2HPO4·3H2O 1.0 g、KCl 0.5 g、Fe2(SO4)30.025 g，得到ZEN產量可達到249.80 μg/L，與理論預測值的相對誤差在1.93%左右。因此，正交試驗法與響應面法結合所得的產ZEN條件參數準確可靠，具有實用價值。

3 結 論

實驗采用酶聯免疫方法與液-質聯用的方法同時進行菌液中標準毒素的添加回收實驗，通過比較分析，兩者之間的添加回收率無顯著性差異，考慮到ELISA檢測方法快速簡便，且靈敏度高，因此，ELISA方法可適用于菌液中ZEN毒素的檢測。結合正交試驗與響應面試驗分析了不同培養條件下液體培養基中禾谷鐮刀菌產玉米赤霉烯酮的能力，篩選出了最佳的培養基配方和最優的培養條件為每升超純水含葡萄糖60 g、KNO31.5 g、酵母浸出膏1.0 g、蛋白胨20 g、NaNO36.0 g、MgSO40.5 g、K2HPO4·3H2O 1.0 g、KCl 0.5 g、Fe2(SO4)30.025 g，培養溫度22.9 ℃、培養時間為20 d、照明時間為10 h/d、搖床轉速92 r/min，所得液體培養基中ZEN的產量可達249.80 μg/L。本實驗結果為ZEN的國產化研究提供了一定的基礎性實驗依據。

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Effect of Different Culture Conditions on the Production of Zearalenone by Fusarium graminearum

ZHEN Yuping, PEI Shichun*, GAO Jianwei, WANG Yan, JIANG Yuanyuan
(College of Food and Biological Engineering, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China)

In the present study, the effects of different incubation conditions on the production of zearalenone (ZEN) by Fusarium graminearum were explored. Culture medium, incubation time, incubation temperature, shaking speed and light irradiation time were selected as important parameters affecting ZEN production. Single factor method was used in combination with orthogonal array design and response surface methodology to optimize the medium composition and culture conditions employing statistical analysis, respectively. The results showed that the optimal culture medium for Fusarium graminearum was comprised of 60 g/L C6H12O6, 1.5 g/L KNO, 1.0 g/L yeast extract paste, 20 g/L peptone, 6.0 g/L NaNO3, 0.5 g/L MgSO4, 1.0 g/L K2HPO4·3H2O, 0.5 g/L KCl, and 0.025 g/L Fe2(SO4)3in 1.0 L of ultrapure water. The concentration of ZEN was 249.80 μg/L when the cultivation was carried out for 20 days with a shaking speed of 92 r/min, 22.9 ℃ under light irradiation for 10 h a day.

Fusarium graminearum; zearalenone; enzyme-linked immunosorbent assay; mycotoxin

R446.61

A

1002-6630（2015）21-0168-07

10.7506/spkx1002-6630-201521032

2015-06-29

齊齊哈爾大學研究生創新科研項目（YJSCX2014-015X）；國家科技基礎性工作專項（2013FY113400）；

黑龍江省教育廳科學技術研究項目（12541871）

甄玉萍（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品營養與安全。E-mail：15146694340@139.com

*通信作者：裴世春（1966—），男，教授，博士，研究方向為食品營養與安全。E-mail：peishichun@qqhru.edu.cn