氧化/抗氧化失衡在大鼠中樞聽覺系統老化過程中的作用

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(1.廣東醫學院附屬南山醫院耳鼻咽喉科，廣東 深圳 518052；2.廣西醫科大學藥學院)

·基礎醫學·

氧化/抗氧化失衡在大鼠中樞聽覺系統老化過程中的作用

胡璟1，高春生1，劉林2，杜政德1*

(1.廣東醫學院附屬南山醫院耳鼻咽喉科，廣東 深圳 518052；2.廣西醫科大學藥學院)

目的研究氧化/抗氧化失衡在D-半乳糖誘導的大鼠老化中樞聽覺系統聽皮層組織中的作用，探討老年性耳聾氧化性損傷的發生機制。方法48只1月齡雄性Spragua-Dawley大鼠隨機分成4組(各12只)，不同劑量D-半乳糖每日頸背部皮下注射D-半乳糖(500 mg/kg)造模，連續8周。造模完成后，取4組大鼠中樞聽覺系統聽皮層組織，檢測活性氧指標過氧化氫、總抗氧化能力指標抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的總水平、DNA氧化損傷生物標記物8-羥基-2-脫氧鳥苷(8-OHdG)的表達以及最常發生的年齡相關性mtDNA損傷線粒體DNA(mtDNA)4 834 bp大片段缺失的累積水平。將實驗數據采用方差分析進行分析。結果與對照組大鼠相比較，D-半乳糖誘導的老化大鼠聽皮層組織中過氧化氫含量明顯增多，而總抗氧化能力明顯下降(P<0.01)。同時，DNA氧化損傷的產物8-OHdG的表達和線粒體4 834 bp大片段缺失突變的累積明顯增多(P<0.01)。結論在中樞聽覺系統老化過程中，氧化/抗氧化失衡可能是導致老年性耳聾發生的重要原因。

氧化/抗氧化失衡； 老化； 中樞聽覺系統； 氧化性損傷； 線粒體DNA

老化是生物體對抗各種應激、損傷和疾病的能力逐漸下降的過程[1]。年齡相關性聽力損失，又稱為老年性耳聾，是老化在聽覺系統的表現。然而，老年性耳聾聽覺系統退行性變的確切機制仍不十分清楚。

由于在活體的人體聽覺系統組織不可獲得以及伴有聽力損失的個體所處環境不同，老年性耳聾的研究在一定程度上受到限制。因此，研究者建立許多老年性耳聾的動物模型。其中，通過給實驗大鼠慢性注射D-半乳糖的方法可以很好的模擬大鼠的自然老化過程，成為研究老年性耳聾的理想模型[2-4]。

目前，大量研究已經證實氧化性應激是導致老化的重要原因[5-7]。但是，體內氧化性應激和抗氧化能力的相互作用在老化大鼠中樞聽覺系統退行性變過程中的作用仍不完全清楚。本研究利用D-半乳糖誘導的老化大鼠模型，通過檢測中樞聽覺系統聽皮層組織中活性氧指標過氧化氫、總抗氧化能力、DNA氧化損傷的產物8-羥基-2-脫氧鳥甘的表達和人類線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)4 977 bp缺失(在大鼠與之相對應的mtDNA CD為4 834 bp)的累積，探討氧化/抗氧化失衡在D-半乳糖誘導的老化大鼠中樞聽覺系統氧化損傷過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 D-半乳糖誘導的老化大鼠模型的構建選耳廓反射靈敏且無中耳疾患的SPF級1月齡雄性SD大鼠48只，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，適應性喂養1周，隨機分為4組(每組各12只)：① 對照組：每日頸背部皮下注射生理鹽水，連續8周；② 低劑量D-半乳糖組：每日頸背部皮下注射D-半乳糖(150 mg/kg)，連續8周；③ 中劑量D-半乳糖組：每日頸背部皮下注射D-半乳糖(300 mg/kg)，連續8周；④ 高劑量D-半乳糖組：每日頸背部皮下注射D-半乳糖(500 mg/kg)，連續8周。所有動物均飼養在室溫約20～22 °C左右，12 h晝夜交替的環境中，自由進食飲水。兩組動物均無噪聲暴露史，無其它藥物使用史。

1.2過氧化氫和總抗氧化力的檢測4組大鼠(每組6只)肌肉注射氯胺酮(30 mg/kg)和氯丙嗪(15 mg/kg)麻醉后處死，快速取出雙側聽皮層。一側用于過氧化氫和總抗氧化力(主要由抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的總的水平決定)的檢測，另一側保存于-80 ℃冰箱用于線粒體4 834 bp大片段缺失突變的累積水平的檢測。使用組織過氧化氫檢測試劑盒(南京建成生物，中國)和總抗氧化力檢測試劑盒(碧云天，中國)檢測各組大鼠聽皮層內過氧化氫和總抗氧化力的水平。聽皮層組織總蛋白濃度采用BCA法進行蛋白定量。

1.3線粒體4 834 bp大片段缺失突變的檢測

1.3.1 基因組DNA的提取 將聽皮層組織分別放入GA緩沖液(Tiangen Biotech Co.,LTD,北京,中國)中勻漿，提取基因組DNA。

1.3.2 Taqman PCR檢測線粒體DNA(mtDNA)常見4 834 bp大片段大片段缺失突變(CD)的累積 運用Taqman PCR檢測耳蝸軟組織和聽皮層組織線粒體4 834 bp大片段缺失突變(mtDNA CD)，由于mtDNA CD D-loop區很少發生突變，為mtDNA CD的保守序列，因此用D-loop作為內參。根據熒光擴增曲線確定Ct值。mtDNA CD的相對表達量用2-△△Ct法計算。△△Ct = D-半乳糖組(CtmtDNA CD- CtmtDNA D-loop)-對照組(CtmtDNA CD- CtmtDNA D-loop)，2-△△Ct代表各D-半乳糖組mtDNA CD的量與對照組mtDNA CD的量的比值。使用Taqman PCR擴增試劑盒(TaKaRa,大連，中國)進行PCR反應。反應總體系：20 μL。反應條件：①預變性：95 ℃ 30 s，共1個循環；②PCR反應：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。所用引物和探針序列如下：D-loop：上游引物：5′-GGT TCT TAC TTC AGG GCC ATC A-3′；下游引物：5′-GAT TAG ACC CGT TAC CAT CGA GAT-3′；探針：5′-FAM-TTG GTT CAT CGT CCA TAC GTT CCC CTT A-TAMRA-3′。CD：上游引物：5′-AAG GAC GAA CCT GAG CCC TAA TA-3′；下游引物：5′-CGA AGT AGA TGA TCC GTA TGC TGT A-3′；探針：5′-FAM-TCA CTT TAA TCG CCA CAT CCA TAA CTG CTG T-TAMRA-3′。

1.4 DNA氧化損傷標記物8-OHdG的檢測

1.4.1 取材及免疫組織化學標本的制作 4組大鼠(每組6只)肌肉注射氯胺酮(30 mg/kg)和氯丙嗪(15 mg/kg)麻醉后，0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)心臟快速灌注大鼠，繼而4%多聚甲醛心臟灌注，快速取出大腦，放入4%多聚甲醛中，4 ℃過夜。第2天，將固定好的大腦經脫水、透明、石蠟包埋和切片過程，最終制成5 μm厚的切片。大腦沿冠狀位切片，根據《大鼠腦立體定位圖譜》選取聽皮層層面的切片，放入-20 ℃冰箱保存備用。

1.4.2 免疫組織化學染色檢測8-OHdG 聽皮層石蠟切片依次放入二甲苯I、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸餾水各20 min、15 min、10 min、5 min、2 min、1 min、1 min、1 min、1 min、2 min，然后滴加濃度為20 μg/mL蛋白酶K(碧云天，中國)進行修復，37 ℃ 15 min，甩去修復液，繼續滴加3%的過氧化氫以阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min。甩干玻片，用免疫組畫筆在組織周圍畫圈，滴加5% BSA封閉以減少非特異性染色，室溫30 min。甩去封閉液，滴加一抗anti-8-OHdG(1∶4 000,abcam,美國)4 ℃過夜。第二天，37 ℃復溫30 min，PBS沖洗3次，每次3 min。滴加CY3標記的二抗(博士德，中國)20～37 ℃孵育20 min，PBS沖洗3次，每次3 min。DAPI(碧云天，中國)復染細胞核，室溫5 min，PBS沖洗3次，每次3 min。抗熒光猝滅封片液(碧云天，中國)封片，熒光顯微鏡(Nikon，日本)觀察。

2 結 果

2.1聽皮層組織中過氧化氫和總抗氧化力的表達不同劑量D-半乳糖誘導的老化大鼠聽皮層組織中過氧化氫的表達比對照組顯著升高，而總抗氧化力比對照組顯著降低，差異均具有統計學意義(P<0.01)(圖1)。

2.2聽皮層組織中DNA氧化損傷產物8-羥基-2-脫氧鳥苷的表達DNA氧化損傷產物8-羥基-2-脫氧鳥苷主要在老化大鼠中樞聽覺系統聽皮層神經元胞漿中表達，且不同劑量D-半乳糖組均比對照組表達顯著增強(圖2)。

圖1 過氧化氫和總抗氧化力在聽皮層中的表達 與對照組比較，**：P<0.01

圖2 DNA氧化損傷產物8-羥基-2-脫氧鳥苷在聽皮層中的表達(400×)

2.3聽皮層組織中線粒體4 834 bp大片段缺失突變的累積不同劑量D-半乳糖誘導的老化大鼠聽皮層組織中線粒體4 834 bp大片段缺失突變的累積比對照組顯著升高(圖3)，差異均具有統計學意義(P<0.01)。

3 討 論

聽覺系統由外周聽覺系統和中樞聽覺系統組成。聽皮層是中樞聽覺系統的最高級中樞，是聲音信號被活體認知的最終部位。越來越多的研究已經證實中樞聽覺系統的退行性變是導致老年性耳聾的重要原因[8-10]。本研究發現D-半乳糖誘導的老化大鼠中樞聽覺系統聽皮層組織中不僅活性氧指標過氧化氫含量增加，而且總抗氧化能力下降，提示氧化/抗氧化失衡可能在老年性耳聾的發病過程有著重要的作用。

圖3 線粒體4 834 bp大片段缺失突變在聽皮層中的累積與對照組比較，**：P<0.01

氧化/抗氧化失衡引起的氧化性應激可損傷細胞內蛋白質、脂質、RNA和DNA等[7]。本研究發現不同劑量D-半乳糖誘導的老化大鼠聽皮層組織中DNA氧化損傷標記物8-羥基-2-脫氧鳥苷明顯增加，與此同時線粒體4 834 bp大片段缺失突變的累積也明顯增加，表明氧化/抗氧化的失衡可引起細胞內DNA，特別是線粒體DNA的損傷。線粒體4834-bp大片段缺失是最常發生的年齡相關的線粒體DNA缺失突變，是老化的生物標記[11-13]。越來越多的文獻報道老年性聾和線粒體4 834 bp大片段缺失突變的累積密切有關[14-16]。線粒體DNA的突變不僅可影響線粒體的能量代謝，還可誘導依賴線粒體的細胞凋亡途徑的激活，最終導致細胞的凋亡[7]。

綜上所述，在D-半乳糖誘導的老化大鼠中樞聽覺系統的老化過程中，氧化/抗氧化失衡引起的氧化性應激可導致線粒體DNA突變的累積增加，在老年性耳聾的發病過程中可能扮演了重要的角色，而維持氧化/抗氧化的平衡對預防和延緩老年性耳聾的發生和發展有著重要的意義。

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TheRoleofOxidation/AntioxidantImbalanceintheAge-relatedDamageoftheRatCentralAuditorySystem

HU Jing,GAO Chunsheng,LIU Lin,et al

(DepartmentofOtorhinolaryngology,NanshanAffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Shenzhen，Guangdong518052,China)

ObjectiveTo explore the effects of oxidation/antioxidant imbalance on the auditory cortex of central auditory system of D-galactose-induced aging rats and investigate the mechanism of oxidative damage of age-related hearing loss.MethodsForty-eight 1-month male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups (12 rats in each group)，and were injected subcutaneously with different dose of D-gal once a day for 8 weeks.After the experiment termination,the tissues were harvested from the auditory cortex of central auditory system.Investigate the expression of hydrogen peroxide,total antioxidant capacity,8-hydroxy-2-deoxyguanosine (8-OHdG) and the accumulation of mitochondrial DNA 4 834 bp deletion.All experimental data was analysed with one-way ANOVA.ResultsThe expression of hydrogen peroxide in the auditory cortex of rats of D-galactose groups was significantly increased compared with the control group,while the expression of the total antioxidant capacity was significantly decreased (allP<0.01).Meanwhile,the expression of 8-OHdG and the accumulation of mitochondrial DNA 4 834 bp deletion were significantly increased (P<0.01).ConclusionsIn the aging process of central auditory system,the oxidation/antioxidant imbalance may be an important cause for the age-related hearing loss.

oxidation/antioxidant imbalance; aging; central auditory system; oxidative damage; mitochondrial DNA

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.05.005

2015-01-20；

2015-8-21

廣東省醫學科研基金(B2014370)；深圳市科技計劃(JCYJ20140411092351692)；深圳市南山區技術研發和創意設計項目分項資金(南科研衛2012014號).

*通訊作者，E-mail：duzhengde@163.com.

R764.43

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(此文編輯：朱雯霞)