堿溶酸沉法提取青稞蛋白質的工藝研究

吳桂玲，劉立品，李文浩，張偉，劉曉雪，張國權

（西北農林科技大學食品學院，陜西楊凌712100）

堿溶酸沉法提取青稞蛋白質的工藝研究

吳桂玲，劉立品，李文浩，張偉，劉曉雪，張國權*

（西北農林科技大學食品學院，陜西楊凌712100）

以藏區典型青稞品種藏青85為試驗材料，以料液比、pH、提取溫度和提取時間為單因素試驗的基礎上進行二次正交旋轉組合設計，確定了適宜青稞蛋白提取的最佳工藝參數。結果表明，影響青稞蛋白質提取率的因素依次為pH、料液比、提取時間、提取溫度，青稞蛋白質提取適宜工藝條件為：料液比1∶25（g/mL），pH 11，提取溫度40℃，提取時間20min，青稞蛋白質提取率為70.71%。

青稞；蛋白質；堿溶酸沉法；提取率；二次正交旋轉組合設計

青稞（Hordeum vuLgare L.），又稱裸大麥、米大麥，屬禾本科小麥族大麥屬，在我國主要分布于青藏高原地區，是該地區種植面積最廣，且最具特色的農作物，具有耐寒、耐貧瘠、適應性廣、生育期短、抗逆性強、產量穩定等優良特性[1-3]。藏青85是藏區典型中晚熟超高產品種，具有前期生長快、耐肥水、抗倒伏能力強等特點，其社會效益和經濟效益均較突出。青稞具有高蛋白質、高纖維、高維生素、低糖、低脂肪，且富含微量元素硒的營養特點，其粗蛋白質含量7.68%～17.52%，膳食纖維含量13.4%，硒含量0.028mg/kg[4-6]。青稞蛋白含有18種氨基酸，包括人體必需的8種氨基酸，其中賴氨酸含量為0.36 g/100 g，對于補充機體每日必需氨基酸的需要有重要意義[7-10]；青稞蛋白還含有豐富的支鏈氨基酸，有利于肝臟功能的恢復、降低心血管疾病的發生概率等功能[11-12]。

目前，國內外常用物理法、化學法和生物酶法提取植物蛋白質。物理法有膠體磨法、均質法、高壓法等，其提取率相對較低；化學法主要為堿溶酸沉法，生物酶法提取主要用纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等，其工藝相對復雜[13]。堿溶酸沉法是目前提取植物蛋白質最普遍和最常用的方法，具有提取率高、成本低、便于操作的優點，適于工業化生產[14]，而目前關于堿溶酸沉法提取青稞蛋白的工藝還未見報道。本研究采用堿溶酸沉法提取藏青85青稞蛋白，以蛋白質提取率為評價指標，在單因素實驗基礎上，采用二次正交旋轉組合設計對青稞蛋白質的提取工藝進行優化，得到最佳提取工藝條件，為青稞蛋白質資源的研究開發提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞樣品為藏青85：由西藏農牧科學院農業研究所提供；氫氧化鈉、鹽酸、濃硫酸、硼酸、五水硫酸銅、硫酸鉀、甲基紅、溴甲酚綠、無水乙醇等均為分析純：四川西隴化工有限公司。

1.2 儀器與設備

KDC-40離心機：科大創新股份有限公司中佳分公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；HR-200電子分子天平：東生興業有限公司；101-1AB型電熱鼓風干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；PB-10 pH計：賽多利斯科學儀器有限公司；Foss凱氏定氮儀：瑞典富斯-特卡脫公司。

1.3 方法

1.3.1 青稞蛋白質提取工藝

青稞→粉碎→過篩（60目）→加水攪勻→調節pH→恒溫水浴振蕩→3 500 r/min離心10min→收集上清液→調節pH至等電點→4 000 r/min離心20min→去上清液→60℃干燥15 h→青稞蛋白質粉。

1.3.2 青稞蛋白質等電點的測定

參考李鳳英等（2005）方法[15]，并加以改進。青稞全粉按料液比1∶20加入蒸餾水，攪勻后調pH至10，在50℃條件下水浴震蕩1h，取出3500 r/min離心10min，收集上清液并將其均分為10份，每份40mL，分別調pH至2.0、3.0、4.0、4.2、4.4、4.5、4.6、4.8、5.0、6.0、7.0，沉淀凝沉后4 000 r/min離心15min，收集上清液，測定上清液中蛋白質含量m及未調節等電點的上清液蛋白質含量M，求其沉淀率：

以蛋白質沉淀率作為指標，其沉淀率最大值的pH為等電點。

1.3.3 青稞蛋白質提取工藝單因素試驗

1.3.3.1 料液比對青稞蛋白質提取率的影響

青稞全粉分別按料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）加入蒸餾水，在pH10，提取溫度50℃，提取時間60min條件下進行蛋白質提取，測定蛋白質提取率。

1.3.3.2 pH對青稞蛋白質提取率的影響

青稞全粉按料液比1：20加入蒸餾水，在pH分別為8、9、10、11、12，提取溫度50℃，提取時間60min條件下進行蛋白質提取，測定蛋白質提取率。

1.3.3.3 提取溫度對青稞蛋白質提取率的影響

青稞全粉按料液比1∶20加入蒸餾水，在pH10，提取溫度分別為30、40、50、60、70℃，提取時間60min條件下進行蛋白質提取，測定蛋白質提取率。

1.3.3.4 提取時間對青稞蛋白質提取率的影響

青稞全粉按料液比1∶20加入蒸餾水，在pH10，提取溫度50℃，提取時間分別為20、40、60、80、100、120min條件下進行蛋白質提取，測定蛋白質提取率。

1.3.4 二次正交旋轉試驗設計

在單因素試驗基礎上，選擇料液比、pH、提取溫度、提取時間的實驗水平，以青稞蛋白質提取率為考察指標，設計4因素二次正交旋轉試驗，優化青稞蛋白質提取工藝的最佳參數，其因素水平表見表1。

表1 二次正交旋轉試驗因素水平表Table 1 Factorsand levelsoforthogonal rotation combination design

1.3.5 蛋白質含量的測定

蛋白含量的測定參照GB/T5511-2008《谷物和豆類氮含量測定和粗蛋白質含量計算凱氏法》，采用凱氏定氮法進行，氮含量換算蛋白質含量的換算系數：5.83。

1.3.6 蛋白質提取率計算

蛋白質提取率/%=提取蛋白質量/青稞全粉蛋白含量×青稞全粉質量×100%

1.4 數據分析處理

以上各實驗均重復進行3次，并采用DPS 7.05和MicrosoftExcel2003進行試驗設計及數據處理。

2 結果與分析

2.1 青稞蛋白質等電點分析

青稞蛋白質等電點分析見圖1。

由圖1可知，pH在2～7的范圍內，青稞蛋白質沉淀率呈先增大后減小趨勢，在pH為4.5時，蛋白質沉淀率達到最大，為80.87%，且隨著pH接近中性，沉淀率降低、溶解率增大，在pH為7時，溶解率達到94.23%。由此可知，青稞全粉蛋白質等電點（pI）為4.5。

圖1 青稞蛋白質沉淀率隨pH的變化Fig.1 Changesofp rotein p recipitation ratew ith pH in highland barley

2.2 影響青稞蛋白質提取的因素

2.2.1 料液比

料液比對青稞蛋白質提取率影響見圖2。

圖2 料液比對青稞蛋白質提取率的影響Fig.2 Effectsof solid-to-liqu id on theextraction rateof protein in highland barley

由圖2可知，料液比在1∶5～1∶20的范圍內，青稞蛋白質提取率隨著料液比的增加顯著增大（p＜0.05），料液比繼續增加，青稞蛋白質提取率無顯著性差異。這主要是因為蛋白質的提取過程中，若提取液用量太少，溶液的黏度較大，分子擴散速率較低，體系分散不均勻，導致體系pH不均勻，影響了提取液中的蛋白質的溶出，提取率偏低；若提取液用量過多，增加在酸沉階段上清液的體積及蛋白質的損耗，使蛋白質提取率無顯著性差異，并會造成原料浪費[16]。因此，本試驗確定青稞蛋白質提取適宜料液比為1∶20。

2.2.2 pH

pH對青稞蛋白質提取率影響見圖3。

圖3 pH對青稞蛋白質提取率的影響Fig.3 Effectsof pH on theextraction rateofprotein in highland barley

由圖3可知，隨著pH的增大，青稞蛋白質提取率呈顯著上升趨勢，pH的增大有利于蛋白質提取率的提高。大多數植物蛋白質是酸性蛋白質，蛋白質分子中Asp和Glu殘基總和大于Lys、Arg和His殘基總和，在堿性條件下帶負電荷，蛋白質分子間相互排斥，使溶液分散性、溶解性較好，提高了蛋白提取率。此外，堿液對蛋白質分子的次級鍵有破壞作用，使蛋白質分子表面具有相同電荷，也起到了增溶的作用。但pH過高，破壞蛋白質的生物活性，使其變性，并加速美拉德反應，產生大量褐色物質，降低了蛋白質的純度[17]。pH太大可引起脫氨、脫羧、肽鍵斷裂，引起胱賴反應，對青稞蛋白質的理化特性造成不良影響[18]。青稞蛋白質提取的適宜pH為11。

2.2.3 提取溫度

提取溫度對青稞蛋白質提取率影響見圖4。

圖4 提取溫度對青稞蛋白質提取率的影響Fig.4 Effectsofextraction time on theextraction rateofprotein in high land barley

由圖4可知，青稞蛋白質提取率隨著提取溫度的升高呈增長趨勢，當提取溫度為60℃時，提取率最大，為39.06%，繼續升高溫度后提取率隨著提取溫度的升高而下降，蛋白質提取率在50℃～70℃間無顯著性差異（p≥0.05）。這主要是因為溫度升高，分子運動速度加快，蛋白質分子的構象發生變化，立體結構的伸展對蛋白質有一定的增溶效果，使蛋白質較容易從原料中溶解出來。青稞蛋白質提取率從60℃后開始下降，這是因為水分子的熱運動加劇使得蛋白質結構展開，維持蛋白質空間構象的次級鍵被破壞，非極性基團的暴露，導致蛋白質分子間發生聚集和沉淀，造成溶解度的降低[19]。且隨著溫度增加，溶液黏度增加，加大分離難度。提取溫度50℃較為適宜青稞蛋白質提取。

2.2.4 提取時間

提取時間對青稞蛋白質提取率影響見圖5。

圖5 提取時間對青稞蛋白質提取率的影響Fig.5 Effectsof extraction temperatureon theextraction rate of protein in highland barley

由圖5可知，青稞蛋白提取率隨著提取時間的增加呈先增大后降低趨勢，當提取時間為40min時，蛋白質提取率達到最大，為41.07%。這主要是因為青稞中含有一定量的戊聚糖，延長反應時間，會造成離心時少量蛋白質與戊聚糖類物質的粘連，導致青稞蛋白質提取率呈現下降趨勢[20]。因此，青稞蛋白質提取適宜時間為40min。

2.3 青稞蛋白提取工藝條件優化

2.3.1 二次正交旋轉組合設計及實驗結果

根據單因素試驗結果，以青稞蛋白質提取率為考察目標，設計四因素的二次正交旋轉試驗。確定料液比（X1）、pH（X2）、提取溫度（X3）、提取時間（X4）的零水平分別為1∶20、10、50℃、40min，試驗設計及結果見表1、2。

表2 二次正交旋轉組合設計試驗方案及結果Table2 Orthogonal rotation combination design scheme and resu lts

續表2 二次正交旋轉組合設計試驗方案及結果Continue tab le2 O rthogonal rotation com bination design schem e and results

2.3.2 回歸模型的建立與檢驗

采用DPS 7.05數據處理系統對表2中的結果進行二次多項式回歸分析，得到青稞蛋白質提取率（Y）和料液比（X1）、pH（X2）、提取溫度（X3）、提取時間（X4）之間的回歸模型：Y=37.716 7+1.347 1X1+10.162 1X2+ 0.451 3X3-0.811 3X4-0.354 9X12+1.897 6X22+0.463 9X32+ 0.722 6X42+0.459 4X1X2+0.116 9X1X3+0.106 9X1X4-0.245 6X2X3-0.525 6X2X4-0.208 1X3X4

由表3可知，回歸方程失擬項不顯著（F1=2.106 5，p=0.1188），即回歸方程對試驗點擬合效果較好，回歸方程達到極顯著水平（F2=36.130 3，p＜0.000 1），即模型成立，可用于描述青稞蛋白質提取率隨液料比、pH、提取時間、提取溫度變化的規律。

在α＝0.1的顯著水平上，剔除不顯著項，簡化后的回歸方程為：

Y=37.716 7+1.347 1X1+10.162 1X2-0.811 3X4+ 1.897 6X22+0.722 6X42

由表3可以看出，一次項X1、X2、X4對青稞蛋白質提取率有顯著或極顯著影響，二次項X22、X42對青稞蛋白質提取率有顯著或極顯著影響，其余一次項、二次項以及交互項影響均不顯著。由一次項顯著性檢驗可以看出，四個因素對青稞蛋白質提取率影響大小為X2＞X1＞X4＞X3，表明對青稞蛋白質提取率的影響因素依次為pH、液料比、提取時間、提取溫度。

表3 試驗結果方差分析表Table3 Varianceanalysisof theexperim ental results of orthogonal rotation combination design

2.3.3 青稞蛋白質提取工藝參數的優化與驗證

通過模型分析，優化工藝參數為料液比1∶25，pH 11，提取溫度40℃，提取時間20min，在此條件下蛋白質得率72.48%。3次平行驗證實驗的實測值為70.71%，與預測值差1.77%，驗證結果顯示方程預測性較好，模型是可靠的。

3 結論

1）通過青稞蛋白質等電點測定試驗，以蛋白質沉淀率作為指標，確定青稞蛋白質的等電點為pI4.5。

2）采用堿溶酸沉法提取青稞蛋白質，結果表明，液料比和pH對青稞蛋白質提取率影響極顯著，提取時間對其提取率影響顯著，提取溫度對其提取率影響不顯著，影響青稞蛋白質提取率的因素依次為pH、液料比、提取時間、提取溫度。

3）在單因素實驗的基礎上，采用二次正交旋轉組合設計實驗方法對青稞蛋白質提取工藝進行優化。確定適宜青稞蛋白質提取工藝條件：料液比1∶25（g/mL），pH 11，提取溫度40℃，提取時間20min，在此條件下青稞蛋白質提取率為70.71%。

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Research on Technology for Extraction of High land Bar ley Protein by Alkaline Extraction and Acid Precipitation M ethod

WUGui-ling，LIU Li-pin，LIWen-hao，ZHANGWei，LIU Xiao-xue，ZHANGGuo-quan*
（CollegeofFood Scienceand Engineering，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，Shannxi，China）

The quadratic orthogonal rotation combination design method was applied to optimize the extraction parametersofalkaliextraction and acid precipitationmethod for isolation ofhighland barley （cv.Zangqing 85）protein.Influencesof solid-to-liquid ratio，pH，extraction temperature and time on the protein extraction rate were studied respectively.The importance sequence of influence factors impacting protein extraction rate were pH，liquid ratio，extraction time and extraction temperature，successively.The optimum parametersof solidto-liquid ratio，pH value，extraction temperature and time for protein extraction were：1∶25，11，40℃and 20 min，respectively.Under thisoptimal condition，the protein extraction rate reached to 70.71%.

highland barley；protein；alkaliextraction and acid precipitation；extraction rate；quadratic orthogonal rotation combination design

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.006

2013-12-24

國家大麥青稞產業技術體系青稞加工試驗站（CARS-05-05B）

吳桂玲（1988—），女（滿），碩士研究生，研究方向：糧食油脂及植物蛋白工程。

*通信作者：張國權（1968—），男（漢），教授，博士，研究方向：谷物品質評價及淀粉工程技術。