PRMT2慢病毒表達載體的構建及鑒定

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(南華大學附屬第一醫院臨床醫學研究所，湖南 衡陽 421001)

·技術與方法·

PRMT2慢病毒表達載體的構建及鑒定

鐘警，楊心治，張艷敏，高?；?，秦旭平，文格波*

(南華大學附屬第一醫院臨床醫學研究所，湖南 衡陽 421001)

目的構建精氨酸甲基轉移酶2(PRMT2)慢病毒表達載體。方法通過PCR擴增PRMT2 cDNA,將PRMT2 cDNA連接于GV308載體，經測序確認后，將GV308/PRMT2與pHelper 1.0和pHelper 2.0共轉染至293T細胞中，收獲病毒，通過Real time PCR測定滴度; 將PRMT2慢病毒表達載體侵染293T細胞，通過四環素誘導和Western blot檢測PRMT2慢病毒表達載體的表達能力。結果在感染PRMT2 慢病毒載體293T細胞中能檢測到PRMT2-3Flag融合蛋白的表達。結論成功構建PRMT2的慢病毒表達載體。

PRMT2； 慢病毒載體； 基因治療

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其病因尚不清楚。近年來，乳腺癌的發病率呈低齡化和逐年上升趨勢。研究表明，乳腺癌的發生發展與多種因素有關，其中，雌激素/雌激素受體α(estrogen/estrogen receptor α,E2/ERα)參與了乳腺癌細胞的增殖、分化及凋亡，在乳腺癌的發生發展過程中起著重要作用[1-3]。ERα在配體(雌激素)作用下形成同源二聚體，在不同的病理生理條件下，同源二聚體與不同靶基因啟動子區中的雌激素反應元件(estrogen response elements，ERE)結合，并在ERα眾多共調節因子作用下，激活靶基因轉錄[4-5]。精氨酸甲基轉移酶2(protein arginine methyltransferases，PRMT2)是PRMTs家族成員之一。研究表明，PRMT2僅具有微弱的甲基轉移酶活性，卻能以配體依賴的形式提高ERα的轉錄活性，被確認為一種ERα的共調節因子[6]。PRMT2亦能提高其他核受體如雄激素受體和孕激素受體的轉錄活性[7]。最近的研究表明，PRMT2還可通過轉錄因子甲基化、組蛋白甲基化和RNA差異剪接等多種機制發揮不同的轉錄調節作用[7-9]，并在細胞分化、炎癥反應、NF-κB與瘦素信號轉導途徑中起著一定作用[10-12]。由此可見，PRMT2的作用是非常復雜的。前期研究表明，PRMT2基因在乳腺癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織，在正常組織中表達于胞核，而在癌組織中則主要表達于腫瘤細胞的胞漿，因此，推測，PRMT2極有可能在腫瘤的發生發展中起重要作用。本研究將構建表達PRMT2的慢病毒載體，為闡明PRMT2在乳腺腫瘤發生的作用提供有效生物學工具。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

293T細胞培養使用含10%胎牛血清(Gibco)、2 mmol/L glutamine 和100 U青霉素的DMEM (Hyclone,UT)，在37 ℃ 5%CO2條件下進行培養。

1.2 PRMT2過表達質粒載體構建

提取293T細胞總RNA,經逆轉錄后PCR獲得PRMT2 cDNA，引物序列如下：PRMT2-P1：5′-AAC CGT CAG ATC GCA CCG GCG CCA CCA TGG CAA CAT CAG GTG ACT G-3′，PRMT2-P2：5′-TCC TTG TAG TCC ATG AAT TCT CTC CAG ATG GGG AAG ACT T-3′，引物由捷瑞生物技術公司合成。PRMT2 cDNA經AgeI/EcoRI 雙酶切后與GV308 載體(上海吉凱基因化學技術有限公司)連接。取連接產物5 μL轉化Top10感受態大腸桿菌，鋪瓊脂平板(含50 μg/mL 氨芐青霉素),37 ℃過夜培養。次日挑取單菌落，經小量擴增，提取質粒并純化后送上海生工生物技術公司測序鑒定。

1.3 PRMT2過表達慢病毒在293T細胞內的包裝

按陽離子脂質體LipofectamineTM2000 (Invitrogen公司)試劑盒說明操作，將PRMT2過表達慢病毒表達載體質粒和pHelper 1.0與 pHelper 2.0通過共轉染入293T細胞中，37 ℃孵育過夜后改換含丙酮酸鈉和非必需氨基酸的DMEM完全培養基繼續培養,72 h后將細胞培養基以4 ℃ 3 000 r/min離心15 min，棄沉淀，將含有慢病毒顆粒的上清液分裝后，凍存于-80 ℃。

1.4 Real time定量PCR法測定病毒滴度

24孔板每孔加入500 μL培養基，接種約1 ×105個293 T細胞。次日，準備7個每管含有90 μL培養基的無菌Ep管；將待測定病毒原液10 μL加入到第一個管中，混勻后，取10 μL加入到第二個管中，繼續相同操作直到最后一管。待測細胞每孔吸去90 μL培養基，分別加入稀釋好的病毒溶液，將細胞放入37 ℃，5%CO2培養箱中培養24 h，加入新鮮培養基500 μL繼續培養24 h后，抽提RNA進行RT-qPCR檢查細胞中目的基因的拷貝數。Real time定量PCR目的基因引物序列如下：PRMT2-P3：5′-AAT TCC GTG GTG TTG TCG-3′；PRMT2-P4：5′-AAG GTC CGC TGG ATT GAG-3′。內參引物序列如下：Actin1：5′-GTG GAC ATC CGC AAA GAC-3′； Actin2：5′-AAA GGG TGT AAC GCA ACT A-3′。反應結束后得到Ct值，Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數。

1.5 Western blot

PRMT2表達慢病毒感染293T細胞后72 h,將細胞裂解液(10 mol/L HEPES,10 mmol/L KCl,1 mmol/L EDTA,pH 8.0,0.1% NP-40,1 mmol/L DTT,1 mmol/L PMSF和0.5 mmol/L Na3VO4)置冰上預冷，30 min后制備抽提細胞蛋白。12% SDS-PAGE 膠電泳分離，轉膜。5%牛奶封閉45 min后，孵育Flag 一抗(1∶3 000)1 h，而后孵育羊抗小鼠IgG(1∶4 000) 1 h。化學熒光系統( Pierce,IL)檢測。

2 結 果

2.1 PRMT2 Tet-on表達載體的構建及鑒定

參照Lentiviral Expression System說明書構建PRMT2慢病毒載體,并通過測序檢驗(圖1)。結果顯示: PRMT2序列成功插入到GV308載體AgeI/EcoRI 雙酶切位點,測序證實序列與實驗設計的堿基序列一致。

圖1 PRMT2慢病毒表達載體構建 A：GV308載體； B：載體酶切電泳(1：Marker，2：載體酶切產物，3：未酶切載體)； C：PRMT2基因PCR擴增電泳圖 (1：Marker，2：擴增產物)；D：重組載體PCR鑒定(1，2：陰性對照，3：陽性對照，4：Marker，5～12：PRMT2 1～8號重組子)

2.2 PRMT2慢病毒載體的包裝及病毒滴度測定

病毒包裝質?；旌衔锖虶V308/PRMT2重組質粒載體通過脂質體共轉染293T宿主細胞48 h，收集培養基進行病毒滴度測定,結果發現，在本次滴度檢測中，10-4μL組樣品和Control組樣品的Ct值存在顯著差異，所以認為在10-4μL組樣品中存在病毒顆粒。假定該組樣品含有至少1個病毒顆粒，則病毒的滴度為：2.0 ×108TU/mL(圖2，表1)。

圖2 病毒滴度檢測 Real-time PCR檢測病毒滴度的熒光曲線，不同顏色曲線代表不同病毒滴度

表1不同濃度病毒感染后樣品組的Ct值及表達量分析

樣品組CtActinCtTargetgeneCtTargetgene均值△Ct=CtTargetgene均值-CtActinCON13.73------1μL13.9318.0618.0854.15518.1110-1μL13.9421.4821.57.56021.5210-2μL13.7525.6725.64511.89525.6210-3μL13.6628.8828.8315.17028.7810-4μL13.8932.0832.30518.41532.53

Ct Actin:Actin 循環數；Ct Target gene:靶基因循環數；Ct Target gene均值:兩次實驗靶基因循環數的均值；△Ct=Ct Target gene 均值- Ct Actin:兩次實驗靶基因循環數的均值與Actin 循環數的差值。

2.3 PRMT2慢病毒載體能在293 T細胞內表達

為確認PRMT2慢病毒是否可以在細胞內表達,選用PRMT2具有較低內源性表達的293T細胞作為病毒感染模型。細胞經病毒感染72 h后,用四環素誘導PRMT2蛋白表達，顯微鏡觀察293T 細胞形態變化，結果發現部分細胞形態逐漸演變成長梭形，纖維細胞樣形態，呈現上皮-間質細胞轉換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)現象(圖3)。提取總蛋白,通過Western blot檢測細胞內PRMT2-3Flag融合蛋白的表達，結果表明PRMT2-3Flag在293T細胞中具有表達(圖4)。

圖3 四環素誘導293T細胞表達PRMT2前后細胞形態改變(200×) A：無四環素誘導； B：四環素誘導后

圖4 PRMT2慢病毒表達載體在293T細胞中誘導表達PRMT2-3Flag融合蛋白 1：PRMT2慢病毒表達載體感染293T細胞，無四環素誘導；2：PRMT2慢病毒表達載體感染293T細胞，四環素誘導；3：陰性對照，293T細胞；4：陽性對照，WB標準品——SURVIVIN-3FLAG-GFP.

3 討 論

PRMTs家族是哺乳動物細胞中常見的酶類，目前發現其有11個成員，具有不同的生物學功能[13-14]。近年的研究表明，PRMTs成員與腫瘤的生成及侵襲轉移關系密切。Mathioudaki等研究表明，PRMT1的高表達與乳腺癌的進展有關[15]。Yoshimatsu等采用基因芯片檢測發現，PRMT1與PRMT6參與了肺癌和膀胱癌的增殖[16]。Al-Dhaheri等的研究表明，PRMT4(Coactivator-associated arginine methyltransferase 1,CARM1)是ERα陽性乳腺癌細胞分化和增殖的重要決定因子[17]。Frietze等的研究表明，CARM1能夠通過上調核轉錄因子E2F1而促進乳腺癌細胞的增殖[18]。

我們前期的研究結果表明，PRMT2主要表達于乳腺、甲狀腺、卵巢和子宮等雌激素相關的組織器官，而在前列腺、睪丸等雄激素相關的組織器官中表達較低[19]。而且，我們采用熒光素酶雙報告基因檢測與免疫共沉淀技術發現，在ERα陽性乳腺癌MCF7細胞中，PRMT2能與ERα直接作用，在10nM雌激素作用下能顯著提高ERα的轉錄活性[20]。以上結果提示PRMT2可能在E2/ERα信號傳導途徑中發揮著重要作用。Park等的研究表明，E2/ERα能夠上調snail與slug的表達，而下調E-cadherin的表達，促進EMT的形成，誘導卵巢癌細胞的轉移[21]。我們推測，PRMT2有可能通過E2/ERα介導，上調snail的表達，而下調E-cadherin的表達，促進EMT的形成，誘導乳腺癌細胞的侵襲轉移。EMT是一種以上皮表型缺失和間質表型獲得為主要特征的基本生理、病理現象，在胚胎發育以及細胞生長增殖中起著重要作用[22]。近年的研究表明，EMT參與了上皮性腫瘤的侵襲與轉移[23]。因此，EMT分子調控機制的研究為預防腫瘤轉移提供強有力的實驗依據。我們成功構建了PRMT2的慢病毒表達載體，感染293T細胞后在四環素的誘導下，部分細胞形態發生了明顯的間質化改變，呈現EMT現象，這提示PRMT2高表達可能促進EMT的形成，從而參與乳腺癌發生發展及轉移過程，但PRMT2具體通過何種機制參與乳腺癌發生發展及轉移過程還有待進一步闡明。

本實驗成功構建了PRMT2的慢病毒載體，并獲得了較高滴度PRMT2重組病毒，進一步實驗證實在四環素誘導下，239T細胞中該重組病毒可成功被誘導表達PRMT2-3Flag融合蛋白，由于該病毒載體具有3Flag和Puromycin抗性篩選標記，PRMT2重組病毒可進一步用于細胞和動物模型的建立，為進一步構建穩定性表達PRMT2乳腺癌細胞株和獲得PRMT2轉基因動物模型奠定了基礎，同時也為深入探索PRMT2在乳腺癌發生發展及轉移過程中的作用機制提供了強有力的生物學工具。

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TheEstablishmentandIdentificationofLentiviruswithPRMT2Expression

ZHONG Jing,YANG Xinzhi,ZHANG Yanmin,et al

(InstituteofClinicalMedicine,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo obtain Lentivirus with PRMT2 expression.MethodsPRMT2 cDNA was obtained from cDNA pool by RT-PCR,and the PRMT2 cDNA was ligated with GV308 vector; the GV308/PRMT2 plasmid confirmed by sequencing was cotranfected with pHelper 1.0 and pHelper 2.0 into 293T cells to obtain PRMT2 Lentivirus; titer of Lentivirus with PRMT2 expression was assessed by Real Time PCR; the expression of PRMT2 was induced by Doxycycline hyclate and detected by Western blot in PRMT2 Lentivirus infected 239T cells.ResultsPRMT2 Lentivirus could express PRMT2 in 239T cells.ConclusionLentivirus with the expression of PRMT2 was successfully established.

PRMT2; lentivirus; gene therapy

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.01.019

2014-09-04；

2014-11-29

國家自然科學基金青年項目(31200573)、國家自然科學基金面上項目(81272906)和湖南省自然科學基金(12JJ3116)

*通訊作者，Email:Zhongjing2002@hotmail.com

R737.9

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(此文編輯：秦旭平)