反復照射建立食管癌放射抗性細胞系方法的重復性和穩定性研究

楊延靈，薛曉英，冉玉格，張玉峰，李 鋒，楊 曄

（河北醫科大學第二醫院放療科，河北石家莊050000）

反復照射建立食管癌放射抗性細胞系方法的重復性和穩定性研究

楊延靈，薛曉英*，冉玉格，張玉峰，李 鋒，楊 曄

（河北醫科大學第二醫院放療科，河北石家莊050000）

目的 探討射線反復照射方法建立食管癌放射抗性細胞系的重復性及穩定性，并觀察輻射抗性細胞與其親代細胞之間的放射敏感性的差異。方法 應用射線對人食管鱗狀細胞癌細胞TE13進行反復照射，累計劑量120 Gy，建立具有放射抗性的細胞系TE13R120。采用細胞克隆形成實驗測定2種細胞的放射生物學參數，檢測其輻射抗性，采用單擊多靶模型擬合存活曲線。經連續8 d培養細胞，繪制2種細胞的生長曲線并用Logrank檢驗計算群體倍增時間。比較此次實驗結果與初次建系時結果的相似性。結果 接受120 Gy總劑量照射后，TE13R120較TE13表現出明顯的放射抗性，TE13R120的放射生物學參數D0、Dq、N均高于TE13（2.36、2.17、2.50vs1.90、1.11、1.80），SF2、α/β均低于TE13（0.53、2.67vs0.73、8.00）。TE13R120的細胞群體倍增時間為20.70 h，長于親代TE13（17.67 h）。該結果與此前初次建系時結果相似。結論 應用射線反復照射并逐步篩選建立輻射抗性細胞系的方法可靠，能建立具有穩定輻射抗性表型的細胞系。

食管腫瘤;輻射耐受性;集落形成單位測定

腫瘤細胞經射線反復照射可產生放射抗性，而部分細胞的放射抗性是局控失敗的主要原因，因此應用射線反復照射建立食管放射抗性細胞系，并進行相應的分子生物學研究，對探討食管癌放射抗性形成的分子機制十分必要。既往的報道多為應用已建立的食管癌抗性細胞系進行放射生物學及分子生物學研究，但建立放射抗性細胞系的方法是否可靠、其放射抗性表型是否保持穩定目前無人評估確認。本研究應用相同的親代細胞、相同的方法重新建立放射抗性細胞系，并通過克隆形成實驗和檢測群體倍增時間的方法對其放射抗性表型的穩定性進行評估，以確認放射抗性的穩定性，從而評估該方法建立食管癌放射抗性細胞系的可靠性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 TE13為人食管鱗狀細胞癌細胞株，由日本東北大學細胞加嶺醫學研究所建株，日本岡山大學醫學部第一外科惠贈。采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI1640培養基，在37℃、5%CO2，飽和濕度的孵箱中常規培養。

1.2 方法

1.2.1 照射方法 應用高能直線加速器、6MV－X射線照射，照射野10 cm×10 cm，源皮距100 cm，吸收劑量率200 cGy/min，從培養瓶底面給予射線照射，培養瓶下加用1.5 cm組織補償膜。

1.2.2 放射抗拒細胞系TE13R120的建立 取對數生長期的TE13細胞給予200 cGy射線照射，照射后置于孵箱中繼續培養，每24 h換液1次。照射后存活的細胞再次達到指數生長期末時進行傳代培養，待新傳代的細胞穩定后給予400 cGy射線照射，重復以上過程，依次給予600 cGy、800 cGy以及10次1 000 cGy射線照射，累積劑量120 Gy，逐步篩選出具有穩定放射抗性表型的細胞系TE13R120。TE13R120細胞常規傳代5代穩定后用于以下實驗。

1.2.3 細胞形態學觀察 取對數生長期的單層細胞，倒置相差顯微鏡下觀察2種細胞的形態學差異。

1.2.4 克隆形成實驗測定放射敏感性 設定0、2、4、6和8Gy 5個劑量點，0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）消化細胞并計數，分別接種1×105指數生長期的TE13和TE13R120細胞到25 cm2培養瓶中，24 h后給予X射線照射。照射后消化細胞并計數，將細胞懸液作梯度倍數稀釋，按不同劑量點接種適量細胞到60 mm培養皿中，每個劑量點設3個平行樣，5%CO2、37℃培養箱中靜止培養直至培養皿中出現肉眼可見的克隆（10～14 d）終止培養。棄去舊培養基，PBS小心洗2次，甲醇固定15 min，0.5%結晶紫染液染色30 min，流水緩慢沖去結晶紫染液，自然晾干。肉眼直接計數克隆數或在顯微鏡下計數克隆數，≥50個細胞的集落作為一個克隆。按照以下公式計算不同劑量的存活分數。

存活分數（SF）=實驗組集落形成率/對照組集落形成率

集落形成率（PE）=對照組形成集落數/對照組種植細胞數

應用SPSS13.0軟件，采用單擊多靶模型S= 1－（1－e－D/D0）N擬合細胞存活曲線并計算放射生物學參數D0、Dq、N和SF2（照射2Gy后細胞存活分數）;LQ模型（線性二次模型）SF=e－（αD+βD2）計算α、β、α/β值。

1.2.5 繪制TE13細胞和TE13R120細胞的生長曲線 消化對數生長期的2種細胞并計數，調整細胞密度為1×104/mL，接種到24孔板，分為8組，每組3個復孔，每孔接種1×104細胞。24 h后消化第一組細胞進行計數，以后每隔24 h消化一組細胞。計算每天3個孔的細胞數的平均值，然后以天數為橫坐標，以細胞數的對數為縱坐標做半對數曲線。根據公式TD=T×log2/（logNt－LogN0），計算TE13和TE13R120細胞的群體倍增時間TD。其中T為Nt－N0的時間，N0為對數生長期理論初始值，Nt為對數生長期任一點的理論觀察值。

1.3 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行數據處理，所有實驗至少重復3次，結果以±s表示，組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗。P＜0.05為有差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞形態學 相差顯微鏡下可見正常生長的2種細胞呈單層、多邊形貼壁生長。TE13細胞之間界限不夠清楚，呈片狀生長;TE13R120細胞輪廓較清晰，細胞細長，大小不一，排列紊亂無規律，形態不規則，呈梭形或紡錘體形（圖1）。

2.2 TE13及TE13R120放射抗性 各種形式的克隆照片（圖2）。采用單擊多靶模型擬合細胞存活曲線（圖3），根據單機多靶模型及LQ模型計算出放射生物學參數 D0、Dq、N、α、β、α/β及SF2值（表1），TE13R120細胞的D0、Dq和 N值與親代細胞TE13相比均增大，α/β比值降低，提示TE13R120較其親本細胞更具放射抗性;2 Gy時存活分數SF2是代表細胞放射敏感性的重要指標，SF2越大，放射抗拒性越強，TE13R120細胞的SF2值高于親代細胞TE13，進一步說明TE13R120細胞的放射抗性增強。

2.3 細胞生長曲線的繪制 連續8 d計數24孔板中的細胞數，繪制出TE13細胞和TE13R120細胞的半對數生長曲線（圖4）。從圖中可以看出TE13R120細胞的生長速率較TE13慢。TE13R120細胞的群體倍增時間為（20.70±0.57）h，長于親代細胞TE13（17.67±0.99）h（t=2.646，P=0.024）。

表1 TE13和TE13R120放射生物學參數Table 1 Radiobiological parameters of TE13 and TE13R120

3 討 論

食管癌是世界上最常見的六大惡性腫瘤之一，手術是食管癌根治性治療手段，放療是中晚期食管癌的重要治療手段。近年來隨著精確放療技術在臨床上的應用，基本解決了放射物理學因素對食管癌放療效果的影響，局控率和生存率有所提高，食管癌放療的5年生存率能達到26.3%［1］或更高，但5年生存率較以往提高仍不明顯，局部未控和復發仍然是治療失敗的主要原因，因此放射生物學因素，即部分腫瘤細胞對放射線的抵抗可能是局部未控和復發的主要原因。

腫瘤細胞在輻射作用下可發生上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT），Zhang等［2］證實低劑量輻射可誘導乳腺癌細胞MCF－7形態發生紡錘樣改變;Kawamoto等［3］也證實，輻射可使結直腸癌細胞CaR1、DLD1失去極性，出現偽足，形成紡錘體樣改變，最終發生EMT。謝聰穎等［4］的研究觀察到放射抗拒性細胞株KYSE－150R在形態上較母株KYSE－150更加不規則，細胞呈紡錘體狀，極性消失，且KYSE－150R細胞株中波形蛋白表達顯著增加（P=0.03）。該實驗提示放療過程產生的EMT與反射抗拒的發生有關。另有研究表明發生EMT變化的細胞對放射線比較抗拒［5］。顯微鏡下觀察本研究中得出的放射抗性細胞形態，細胞細長，大小不一，排列紊亂無規律，形態不規則，呈梭形或紡錘體形，形態上符合EMT改變。克隆形成實驗顯示TE13R120細胞的D0值和SF2明顯高于放療前的腫瘤細胞，說明腫瘤細胞經放射線照射后產生了輻射抗拒。通過射線反復照射腫瘤細胞建立具有放射抗性表型的細胞系，并應用各種分子生物學實驗手段比較其與親代細胞之間的各種分子差異是揭示腫瘤細胞放射抗性形成機制的有效途徑［6］。張萍等［7］反復多次照射食管癌細胞TE13，累計劑量120 Gy，建立了放射抗性細胞系 TE13R120，TE13和TE13R120的D0值分別為1.63和2.85 Gy，SF2分別為0.55和0.64。Mitsuhashi等［8］反復照射鼠卵巢癌細胞系NMT21，建立了具有輻射抗拒性的NMT21R細胞系，D0值1.65 Gy，高于其親代細胞 NMT21 （0.97 Gy）;SF2值0.42，明顯高于NMT21（0.28）。謝聰穎等［4］的研究中發現人食管鱗癌放射抗拒細胞株KYSE－150R的SF2、D0、Dq及N值均高于母株KYSE－150。有研究表明環氧化酶2（cyclooxygenase－2，COX－2）的表達水平與腫瘤細胞放射敏感性呈負相關［9］。侯磊等［10］的研究發現輻射累計劑量在40 Gy時的Eca－109細胞COX－2的表達較親代細胞Eca－109高（P＜0.05），癌細胞放射敏感性降低（P＜0.05）。但這種反復照射建立的放射抗性細胞系其放射抗性表型是否能穩定存在，或者這種建立放射抗性細胞系的方法是否可重復或可靠，從未有人進行實驗和評估。本研究再次將TE13細胞進行重復多次照射，逐步篩選建立放射抗性細胞系TE13R120。通過克隆形成實驗檢測其與親代細胞的之間的放射敏感性差異，并測定2種細胞的群體倍增時間，將實驗結果與張萍等得出的結果進行比較，從而評價該方法建立放射抗性細胞系的可靠性以及抗性細胞所獲得的放射抗性是否穩定存在。結果顯示，本研究建立的食管癌放射抗性細胞株TE13R120的D0值和SF2值明顯高于其親代細胞TE13，與張萍等［7］的研究結果一致，說明應用電離輻射反復照射并逐步篩選建立輻射抗性細胞系的方法可靠，能建立穩定的具有輻射抗性表型的細胞系。有研究提出組織的輻射敏感性與組織內細胞的分裂頻率成正比，也就是說輻射抗拒的組織其細胞分裂較慢，而輻射敏感的組織其細胞分裂相對較快。本研究根據連續8 d測得的數據繪制了 TE13及TE13R120細胞的生存曲線，可以看出TE13R120生長速度明顯慢于TE13細胞，計算得出的2種細胞的群體倍增時間分別為20.70 h和17.67 h（P= 0.024），TE13R120較TE13的群體倍增時間明顯延長。這一結論從側面驗證了TE13R120細胞獲得了輻射抗拒性。

放射抗性細胞系TE13R120從放射生物學和細胞倍增時間上均具有穩定性，是具有穩定輻射抗性表型的細胞系。這種方法建立的放射抗性細胞系與其親代細胞有著相同背景，卻具有不同的放射敏感性，是研究腫瘤細胞放射抗性形成機制的理想實驗對比模型。

目前認為，同一細胞群可能同時存在對放射線敏感和抗拒的亞群，接受放射線照射后敏感的細胞被射線殺死，抗拒細胞在射線作用下繼續增殖，多次大劑量照射后放射敏感的細胞死亡，抗拒細胞不斷增多，使整個細胞群體輻射抗性增加;也可能是由于放射線引起分子水平上的一些變化，這些變化在細胞增殖過程中穩定的傳給后代成為突變，使后代細胞獲得放射抗拒表型。

總之，腫瘤細胞輻射抗性形成的確切機制還不確定，但無論怎樣，利用放射線反復照射逐步篩選建立放射抗性細胞系的過程基本模擬患者的放射治療過程，其輻射抗性產生的過程也應與實際治療過程中輻射抗性產生的途徑有相似性，而且本實驗顯示，該方法建立的細胞系所獲得的放射抗性穩定、可重復，是可靠的。（本文圖見封三）

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（本文編輯：許卓文）

Repeatability and stability of repeated irradiation method to establish the radioresistant esophageal cancer cell line

YANG Yan－ling，XUE Xiao－ying*，RAN Yu－ge，ZHANG Yu－feng，LIFeng，YANG Ye
Department of Radiotherapy，the Second Hospital of Heibei Medical University，Shijiazhuang，050000，China）

Objective To study the repeatability and stability of repeated irradiation method to establish the radioresistant esophageal cancer cell line and to observe the variation of radiosensitivity between the radioresistant cell line and its parental cell line.MethodsA radioresistant cell line，TE13R120，was established from a human esophageal squamous cancer cell line TE13 by repeated irradiation，120 Gy in total dose.Colony formation assay was used to calculate the radiation biology parameters and detect radiation resistance.Besides，multi－target single－hitmodel was adopted to fit dosesurvival curve of TE13 and TE13R120 cell.The cells were cultrured for 8 d，the cell growth curve was drawn to calculate the population doubling time of TE13 and TE13R120 cell.ResultsAfter radiation by 120 Gy in total dose，TE13R120 cell line showed significant radioresistance compared with its parental cells TE13.The D0，Dq，and N of TE13R120 showed siguificant radioresitance as compared with those of TE13（2.36，2.17，2.50vs1.90，1.11，1.80），but SF2，a/βwere lover in the former cell line（0.53，2.67vs0.73，8.00）.The population doubling time of TE13R120 was 20.70 h，longer than its parental cell line TE13（17.67 h）.The resultswere similarwith those of the first establish line.ConclusionTheradioresistant cell line established by repeated radiation exposures and gradually screening is reliable since it can build a stable cell line with radioresistant phenotype.

esophageal neoplasms;radiatoon tolerance;colony forming units assay

R735.1

A

1007－3205（2015）02－0300－04

2014－10－15;

2014－11－20

河北省自然科學基金項目（C2009001151）

楊延靈（1986－），女，河南開封人，河北醫科大學第二醫院醫師，醫學碩士，從事食管癌放射治療的臨床與基礎研究。

*通訊作者。E－mail：xxy6412@163.com

10.3969/j.issn.1007－3205.2015.03.015