左旋肉堿在人角膜緣上皮細胞的轉運特性

李寶全，畢建成，安翠平，李延峰，許順江

（1.河北省石家莊市第一醫院檢驗科，河北石家莊050011；2.河北省中醫院檢驗科，河北石家莊050011；3.河北醫科大學第一醫院中心實驗室，河北石家莊050031）

左旋肉堿在人角膜緣上皮細胞的轉運特性

李寶全1，畢建成2，安翠平1，李延峰1，許順江3*

（1.河北省石家莊市第一醫院檢驗科，河北石家莊050011；2.河北省中醫院檢驗科，河北石家莊050011；3.河北醫科大學第一醫院中心實驗室，河北石家莊050031）

目的檢測左旋肉堿（L-carnitine，LC）在人角膜緣上皮（human corneal limbal epithelia，HCLE）細胞的轉運特性，為進一步闡明HCLE細胞對LC的轉運機制提供實驗依據。方法 采用放射攝入實驗檢測HCLE細胞對［3H］-L-carnitine的轉運功能，并利用米氏方程（Michaelis-Menten equation）分析計算其動力學參數。結果HCLE細胞對LC的轉運過程具有飽和性和時間依賴性，并且反應體系中需要Na＋的存在。Eadie-Hofstee作圖提示HCLE細胞存在高親和力和低親合力2個肉堿轉運系統。非標記LC和乙?；笮鈮A可競爭性抑制［3H］-L-carnitine的轉運過程。結論HCLE細胞可通過主動轉運過程將淚液中的左旋肉堿攝入細胞內，發揮其生物學功能。

左旋肉堿；上皮，角膜；胞吞轉運

左旋肉堿（L-carnitine，LC）具有促進長鏈脂肪酸的β-氧化、轉運能量、抗氧化與清除自由基等多種重要生理功能［1－3］。人眼淚中可以檢測到游離及乙?；疞C存在［4］。國外有研究［5］將LC作為細胞的滲透壓保護劑添加于人工淚液中，用來治療干眼癥，可顯著改善患者的臨床癥狀，但其作用機制尚未闡明，特別是淚液中的LC是通過什么途徑被轉運入眼表上皮細胞內及其轉運特性如何尚未見報道。本研究采用放射攝入實驗檢測人角膜緣上皮（Human corneal limbal epithelia，HCLE）細胞對［3H］-L-carnitine的轉運功能，并利用米氏方程分析計算其動力學參數，旨在為進一步闡明LC在HCLE細胞的轉運機制以及臨床應用LC治療干眼癥提供實驗基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 無血清角質細胞培養基（keratinocyte serum-free medium，K-SFM）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、DMEM／F12培養基（Invitrogen-Gibco公司，美國）；［3H］-L-carnitine（GE Healthcare公司，英國）；其余試劑（Sigma公司，美國）。CO2培養箱（Heraeus公司，德國）；LS-6500型多功能液體閃爍計數器（貝克曼公司，美國）。

1.2 細胞培養 本研究所用HCLE細胞（美國波士頓Schepens眼科研究所Ilene Gipson教授惠贈）按文獻報道方法培養［6］。將復蘇傳代的HCLE細胞用無血清K-SFM培養基懸浮，接種于100 m L培養瓶中（2×104／cm2），加入25 mg／L牛垂體浸膏、0.2μg／L EGF和0.4 mmol／L CaCl2，置37℃、5%的CO2培養箱內培養至50%匯合時，更換為1∶1混合培養基（K-SFM和低鈣的DMEM／F12）繼續培養至滿匯合備用。

1.3 放射攝入實驗 將HCLE細胞接種于24孔培養板上，每孔5×105個細胞，培養細胞至80%～90%匯合。吸去培養液，在37℃環境下加入攝取緩沖液（含25 mmol／L Tris／HEPES，140 mmol／L NaCl，5.4 mmol／L KCl，1.8 mmol／L CaCl2，0.8 mmol／L MgSO4和5 mmol／L葡萄糖，p H 7.4）予孵育細胞1 h；然后加入不同濃度的［3H］-L-carnitine（0、100、200、300、400、500 nmol／L）和（或）非標記LC；非特異性攝入管加入含有過量（100倍以上）非標記LC（25 mmol／L）的攝取緩沖液；各管總放射性減去非特異性攝取管的放射性即為特異性攝取值。孵育結束后吸掉攝取緩沖液，迅速用冰冷的PBS洗滌細胞3次，每次30 s，以終止攝入反應。將剩余PBS吸干凈，加入0.2 m L細胞裂解緩沖液（含0.1 mol／L Na OH和0.1%Triton X-100）充分裂解細胞，振蕩混勻。取10μL用于蛋白定量。另取100μL加入10 m L閃爍液，在液體閃爍計數器上測定細胞內放射性強度，計算HCLE細胞攝取［3H］-L-carnitine的量。該實驗共分7組，每組做3個平行管，整個實驗重復4次。

HCLE細胞對LC的轉運特性和相關參數根據下列米氏方程，采用Eadie-Hofstee和Lineweaver-Burk（雙倒數）作圖法分析計算。v＝Vmax1×［s］／（Km1＋［s］）＋Vmax2×［s］／（Km2＋［s］）。v為攝入反應速率，Vmax為最大反應速率，Km為米氏常數，［s］為底物濃度。

1.4 孵育時間和Na＋對HCLE細胞攝?。?H］-L-carnitine的影響 按上述方法準備2板HCLE細胞，其中一板應用含有Na＋的孵育緩沖液，另一板應用不含Na＋的孵育緩沖液（將攝取緩沖液中的Na＋替換為相同濃度的膽堿）。每板24孔細胞，共分8組，每組3孔。在反應體系中加入12 nmol／L的［3H］-L-carnitine，分別孵育0、10、20、40、60、90、120、180 min。在每個時間點結束時，迅速吸出孵育緩沖液，并加入冰冷的PBS終止反應，其他細胞繼續孵育。全部時間點孵育完畢后收獲細胞，其余操作同前。

1.5 競爭抑制實驗 按上述方法準備2板HCLE細胞，其中一板用于LC抑制實驗，另一板用于乙酰化左旋肉堿（acetyl-L-carnitine，ALC）抑制實驗。每板24孔細胞，共分8組，每組3孔。在反應體系中加入12 nmol／L［3H］-L-carnitine和不同濃度（0、0.05、0.1、0.5、1、500、1 000、25 000μmol／L）的非標記LC或ALC，孵育30 min，收獲細胞。其余操作同前。測量結束后，以非標記LC或ALC濃度的對數值為橫坐標，以［3H］-L-carnitine攝入量占對照組的百分比為縱坐標，做抑制曲線，并計算各自的半數抑制濃度（50%inhibitory concen traton，IC50）值。

1.6 統計學方法 應用SPSS16.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，組間比較采用Student非配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 孵育時間和Na＋對HCLE細胞攝?。?H］-L-carnitine的影響 在反應體系中加入12 nmol／L［3H］-L-carnitine，孵育不同時間后，HCLE細胞對［3H］-L-carnitine的攝取隨著孵育時間的延長逐漸增多，二者在90 min以內呈良好的線性關系。如果將攝取緩沖液中的Na＋替換為相同濃度的膽堿，HCLE細胞對［3H］-L-carnitine的攝取在各時間點均有所下降（P＜0.01，圖1）。因此，后續實驗我們采用在Na＋存在的條件下孵育細胞30 min。

圖1 孵育時間和Na＋對人眼角膜上皮細胞轉運左旋肉堿的影響Figure 1 Time course and Na＋dependence of［3H］-L-carnitine uptake by HCLE cells

2.2 HCLE細胞攝取［3H］-L-carnitine的動力學特征 HCLE細胞對［3H］-L-carnitine的攝取具有濃度依賴性，當底物濃度＞400 nmol／L時，即達到飽和程度（圖2A）。根據米氏方程，Eadie-Hofstee作圖提示在HCLE細胞對［3H］-L-carnitine的攝取過程中，存在高親合力和低親合力2個轉運系統（圖2B）。采用Lineweaver-Burk（雙倒數）作圖法分別對高親和力和低親合力轉運進行分析計算（圖2C，2D），高親和力轉運的米氏常數（Km）和最大攝取速率（Vmax）分別為（9.48±2.7）μmol／L和（0.48±0.09）pmol·h－1·mg－1蛋白；低親合力轉運的Km和Vmax分別為（363.64±34.4）μmol／L和（5.1±0.3）pmol·h－1·mg－1蛋白。

圖2 左旋肉堿在人角膜上皮細胞的轉運特性A.飽和曲線；B.Eadie-Hofstee作圖；C.Lineweaver-Burk（雙倒數）作圖法分別對高親和力轉運進行分析；D.Lineweaver-Burk（雙倒數）作圖法分別對低親合力轉運進行分析Figure 2 Characteristics of the kinetics of［3H］-L-carnitine uptake in HCLE cells

2.3 LC和ALC對HCLE細胞攝取［3H］-L-carnitine的競爭性抑制作用 在反應體系中加入不同濃度的LC或ALC，孵育30 min后，HCLE細胞對［3H］-L-carnitine的攝取被顯著抑制，且呈濃度依賴性（圖3）。LC和ALC的IC50值分別為（1.17± 0.27）μmol／L和（345.7±37.9）μmol／L。

圖3 不同濃度的左旋肉堿和乙酰化左旋肉堿對［3H］-L-carnitine在人角膜上皮細胞轉運的抑制作用Figure 3 Concentration-dependence of the inhibitory effects of L-carnitine and acetyl-L-carnitine on the uptake of［3H］-L-carnitine by HCLE cells

3 討 論

干眼癥又稱角結膜干燥癥，是眼科的常見病，可引起上皮干燥和角膜刺激征，嚴重影響患者的生活質量。引起干眼癥的關鍵因素之一是眼表滲透壓升高導致眼表上皮細胞皺縮甚至死亡。為緩解眼內高滲狀態，人們在人工淚液中加入多種可溶性物質，平衡眼內滲透壓，有助于眼表組織細胞的生存［5］。有報道［7］認為LC具有調節滲透壓作用，可作為治療干眼癥的可溶性物質之一。臨床研究發現干眼癥患者局部應用LC可以迅速、持久地改善眼部癥狀［5］。這些結果表明LC除了有助于長鏈脂肪酸易化入線粒體形成乙?；鈮A酯類進行β-氧化以外，對保持眼內局部滲透壓的穩定具有重要作用。但左旋肉堿分子在HCLE細胞的轉運機制至今未明。

文獻［8］報道有機陽離子轉運蛋白（organic cation transporter，OCTN）可轉運肉堿進入細胞內，故又稱肉堿／有機陽離子轉運蛋白。OCTN包括OCTN1、OCTN2和OCTN3亞型，其中OCTN3僅在小鼠體內表達［9］。OCTN1和OCTN2屬于新型有機陽離子轉運體超家族成員，是與LC具有高親和力的運輸蛋白［9－10］。本研究結果表明，HCLE細胞對LC的攝取具有時間依賴性和濃度依賴性。在一定范圍內，隨著孵育時間的延長或底物濃度的增加，細胞內攝取的LC含量也逐漸增加，最終達到飽和狀態；同時，反應體系中 Na＋的存在也是HCLE細胞攝取LC的必要條件。這些特性均符合OCTN1和OCTN2轉運LC的特征。另外，本研究依據米氏方程，對實驗結果進行非線性回歸處理，Eadie-Hofstee作圖結果表明在HCLE細胞存在對LC高親合力和低親合力2個轉運系統，并且利用Lineweaver-Burk作圖法分別計算了它們的Km和Vmax值。這些結果表明，HCLE細胞除了通過OCTN1和OCTN2攝取LC外，還可能通過其他低親合力轉運系統緩慢攝取LC。這些低親合力轉運蛋白需要進一步研究證實。最后，本研究的競爭性抑制實驗結果表明，非標記LC和ALC均可顯著抑制HCLE細胞對標記LC的攝取，且呈濃度依賴性，從而證實了本反應體系的特異性。

總之，HCLE細胞可通過主動轉運過程將淚液中的LC攝入細胞內，在此過程中OCTN1和OCTN2發揮主要作用。本研究為進一步闡明LC在HCLE細胞的轉運機制以及臨床應用LC治療干眼癥提供了實驗和理論依據。

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（本文編輯：趙麗潔）

Transport of L-carnitine in human corneal epithelial cells

LI Bao-quan1，BI Jian-cheng2，AN Cui-ping1，LI Yan-feng1，XU Shun-jiang3*
（1.Department of Clinical Laboratory，the First Hospital of Shijiazhuan g City，Hebei Province，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Clinical Laboratory，the Traditional Chinese Medicine Hospital of Hebei Province，Shijiazhuan g 050011，China；3.Department of Central Laboratory，the First Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuan g 050031，China）

ObjectiveTo investigate the characteristics of L-carnitine（LC）import into human corneal limbal epithelia（HCLE）cells，and to provide an experimental basis for further study of transport mechanism of LC in human ocular epithelium.MethodsThe transport of［3H］-L-carnitine was determined using the radio uptake assay and the apparent kinetic parameters of carnitine uptake by HCLE were estimated by nonlinear regression curve fitting according to the Michaelis-Menten equation.ResultsThe uptake of LC into HCLE cells was saturable and time-dependent，and it also required the presence of Na＋in the external medium.An Eadie-Hofstee plot showed two distinct components：a high-and a low-affinity carnitine transport system in HCLE cells.The unlabelled LC and acetyl-L-carnitine competitively inhibited the uptake of［3H］-L-carnitine by HCLE cells.ConclusionL-carnitine is transported into HCLE cells from tears by an active carrier mediated transport system and exerts its biological function.

L-carnitine；epithelium，corneal；transcytosis

R322.91

A

1007-3205（2015）01-0048-04

2014－08－30；

2014－10－29

河北省醫學科學研究重點課題（20130136）

李寶全（1958－），男，山西寧武人，河北省石家莊市第一醫院主管檢驗師，從事醫學檢驗研究。

*通訊作者。E-mail：sjxu66＠sina.com

10.3969／j.issn.1007-3205.2015.01.018