高效液相色譜法同時測定降脂靈片中4種蒽醌類成分的含量

劉 敏，賈海紅，劉 彥，律 濤，樊淑彥*

（1.河北醫科大學藥學院藥物分析學教研室，河北石家莊050017；2.河北醫科大學藥學院實驗中心，河北石家莊050017）

高效液相色譜法同時測定降脂靈片中4種蒽醌類成分的含量

劉 敏1，賈海紅1，劉 彥2，律 濤2，樊淑彥1*

（1.河北醫科大學藥學院藥物分析學教研室，河北石家莊050017；2.河北醫科大學藥學院實驗中心，河北石家莊050017）

目的建立高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）同時測定降脂靈片中橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素和大黃素甲醚的含量。方法 采用HPLC測定降脂靈片中橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素和大黃素甲醚的含量，色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），以甲醇－0.1%磷酸為流動相梯度洗脫（0～5 min，40∶60～70∶30；5～10 min，70∶30～80∶20；10～15 min，80∶20～90∶10；15～25 min，90∶10），檢測波長286 nm，流速1.0 m L／min，進樣量20μL，柱溫25℃。結果在選定的色譜條件下橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃素甲醚具有良好的分離度和穩定性。橙黃決明素在16.7～134 ng范圍內線性關系良好，樣品回收率為98.7%，相對標準偏差值（relative standard deviation，RSD）為0.3%；蘆薈大黃素在11.1～89.1 ng范圍內線性關系良好，樣品回收率為98.5%，RSD為1.0%；大黃素在90.3～722 ng范圍內線性關系良好，樣品回收率為98.5%，RSD值為0.7%；大黃素甲醚在59.2～473 ng范圍內線性關系良好，樣品回收率為102.0%，RSD值為0.3%。結論HPLC同時測定降脂靈片中橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素和大黃素甲醚的含量，快速、簡便、準確、專屬性高，可以用于降脂靈片的質量控制。

降血脂藥物；蒽醌類；色譜法，高壓液相

降脂靈片收載于《中國藥典》（2010）第一部，由制何首烏、枸杞子、黃精、山楂、決明子五味中藥組成，具有補肝益腎、養血明目的作用，可用于肝腎不足型高脂血癥［1］。國內文獻［2］報道僅測定了何首烏中2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量，檢測指標較少。為了更加全面控制降脂靈片的質量，本研究建立了高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）同時測定降脂靈片中4種蒽醌類成分的含量，即決明子中橙黃決明素（Aurantio-obtusifolin，1）以及何首烏和決明子的共有成分蘆薈大黃素（Aloeemodin，2）、大黃素（Emodin，3）和大黃素甲醚（Physcion，4），現將結果報告如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國Aligent 1200高效液相色譜儀，包括四元泵、柱溫箱、自動控溫進樣器、二極管陣列檢測器，Agilent化學工作站；BP211D型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 1對照品（批號111900-201303）、2對照品（批號110795-201007）、3對照品（批號110756-200110）、4對照品（批號110758-200610）均購自中國食品藥品檢定研究院；降脂靈片（太極集團重慶桐君閣藥廠有限公司，批號1304007、1305004、1306002）；磷酸為分析純，甲醇為色譜純，水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合對照品溶液配制 分別精密稱取1、2、3、4對照品適量，分別置于25 m L量瓶中，并用甲醇溶解并稀釋至刻度，得到濃度分別為83.6、92.8、113、148 mg／L的1、2、3、4對照品儲備液。分別精密量取1.00、0.60、4.00、2.00 m L的1、2、3、4對照品儲備液置同一25 m L量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到1、2、3、4濃度分別為3.34、2.23、18.1、11.8 mg／L的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的配制 取樣品20片，去糖衣，精密稱定，研細，稱取1.5 g樣品粉末，精密稱定，置50 m L具塞錐形瓶中，加入75%甲醇25 m L，精密稱定，超聲30 min，冷卻，用75%甲醇補足減失的質量，靜置，濾過，精密量取續濾液10.00 m L，置燒瓶中，水浴蒸干，加入30%乙醇－鹽酸溶液（10∶1）溶液15 m L，置水浴加熱水解1 h，立即冷卻，用氯仿強力振搖提取4次，每次15 m L，合并氯仿液，置水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解，移置25 m L量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液既得供試品溶液。

2.1.3 陰性對照溶液 按照處方比例，取枸杞子、黃精和山楂適量，按照制劑工藝制備缺制何首烏和決明子的空白樣品，再按照供試品溶液的配制制備方法制備陰性對照溶液。

2.2 色譜條件和系統適應性試驗 Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相，甲醇－0.1%磷酸，梯度洗脫（0～5 min，40∶60～70∶30；5～10 min，70∶30～80∶20；10～15 min，80∶20～90∶10；15～25 min，90∶10），流速1.0 m L／min，檢測波長286 nm，進樣量20μL，柱溫25℃。

取混合對照品溶液、供試品溶液以及陰性對照溶液在上述色譜條件下進樣，記錄色譜圖（圖1）。1～4的保留時間分別為13、14、19、24 min，分離度均＞1.5，理論塔板數均＞10 000。陰性對照不干擾含量測定。

圖1 降脂靈片中4種蒽醌類成分的HPLC色譜圖A.對照品；B.樣品；C.陰性對照1.橙黃決明素；2.蘆薈大黃素；3.大黃素；4.大黃素甲醚Figure 1 HPLC of four anthraquinones of Jiangzhiling tablet

2.3 線性關系考察 取混合對照品溶液，按照“2.2”項下色譜條件，分別進樣5、10、15、20、30、40μL。記錄色譜圖，分別以1～4的進樣量為X（ng）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線。化合物1的回歸方程為Y＝5.49X－2.08（r＝1.000 0）（n＝6），在16.7～134 ng范圍內線性關系良好；化合物2的回歸方程為Y＝1.41X－0.87（r＝0.999 9）（n＝6），在11.1～89.1 ng范圍內線性關系良好；化合物3的回歸方程為Y＝3.79X－4.42（r＝1.000 0）（n＝6），在90.3～722 ng范圍內線性關系良好；化合物4的回歸方程為Y＝1.69X－3.60（r＝1.000 0）（n＝6），在59.2～473 ng范圍內線性關系良好。

2.4 精密度試驗 取混合對照品溶液，連續進樣5次，記錄色譜峰面積，得到1～4化合物的峰面積相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值分別為0.49%、0.66%、0.64%、0.67%。

2.5 穩定性試驗 取樣品粉末1.5 g，精密稱定，按照“2.1”項下供試品溶液的配制供試品，于0、2、4、8、12 h進樣測定，1～4化合物的峰面積RSD值分別為0.38%、1.10%、0.17%、0.17%。結果表明供試品溶液在室溫下12 h內穩定。

2.6 重現性試驗 取同一批號樣品（批號1304007）5份，每份1.5 g，精密稱定，按照“2.1”項下方法配制供試品溶液，分別進樣測定，1～4化合物的平均含量為44.8、39.3、265、159 g／g，RSD分別為0.3%、2.1%、0.7%和0.8%。

2.7 回收率試驗 取已知含量的降脂靈20片（批號1304007），研細后稱取6份，每份0.75 g，精密稱定后分別加入1～4對照品溶液適量，按照“2.1”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，按外標法計算得1～4的平均回收率分別為98.7%、98.5%、98.5%和 102.0%，RSD（n＝6）分別為0.3%、1.0%、0.7%和0.3%。

2.8 樣品含量測定 取3批本品，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，分別進樣測定，按外標法計算1～4含量，結果見表1。

表1 樣品含量測定結果Table 1 DeterminationResultsof samples（n＝3，μg／g）

3 討 論

3.1 提取方法的選擇 用50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、50%甲醇、75%甲醇和100%甲醇超聲［3－5］提取再進行后處理，發現75%甲醇提取樣品的組分含量高且分離度良好。同時對比不同超聲時間，分析顯示超聲時間為25 min的待測組分峰面積達到峰值，25 min后各組分峰面積均變化不大，故選擇30 min為最佳提取時間。最終確定提取方法為“2.1”項下供試品溶液配制的方法。

3.2 檢測波長的選擇 根據文獻［6－9］報道，蒽醌類化合物的測定波長為254、284、430和440 nm，本研究用二極管陣列檢測器分別對1～4化合物進行全波長掃描得知，1～4的最大吸收波長分別為286、254、254、254 nm，并且對比了254、284、286、430和440 nm下各組分的吸收，結果顯示286 nm下所測組分含量較大，基線平穩。同時為了兼顧各組分的檢測信號和檢測靈敏度，所以選擇286 nm為檢測波長。

3.3 流動相的選擇 分別考察了乙腈－水、甲醇－水及甲醇－0.1%磷酸－四氫呋喃［10］流動相系統，發現前兩種流動相系統對待測組分的分離影響沒有顯著差異，而甲醇－0.1%磷酸－四氫呋喃流動相未能使待測組分完全分離，分離度無法達到要求，考慮到乙腈的毒性較大且經濟成本較高，故本實驗選擇甲醇－水流動相系統。參考有關文獻［11－12］，進一步考察了添加0.1%磷酸對待測組分的影響，結果顯示添加0.1%磷酸后，峰型得到了改善且基線穩定，分離度良好，故確定以甲醇－0.1%磷酸為流動相。

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（本文編輯：趙麗潔）

圖2 膽囊壁增厚呈網格狀改變

討 論 膽道感染主要是膽囊炎和不同部位的膽管炎，分為急性、亞急性和慢性炎癥。膽道感染主要是膽道梗阻、膽汁瘀滯造成，膽道結石是導致梗阻的最主要原因，而反復感染可促進結石形成并進一步加重膽道梗阻。急性膽囊炎是膽囊管梗阻和細菌感染引起的炎癥，約95%患者有膽囊結石（呈結石性膽囊炎），5%患者無膽囊結石（呈非結石性膽囊炎）；膽囊內無結石存在，其病因仍不清楚，多見于男性、老年患者，約70%患者伴有動脈粥樣硬化，其病理變化與急性結石性膽囊炎相似，但病情發展更迅速，致病因素主要是膽汁瘀滯和缺血，導致細菌的繁殖且供血減少，更容易出現膽囊壞疽、穿孔［1］。

急性膽囊炎視炎癥改變的程度不同可分3型：①單純性膽囊炎，膽囊稍腫脹，壁輕度增厚，黏膜充血水腫，膽汁正常或略混濁；②化膿性膽囊炎，膽囊腫大，囊壁充血水腫明顯增厚，膽汁混濁或呈膿性，膽囊與周圍組織粘連或形成膽囊周圍膿腫；③壞疽性膽囊炎，膽囊極度腫大，膽囊內壓力增高，可發生壞死穿孔并發局限性或彌漫性腹膜炎，壞疽性膽囊炎是膽囊炎癥的一種特殊類型，極為少見，好發于老年男性及糖尿病患者，因其發病急，病情重，發展快，而又常合并內科多種疾病，且患者多為中老年人，機體功能低下，應激反應遲鈍，一旦發病，則病情迅速惡化，易并發中毒性休克和多器官功能障礙綜合征，重者威脅生命［2］。

急性非結石性膽囊炎是一種十分兇險的急腹癥，臨床少見，發病率占急性膽囊炎的4%～8%，應提高警惕，早期診斷十分重要［3］。急性非結石性膽囊炎起病急，病因復雜，術前診斷困難，易誤診，提高對本病的認識有重要的臨床意義，超聲檢查是診斷本病的首選方法，CT也有助于診斷，早期手術切除膽囊是最重要的治療手段［4］。

本例患者為老年男性，主要癥狀為腹脹、右上腹疼痛伴惡心，體征為腸鳴音活躍，可聞及氣過水聲，首診為不完全性腸梗阻可以成立。但忽略了患者右上腹疼痛的癥狀，過分依賴腹部透視結果及腸鳴音活躍，可聞及氣過水聲的腸梗阻體征表現，右上腹疼痛癥狀因不完全性腸梗阻疾病而被掩蓋，導致誤診和延誤治療。當時只是給予內科對癥非手術治療，效果不好，而后才做肝膽超聲，超聲的聲像圖表現完全符合急性非結石性膽囊炎，及時幫助臨床明確了診斷，給予急診手術，挽救了患者的生命。急性非結石性膽囊炎大多由急性膽囊炎發展而來，具有病因復雜、發病急劇、病情險惡、并發癥多、治療困難、病死率高的臨床特點［5］。超聲可以幫助臨床明確診斷，及時制定正確治療方案，防止嚴重并發癥發生。

［參考文獻］

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（本文編輯：趙麗潔）

Simultaneous determination of four anthraquinones in Jiangzhiling tablet by HPLC

LIU Min1，JIA Hai-hong1，LIU Yan2，LV Tao2，FAN Shu-yan1*
（1.Department of Phamaceutical Analysis，the School of Pharmacy，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China；2.Laboratory Center，the School of Pharmacy，Hebei Medical University，Shijiazhuan g 050017，China）

ObjectiveTo develop a simultaneous analysis method for Aurantio-obtusifolin，Aloeemodin，Emodin and Physcion inJiangzhiliingtablet by HPLC.MethodsDetermination of the Aurantio-obtusifolin，Aloeemodin，Emodin and Physcion inJiangzhiliingtablet by HPLC，the four constituents were separated on an Kromasil C18column（250 mm×4.6 mm，5μm）using a mobile phase consisted of methanol－0.1%phosphoric acid in water at the detection wavelength of 286 nm，gradient elution program（0－5 min，40∶60－70∶30；5－10 min，70∶30－80∶20；10－15 min，80∶20－90∶10；15－25 min，90∶10），the flow rate was 1.0 m L／min，the injection volume 20μL and the column temperature 25℃.ResultsAurantio-obtusifolin，Aloeemodin，Emodin and Physcion were separated from imputities well.Aurantio-obtusifolin showed a good linear relationship in the range of 16.7－134 ng，the average recovery was 98.7%，and its RSD rate 0.3%；the range of Aloeemodin 11.1－89.1 ng，the average recovery 98.5%，and its RSD rate 1.0%；the range of emodin 90.3－722 ng，the average recovery 98.5%，and its RSDrate 0.7%；Physcion in range of 59.2－473 ng，the average recovery 102.0%，and its RSD rate 0.3%.ConclusionThe method is rapid，simple，accurate and with good reproducibility and can be used in quality control ofJiangzhilingtablet.

hypolipidemic agents；anthraquinones；chromatography，high pressure liquid

R972.6

A

1007-3205（2015）01-0052-04

2014－10－15；

2014－10－31

劉敏（1989－），女，山東微山人，河北醫科大學藥學院理學碩士研究生，從事藥物分析研究。

*通訊作者。E-mail：fanshuyan＿ykd＠163.com；

10.3969／j.issn.1007-3205.2015.01.019