PKR、eIF-2α在IL-24誘導膠質瘤細胞凋亡中的作用研究

胡長偉，尹港峰，王希瑞，張文高，趙文清，李文玲

(1.河北省滄州市中心醫院神經外三科，河北滄州061000;2.河北省人民醫院功能神經外科，河北石家莊050051)

PKR、eIF-2α在IL-24誘導膠質瘤細胞凋亡中的作用研究

胡長偉1，尹港峰1，王希瑞1，張文高1，趙文清2，李文玲2

(1.河北省滄州市中心醫院神經外三科，河北滄州061000;2.河北省人民醫院功能神經外科，河北石家莊050051)

目的探討白細胞介素24(interleukin-24，IL-24)對膠質瘤細胞凋亡的影響以及雙鏈RNA蛋白激酶R (double-stranded RNA-dependent protein kinase，PKR)、真核細胞翻譯起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF-2α)在其中的作用。方法 將載有IL-24基因的 Ad5F35型重組腺病毒(Ad-IL-24)及載有增強綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因作為對照的Ad5F35型重組腺病毒(Ad-EGFP)轉染入膠質瘤細胞U87和U251中，應用流式細胞儀檢測膠質瘤細胞U87和U251中的凋亡情況，并檢測U87和U251各組中PKR、磷酸化PKR(phosphorylation-PKR，pPKR)、eIF-2α及磷酸化eIF-2α(phosporylation-eIF-2α，peIF-2α)的表達情況。結果在膠質瘤細胞U87和U251中轉染IL-24后的細胞凋亡率為12.3%和13.0%，明顯高于空白組與對照組，并且轉染IL-24的膠質瘤細胞中PKR、pPKR、eIF-2α及peIF-2α的表達增加。結論IL-24可能在膠質瘤細胞中通過上調PKR、eIF-2α的表達及其活化，促進膠質瘤細胞凋亡。

神經膠質瘤;白細胞介素類;eIF-2激酶

白細胞介素24(interleukin-24，IL-24)是目前研究較廣泛的一種腫瘤抑制因子，其在多種腫瘤中的抗癌特性已被證實。雙鏈RNA蛋白激酶R(doublestranded RNA-dependent protein kinase，PKR)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，是干擾素所介導的抗病毒以及促使細胞凋亡功能的主要調解因子之一，它參與多種刺激因子介導的凋亡［1-2］。本研究探討IL-24通過調控PKR的表達和活化，進而激活真核細胞翻譯起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF-2α)，促進膠質瘤細胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 膠質瘤細胞 人膠質瘤細胞U87與U251購自中國科學院上海細胞生物學研究所，用DMEM培養液在37℃、5%CO2培養箱中傳代培養。

1.2 重組腺病毒 載有IL-24基因的重組腺病毒Ad5F35-IL24(Ad-IL-24)及載有增強綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因作為對照的Ad5F35型重組腺病毒(Ad-EGFP)由北京市本元正陽基因技術有限公司提供，Ad5F35-IL24病毒效價為2.8×1014pfu/L，Ad5F35-EGFP病毒效價為5.8×1014pfu/L。

1.3 細胞凋亡檢測 將轉染Ad-IL-24、Ad-EGFP及空白對照的膠質瘤細胞收集清洗后，分為IL-24組、對照組和空白組加用Annexin V和PI雙染，然后進行流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。Annexin V陰性和PI陰性的細胞為正常細胞，Annexin V陽性和PI陰性的細胞為凋亡細胞;Annexin V陽性和PI陽性的細胞為壞死細胞。

1.4 Western blot檢測 常規提取腫瘤細胞總蛋白，BCA法測量蛋白濃度，調整樣品的總蛋白濃度為同一值。取各樣本100μg蛋白，10%～12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺膠體電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離，電泳后電轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，封閉后加入一抗IL-24(1∶1 000，美國Santa Cruz公司)、PKR、磷 酸化 PKR(phosphorylation-PKR，pPKR)、eIF-2α、磷酸化 eIF-2α(phosporylation-eIF-2α，peIF-2α)(1∶500)，以 GAPDH為內參，然后在HRP標記的二抗中孵育后顯色，定影。采用美國UVP lab work 4.60圖像分析系統軟件進行半定量分析。

1.5 統計學方法 應用SPSS11.5統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 IL-24促進膠質瘤細胞的凋亡 在膠質瘤細胞U87中，轉染Ad-IL-24的細胞凋亡率為12.3%，明顯高于對照組的4.0%和空白組的3.0%(P＜0.05);而在U251細胞中，IL-24組的凋亡率為13. 0%，也明顯高于對照組的5.4%和空白組的3.6% (P＜0.05)。這說明高表達的IL-24可以有效促進膠質瘤細胞的凋亡。見圖1。

2.2 IL-24通過調節PKR和eIF-2α促進膠質瘤細胞凋亡 在轉染Ad-IL-24的U87和U251膠質瘤細胞中，PKR和pPKR的表達明顯高于對照組和空白組，并且作為PKR下游通路蛋白的eIF-2α及其活化形式的peIF-2α的表達在轉染Ad-IL-24后明顯增加。說明在膠質瘤細胞中IL-24的表達可能通過上調PKR及eIF-2α的表達和活化，促進細胞的凋亡增加。見圖2。

圖1 流式細胞儀檢測U87和U251細胞系轉染IL-24后細胞凋亡情況*P＜0.05與空白組、對照組比較(q檢驗)Figure 1 Flow cytometry detected the apoptosis rates of U87 and U251 cells after being transfected with IL-24

3 討 論

膠質瘤的發生發展與多種細胞因子的異常表達有關，目前認為膠質細胞中抑癌基因的突變會造成抑癌因子表達的下調或缺失，從而引發一系列的細胞信號通路的改變，并最終引發細胞的癌變，成為膠質瘤細胞［3］。

圖2 Western blot檢測U87和U251細胞中轉染IL-24后PKR與e IF-2α蛋白表達情況Figure 2 Western blotting detected the expression of PKR and eIF-2αin U87 and U251 untransfected transfected with IL-24

IL-24是一種新發現的具有抗腫瘤作用的細胞因子，系IL-10家族成員。最新的一些研究專注于IL-24/黑色素瘤分化相關因子 7(melanoma differentiation-associated gene-7，MDA-7)基因的抗癌作用。IL-24又名MDA-7基因是在研究惡性黑色素細胞瘤時發現。IL-24是一種具有細胞因子特性和抑瘤因子功能雙重功效的蛋白質。正常生理濃度的IL-24參與調節免疫反應，而在超生理濃度下會顯示非常好的抗腫瘤特性。近年來，在多種腫瘤中均有IL-24抑癌作用的研究［4-5］。

PKR是一種調節細胞凋亡的蛋白分子，目前發現PKR的活化可介導多種腫瘤細胞的凋亡增加，從而發揮抗腫瘤特性［6-8］。PKR基因定位于人染色體2p21-2，PKR基因是由一個含有許多潛在調控元件的啟動子所轉錄，通過2個雙鏈RNA綁定區域被激活［9］。激活的PKR可以調控多個下游靶位，其中包括eIF-2α、核因子κB，可以抑制蛋白的合成，最后抑制細胞的生長和促進細胞凋亡［10-13］。

本研究將IL-24轉染入膠質瘤細胞中，發現轉染IL-24的細胞凋亡率明顯增高，這說明IL-24可以促進膠質瘤細胞的凋亡。有研究發現，在肺癌細胞中IL-24可上調PKR的表達，從而增加肺癌細胞的凋亡率，發揮抑制肺癌細胞作用［14］。本研究發現，在IL-24高表達的膠質瘤細胞中PKR和pPKR的表達均增高，eIF-2α和peIF-2α的表達同樣是增加的。eIF-2α是PKR下游調節細胞凋亡的重要通路信號蛋白。因此，我們認為在膠質瘤細胞中，IL-24可通過上調PKR的表達及活化增加下游eIF-2α的表達與活化，從而促進細胞的凋亡。

［1］García MA，Meurs EF，Esteban M.The dsRNA protein kinasePKR:virus and cell control［J］.Biochimie，2007，89(6/ 7):799-811.

［2］夏君.抗病毒蛋白PKR的結構和功能［J］.中國免疫學雜志，2013，29(2):205-209.

［3］趙文清，李文玲，張學新，等.膠質母細胞瘤中 p16、RB、cyclinD1、CDK4基因表達異常的研究［J］.河北醫科大學學報，2002，23(6):332-334.

［4］Park MA，Hamed HA，Mitchell C，et al.A serotype 5/3 adenovirus expressing MDA-7/IL-24 infects renal carcinoma cells and promotes toxicity of agents that increase Ros and ceramide levels［J］.Mol Pharmacol，2011，79(3):368-380.

［5］Chang S，Yang J，Chen W，et al.Antitumor activity of an adenovirus harboring human IL-24 in colon cancer［J］.Mol Biol Rep，2011，38(1):395-401.

［6］徐揚，王建，辛曉燕，等.siRNA靶向抑制PKR基因及其對宮頸癌Hela細胞凋亡的影響［J］.西南國防醫藥，2010，20(5): 465-467.

［7］Montero H，Trujillo-Alonso V.Stress granules in the viral replicationcycle［J］.Viruses，2011，3(11):2328-2338.

［8］del Castillo CS，Hikima J，Ohtani M，et al.Characterization and functional analysis of two PKR genes in fugu(Takifugu rubripes)［J］.Fish Shellfish Immunol，2012，32(1):79-88.

［9］Lee SB，Esteban M.The interferon-induced double stranded RNA activated protein kinase induces apoptosis［J］.Virology，1994，199(2):491-496.

［10］Saelens X，Kalai M，Vandenabeele P.Translation inhibition in apoptosis:caspase-dependent PKR activation and eIF2-α phosphorylation［J］.J Biol Chem，2001，276(45):41620-41628.

［11］Sudhakar A，Ramachandran R，Ghosh S，et al.Phosphorylation of serine 51 in initiation factor 2alpha(eIF2 alpha)promotes complex formation between eIF2alpha(P) and eIF2Bcauses inhibition in the guaninenucleotide exchange activity of eIF2B［J］.Biochemistry，2000，39(42):129-138.

［12］羅遠材，瞿全新，糜若然.宮頸病變組織中PKR、p-PKR、p-EIF2α表達及意義［J］.天津醫藥，2010，38(1):20-22，后插1.

［13］Freidrich I，Ben-Bassat H，Levitzki A.Activation of dsRNA dependentprotein kinase PKR in Karpas299 does not lead to celldeath［J］.Cancer Biol Ther，2005，4(7):734-739.

［14］Pataer A，Vorburger SA，Barber GN，et al.Adenoviral transfer of the melanomadifferentiation-associated gene 7(mda7)induces apoptosis of lung cancer Cells via up-regulation of thedoublestranded RNA-dependent protein kinase(PKR)［J］.Cancer Res，2002，62(8):2239-2243.

(本文編輯:劉斯靜)

Role of PKR and eIF-2α in apoptosis of glioma induced by IL-24

HU Chang-wei1，YIN Gang-feng1，WANG Xi-rui1，ZHANG Wen-gao1，ZHAO Wen-qing2，LI Wen-ling2
( 1． Third Department of Neurosurgery，Cangzhou Central Hospital，Hebei Province， Cangzhou 061000，China; 2． Department of Functional Neurosurgery，Hebei General Hospital，Shijiazhuang 050051，China)

Objective To investigate the regulation of interleukin-24(IL-24)indouble-stranded RNA-dependent protein kinase(PKR)，eukaryotic initiation factor 2α(eIF-2α)-induced apoptosis of glioma cells.MethodsAdenovirus Ad5F35-IL24(Ad-IL-24)and the control virus Ad5F35-enhanced green fluorescent protein(Ad-EGFP)were transfected into U87 and U251 glioma cells.Then，U87 and U251 glioma cell apoptosis were tested using flow cytometry，and the expression of PKR，phosphorylation-PKR(pPKR)，eIF-2αand phosporylation eIF-2α(peIF-2α)in U87 and U251 of different groups were detected by western blot.Results The cell apoptosis rates were significantly increased to 12.3%and 13.0%in U87 and U251 glioma cells after being transfected with IL-24，and the expression of PKR，pPKR，eIF-2αand peIF-2α increased after being transfected with IL-24 in glioma cells.ConclusionIL-24 may regulate PKR，eIF-2α expression and activation to promote apoptosis of glioma cells.

glioma;interleukins;eIF-2 kinase

R730.264

A

1007-3205(2015)02-0141-03

2014-08-22;

2014-10-31

胡長偉(1980-)，男，蒙古族，河北省滄州市中心醫院主治醫師，醫學碩士，從事神經外科疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.02.007