結核感染T細胞檢測在骨關節結核中的診斷價值

賈晨光，姚黎明*，李秀武，劉豐勝，章志華，張金文

(1.河北省胸科醫院骨科，河北石家莊050041;2.河北省胸科醫院病理科，河北石家莊050041; 3.河北省胸科醫院科教處，河北石家莊050041)

結核感染T細胞檢測在骨關節結核中的診斷價值

賈晨光1，姚黎明1*，李秀武2，劉豐勝1，章志華3，張金文3

(1.河北省胸科醫院骨科，河北石家莊050041;2.河北省胸科醫院病理科，河北石家莊050041; 3.河北省胸科醫院科教處，河北石家莊050041)

目的評價結核感染T細胞檢測(tuberculous infection of T cells spot test，T-SPOT.TB)在疑似骨關節結核病中的診斷價值。方法 選取80例確診為骨關節結核患者和44例排除結核患者。分別進行抗酸染色、結核菌培養、實時熒光定量PCR檢測及T-SPOT.TB，比較并分析檢測結果。結果T-SPOT.TB的敏感度、特異度和準確度分別為82.5%、75.0%、79.8%。T-SPOT.TB的陽性檢出率顯著高于抗酸染色、結核分枝桿菌培養(P＜0.05)，而在不同疾病部位(脊柱、四肢關節)及不同病程分組間陽性檢出率差異無統計學意義(P＞0.05)。結論T-SPOT.TB可以作為骨關節結核病的重要輔助診斷方法。

結核，骨關節;結核感染T細胞檢測;診斷

目前結核病仍是嚴重危及人類健康的主要傳染病之一。據世界衛生組織報道，全球每年新發結核病患者約890萬。據第5次全國結核病流行病學調查顯示，我國已有1/3以上的人口感染了結核菌，15歲及以上人群活動性肺結核的患病率為459/10萬，涂陽肺結核患病率為66/10萬［1］。骨關節結核病占結核患者總數的1%～5%。控制結核病的關鍵問題是快速診斷并及時治療。結核病的實驗室診斷是發現傳染源的主要途徑和手段，也是確定結核病診斷和化療方案的重要依據［2］。目前結核感染T細胞檢測(tuberculous infection of T cells spot test，TSPOT.TB)已經列入歐美等發達國家的結核病診療指南，以協助診斷結核感染的存在［3］。該檢測是利用結核菌感染者外周血單核細胞中存在結核特異的效應T淋巴細胞，這些淋巴細胞在受到結核桿菌特異抗原刺激后分泌γ干擾素而設計的T細胞免疫斑點試驗，具有較高的靈敏度和特異度。本研究旨在探討T-SPOT.TB在診斷骨關節結核病中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年5月—2014年5月河北省胸科醫院骨科收治的懷疑骨關節結核的患者124例，男性66例，女性58例，年齡14～83歲，平均(47.9±23.5)歲。根據病史、臨床特點、影像學表現、組織病理學和病原學檢查結果以及抗結核治療效果進行診斷，分為確診骨關節結核患者80例，排除結核患者44例。見表1。

表1 124例懷疑骨關節結核患者臨床資料Table 1 Clinical characteristics of 124 patients with suspected osteoarticular tuberculosis (例數，%)

1.2 方法 所有患者進行T-SPOT.TB，與臨床診斷結果進行比較。另外，對確診骨關節結核患者組分別進行涂片抗酸染色、結核菌培養、實時熒光定量PCR檢測結核分枝桿菌，比較陽性檢出率。根據病變部位(脊柱/四肢關節)及病程(即住院前出現癥狀的時間:≤6個月，＞6～12個月，＞12～24個月，＞24～48個月)分別評估T-SPOT.TB陽性檢出率。

1.2.1 T-SPOT.TB 受試者用肝素鋰抗凝采血管抽取5 mL靜脈血，即刻輕柔顛倒混勻3～5次，使抗凝劑充分溶解。3 h內將采集的全血分裝到3種不同的培養管中，“T”為添加結核特異性抗原ESAT-6、CFP-10的測試培養管，“N”為本底對照培養管，“P”為添加非特異刺激原植物血凝素的陽性對照培養管，每種培養管分裝1 mL，分裝前需要顛倒混勻3次以上，分裝后輕柔顛倒培養管5次并立刻置于37℃培養箱中，靜置培養(22±2)h后取出，離心收集上清液，然后用雙抗體夾心法定量檢測上清中γ干擾素的含量，最后計算刺激培養系統中特異性升高的γ干擾素量判定是否為結核桿菌感染陽性。

1.2.2 涂片抗酸染色 所有診斷為骨關節結核病患者的標本處理均依據“中國防癆協會指導方針”進行［4］。固體組織研碎后采用4%NaOH處理10 min，其他液體標本直接采用4%NaOH處理10 min。6 000 r/min離心15 min，棄上清，用少量生理鹽水混勻沉淀物，均勻涂抹于載玻片上，自然干燥后，行抗酸染色鏡檢。

1.2.3 結核菌培養 余下的懸浮液置于培養基上進行結核菌培養。置于37℃恒溫培養箱培養，接種后3、7 d觀察，此后每周觀察1次，有菌落生長后用抗酸染色驗證，若同時為陽性記錄為陽性，否則為陰性，至第8周仍無細菌生長記錄為陰性。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測 活組織檢查或手術標本采用熒光定量試劑盒檢測結核分枝桿菌DNA，具體操作按試劑盒說明書進行。標本經去污和離心后，得到50μL DNA提取液，混勻后沸水煮10 min，4℃放置6～8 h。10 000 r/min離心5 min，取上清用于實時熒光定量PCR檢測。

1.3 統計學方法 應用SSPS14.0統計軟件進行數據分析，計數資料以百分率表示，分別采用χ2檢驗和四格表的診斷性試驗分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 T-SPOT.TB的敏感度、特異度和準確度 TSPOT.TB的敏感度為82.5%，特異度為75.0%，準確度為79.8%，陽性預測值為85.7%，陰性預測值為70.2%。見表2。

表2 T-SPOT.TB的敏感度、特異度和準確度Table 2 Diagnostic performance of T-SPOT.TB assay in 124 osteoarticular tuberculosis patients (n=124，例數，%)

2.2 不同疾病部位和病程T-SPOT.TB陽性檢出率比較 80例骨關節結核患者中包括脊柱結核55例和關節結核25例;病程≤6個月30例，＞6～12個月25例，＞12～24個月15例，＞24～48個月10例。不同疾病部位和病程T-SPOT.TB陽性檢出率差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表3。

表3 不同疾病部位和病程T-SPOT.TB陽性檢出率比較Table 3 The positive rate of T-SPOT.TB for different locations and courses of osteoarticular tuberculosis (例數，%)

2.3 不同檢測方法陽性檢出率比較 T-SPOT.TB的陽性檢出率顯著高于涂片抗酸染色、結核分枝桿菌培養，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表4。

表4 不同檢測方法陽性檢出率比較Table 4 The positive rates of four test methods in osteoarticular tuberculosis (例數，%)

3 討 論

骨關節結核病是臨床常見且難以進行病原學診斷的疾病。主要原因之一就是骨關節結核病早期病程隱匿，典型的臨床癥狀不明顯，易被患者和醫生所忽視，且結核分枝桿菌培養時間長，敏感性低，以致臨床上經常誤診和漏診，因此診斷早期骨關節結核及非典型癥狀疑似結核感染尤為困難。以往診斷骨關節結核病一般根據典型的臨床癥狀、影像學表現、活組織檢查或手術標本病理檢查以及結核菌培養等綜合方法。傳統方式仍有各自的缺點和不足:結核分枝桿菌涂片抗酸染色的敏感性很低，本研究中抗酸染色陽性檢出率僅為11.2%;結核菌培養耗時較長(需6～8周)，本研究中其陽性檢出率為40.0%，容易延誤病情的診治;近年來，實時熒光定量PCR檢測技術在診斷骨關節結核病領域中應用愈加廣泛，但PCR技術的陽性檢出率在不同研究中差異較大［5］，究其原因可能有活組織檢查或手術取材部位菌群分布不均，宿主蛋白質、血液及真核細胞DNA環境變異等因素。此外，以上組織標本均通過外科活組織檢查或手術途徑獲得，患者均需承受有創性操作帶來的痛苦與風險。

T-SPOT.TB作為一種新的酶免疫檢測方法［6］，它的敏感度、特異度高，創傷小(僅需靜脈采血5 mL)，操作簡單，需要的時間少(2 d就能出檢測結果)。近年來，已逐漸被各大醫院及檢驗單位所接受。該檢測方法及其相關試劑盒已被美國FDA批準用于臨床診斷結核分枝桿菌感染及結核病［7］。其應用的原理是，機體感染結核分枝桿菌后，體內會產生特異性的效應T淋巴細胞，其在體外再次受到結核菌特異性抗原的刺激時，會釋放γ干擾素，通過檢測γ干擾素的水平或計數分泌γ干擾素的數量，判斷機體是否感染結核分枝桿菌，輔助診斷結核病［8］。由于選擇的特異性抗原只存在于結核桿菌，且是在卡介苗和大多數非結核桿菌中普遍缺失的RD1區基因片段所表達的蛋白［9］，因此T-SPOT.TB檢測的特異性會明顯高于結核菌素試驗。

本研究結果顯示，T-SPOT.TB在診斷骨關節結核病的敏感度為82.5%，接近于先前研究報道診斷肺外結核病的84.0%［10］。其陽性檢出率遠高于抗酸染色(11.2%)、結核菌培養(40.0%)，略高于實時熒光定量PCR檢測(71.2%)。可見T-SPOT.TB對骨關節結核病的檢出效能明顯優于抗酸染色及結核菌培養，與實時熒光定量PCR檢測陽性率大體相同。考慮到以上傳統檢測方式均需借助侵入性有創操作獲得，故T-SPOT.TB有其不可比擬的優勢。在不同感染部位方面，T-SPOT.TB診斷脊柱結核的陽性檢出率為83.64%，略高于四肢關節結核的80.00%，差異無統計學意義。提示在不同病變部位導致的機體免疫應答基本相同，可廣泛應用于脊柱、四肢關節骨結核病的輔助診斷，具有良好的一致性。此外，依病程分組比較，T-SPOT.TB在不同組別中的陽性檢出率差異無統計學意義。提示T-SPOT.TB陽性檢出率與病程長短無明顯相關性，可作為診斷早期骨關節結核病的重要輔助參考指標。

綜上所述，T-SPOT.TB可以作為診斷骨關節結核病的重要輔助方法，可嘗試應用于診斷篩選早期與不典型癥狀的疑似骨關節結核病領域。

［1］全國第五次結核病流行病學抽樣調查技術指導組，全國第五次結核病流行病學抽樣調查辦公室.2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告［J］.中國防癆雜志，2012，34(8): 485-508.

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［7］Mazurek GH，Jereb J，Lobue P，et al.Guidelines for using the QuantiFERON-TB gold test for detecting Mycobacterium tuberculosis infection United States［J］.MMWR Recomm Rep，2005，54(RR-15):49-55.

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(本文編輯:趙麗潔)

Application value of tuberculous infection of T cells spot test in diagnosing osteoarticular tuberculosis

JIA Chen-guang1，YAO Li-ming1*，LI Xiu-wu2，LIU Feng-sheng1，ZHANG Zhi-hua3，ZHANG Jin-wen3
( 1． Department of Orthopedics，Chest Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050041，China; 2． Department of Pathology，Chest Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050041，China; 3． Department of Education Information，Chest Hospital of Hebei Province， Shijiazhuang 050041，China)

Objective To investigate the value of tuberculous infection of T cells spot test(TSPOT.TB)in the diagnosis of osteoarticular tuberculosis.MethodsThe study enrolled 80 patients who were confirmed osteoarticular tuberculosis and 44 did not have active tuberculosis.Acid-fast staining，mycobacterial culture，real-time quantitative PCR were respectively performed for the patients.The results were compared and analyzed.ResultsThe sensitivity，specificity，accuracy for osteoarticular tuberculosis diagnosis by T-SPOT.TB assay were 82.5%，75.0%and 79.8%.The positive rate of T-SPOT.TB was significantly higher than that of acid-fast staining，mycobacterial culture(P＜0.05).But，there were no statistical difference in different locations(spine or extremities joint)and courses between groups.ConclusionThe results suggested that T-SPOT.TB assay could provide useful aids in the diagnosis of osteoarticular tuberculosis.

tuberculosis，osteoarticular;tuberculous infection of T cells spot test;diagnosis

R529.2

A

1007-3205(2015)02-0148-04

2014-12-19;

2015-01-08

河北省科學技術研究與發展計劃項目(12277754)

賈晨光(1975-)，女，河北唐縣人，河北省胸科醫院副主任技師，醫學碩士，從事骨科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:yaolm24@126.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.02.010