甩片改良抗酸法與FQ-PCR技術在腦脊液抗酸菌檢查中的應用分析

呂翠環，李玉靜，孫志平，李 卓，呂 莎，鄭立恒

(1.河北省胸科醫院檢驗科，河北石家莊050041;2.河北省胸科醫院骨科，河北石家莊050041; 3.河北省胸科醫院呼吸科，河北石家莊050041)

甩片改良抗酸法與FQ-PCR技術在腦脊液抗酸菌檢查中的應用分析

呂翠環1，李玉靜1，孫志平1，李 卓2*，呂 莎3，鄭立恒1

(1.河北省胸科醫院檢驗科，河北石家莊050041;2.河北省胸科醫院骨科，河北石家莊050041; 3.河北省胸科醫院呼吸科，河北石家莊050041)

目的評價腦脊液改良抗酸染色法與實時熒光定量聚合酶鏈反應(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)法診斷結核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)的意義。方法 TBM患者81例，采集腦脊液檢測標本，分別采用離心甩片改良抗酸染色法、實時FQ-PCR法檢測抗酸桿菌。結果81例改良抗酸染色法陽性率66.7%(54/81)高于FQ-PCR方法陽性率50.6%(41/81)，差異有統計學意義(P＜0.05)。結論在診斷TBM方面，改良抗酸染色方法顯著優于FQ-PCR方法。

結核，腦膜;染色與標記;實時聚合酶鏈反應

結核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是最常見的肺外結核病之一，致殘率和致死率高，其預后與早期診斷和早期治療有密切關系，但是因其臨床表現不典型，確診十分困難。目前對結核的診斷手段較多，但有的特異度低、有的準確度低，各有其局限性。實時熒光定量聚合酶鏈反應 (fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)技術反應靈敏、特異度高、高效快速，這些優勢是涂片法及培養法難以達到的［1］。改良抗酸染色法是在普通涂片抗酸染色基礎上，對腦脊液涂片進行特殊處理，以發現細胞內的抗酸桿菌，提高陽性率。本研究回顧性分析河北省胸科醫院檢驗科81例TBM腦脊液標本資料，并進行FQ-PCR檢測與改良抗酸染色檢測的比較，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013—2014年河北省胸科醫院確診為TBM的患者81例，男性47例，女性34例，年齡14～68歲，平均(32.1±12.3)歲。收集所有患者的腦脊液進行改良抗酸染色及FQ-PCR檢測，送檢時間為發病后3～37 d。

1.2 診斷標準 所有患者經過臨床診斷、實驗室診斷、影像學診斷、臨床治療評價等，根據中華醫學會編著的《臨床診療指南結核病學分冊》標準確診［2］。

1.3 方法

1.3.1 改良抗酸染色［3］標本處理，收取腦脊液1.0～1.5 mL，置于Thermo Scientific Cytospin 4型細胞離心涂片機中制備涂片。用4%多聚甲醛固定15 min，0.3% TritonX-100浸泡30 min。抗酸染色:①石炭酸復紅溶液染色10 min后，流水輕輕沖洗;②加3%鹽酸酒精溶液脫色1～2 min至近無色，流水輕輕沖洗;③加亞甲基藍溶液染色30 s，流水輕輕沖洗，待干，鏡檢;④每次染色，同時做陰、陽性質控片，質控片染色結果正確，方可進行臨床標本閱片;⑤由有3年以上工作經驗人員在光學顯微鏡油鏡下觀察。

1.3.2 FQ-PCR檢測 收取腦脊液1 mL進行腦脊液結核分枝桿菌脫氧核糖核酸檢測，儀器設備為達安基因有限公司生產的7600型實時熒光定量檢測系統，試劑盒為中山大學達安基因有限公司生產的結核分枝桿菌核酸擴增熒光試劑盒。嚴格按照試劑說明書操作，每次操作均加入質控品。

1.4 統計學方法 應用SPSS17.0統計學軟件進行數據分析，計數資料以百分率表示，采用配對χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

改良抗酸染色法陽性率66.7%(54/81)高于FQ-PCR法50.6%(41/81)，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 2種方法檢測結果比較Table1 Comparison of the results of two methods (例數)

3 討 論

結核病是全球性的公共衛生問題［4］，TBM是肺外結核中最嚴重的結核病，由結核桿菌引起，早期診斷困難，病殘率和病死率高，是結核病死亡的主要原因［5］。臨床對TBM的診斷主要依據腦脊液、臨床表現以及腦影像學［6］來判斷患者的病情程度。腦脊液是能夠直接反映中樞神經系統病理變化的標本，是實驗診斷TBM的理想標本。如果在腦脊液中檢測出結核桿菌及其特異度標記物等，則能夠為臨床診斷TBM提供依據。目前對結核桿菌的檢測方法有許多，培養法是診斷結核病的金標準，但其需要5～6周的時間，直接涂片顯微鏡檢查是目前所有方法中比較快速的，但其靈敏度和特異度低［7］，這些方法各有其局限性。

本研究結果顯示，甩片法改良抗酸染色陽性率為66.7%，高于于慶杰等［8］的報道研究。甩片改良抗酸法應用離心甩片機將腦脊液中有形成分通過小孔聚集在載玻片上，形成直徑約0.5 cm薄膜，菌量集中，易于找到，且利用多聚甲醛將細胞等物質進行充分固定，因結核桿菌是一種緩慢的細胞內寄生菌［9］，利用TritonX-100對細胞膜的滲透性，使抗酸染色試劑滲入細胞內，從而使細胞內的抗酸菌易于著色［10］。

FQ-PCR法作為一種較理想的檢測TBM的方法，在醫學檢驗學中得到廣泛的應用，理論上，只要樣本中有一個病原體存在，就可以檢測到。一般實驗室能檢出10～100基因拷貝，而目前其他病原體抗原檢測方法一般需要105～107個病原體才可檢測到。FQ-PCR法已有研究資料表明［11-12］，病原體數量與感染性疾病病情的輕重程度、傳染性及治療效果均有相關性。FQ-PCR方法可進行準確的定量檢測，特異度更強，操作簡單快速。有報道［13］基因探針方法檢測TBM結核分枝桿菌脫氧核糖核酸敏感度33%～83%，特異度100%。Amin等［14］報道用FQ-PCR法檢測腦脊液結核菌陽性率為42.1%。而FQ-PCR法檢測腦脊液結核桿菌具有更高的敏感度與特異度［15-16］。本研究結果顯示，81例TBM標本中FQ-PCR法檢測結核分枝桿菌脫氧核糖核酸陽性41例(50.6%)，與報道基本相符。

綜合分析甩片改良抗酸法操作相對簡單，無需昂貴的設備，實驗室條件要求相對較低，成本相對低廉，而FQ-PCR法則各個方面要求條件嚴格，成本相對增加，加重患者負擔。本研究結果顯示，對于TBM的實驗室診斷，腦脊液標本應用甩片法改良抗酸染色檢測結核桿菌陽性率大大提高，而檢測成本并未相應提高，是單項指標中較理想的項目，而FQPCR法檢測結核菌如果條件允許也不失為一種好的檢測方法。

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(本文編輯:趙麗潔)

Analysis of acid fast bacilli in cerebrospinal fluid with modified acid-fast method and FQ-PCR technique

LV Cui-huan1，LI Yu-jing1，SUN Zhi-ping1，LI Zhuo2*，LV Sha3，ZHENG Li-heng1
( 1． Department of Clinical Laboratory，the Chest Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050041，China; 2． Department of Orthopedics，the Chest Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050041，China; 3． Department of Respiratory Medicine，the Chest Hospital of Hebei Province， Shijiazhuang 050041，China)

Objective To evaluate united test significance in the diagnosis of tuberculous meningitis(TBM) with modified acid-fast staining method of cerebrospinal fluid and real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR).MethodsCerebrospinal fluid samples from 81 patients with TBM were detected for Mycobacterium tuberculosis respectively with centrifugal modified acid-fast staining method and real-time FQ-PCR.Results The positive rate of modified acidfast staining 66.7%(54/81)was significantly higher than that of FQ-PCR 50.6%(41/81)，there was significant difference between the two methods(P＜0.05).ConclusionModified acid-fast staining method is significantly better than FQ-PCR in the diagnosis of TBM.

tuberculosis，meningeal;staining and labeling;real-time polymerase chain reaction

R529.3

A

1007-3205(2015)02-0170-03

2014-10-15;

2014-12-09

河北省科學技術研究與發展計劃項目(13277794D);河北省科學技術研究與發展指導計劃項目(132777269)

呂翠環(1966-)，女，河北石家莊人，河北省胸科醫院主任技師，醫學學士，從事臨床檢驗學研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.02.018