扶正散結(jié)湯拆方對(duì)Lewis肺癌小鼠血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血管抑素及內(nèi)皮抑素的影響

·論著·

作者單位：100853北京，中國人民解放軍總醫(yī)院中醫(yī)科[陳超(碩士研究生)、竇永起、陳慧彬、滕鳴健]；桂林75180部隊(duì)131分隊(duì)旅醫(yī)院[陳超(碩士研究生)]

扶正散結(jié)湯拆方對(duì)Lewis肺癌小鼠血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血管抑素及內(nèi)皮抑素的影響

陳超陳慧彬滕鳴健竇永起

【摘要】目的探討通過檢測(cè)血清相關(guān)細(xì)胞因子分析扶正散結(jié)方抑制腫瘤生長(zhǎng)在微血管生成方面作用機(jī)制的可行性。方法C57BL/6小鼠80只，隨機(jī)分成空白組、模型組、順鉑組、扶正組、化痰組、活血組、解毒組和聯(lián)合用藥組，每組10只，造模后分別給與相應(yīng)藥物干預(yù)，連續(xù)14天，同時(shí)稱取體質(zhì)量及測(cè)量腫瘤長(zhǎng)短徑，于第14天取血后留取血清，以ELISA法檢測(cè)小鼠血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管抑素(angiostatin，AS)、內(nèi)皮抑素(endostatin，ES)的表達(dá)。結(jié)果腫瘤生長(zhǎng)速度以順珀與聯(lián)用組最慢，其余中藥組次之，模型組生長(zhǎng)最快。VEGF含量，以聯(lián)用組含量最低，其次為活血組與順珀組，其余中藥組含量較高(P<0.01)。AS含量，各組均較空白組降低(P<0.05)，模型組尤為顯著(P<0.01)，以順珀組及聯(lián)用組降低程度最輕。各組ES含量較空白組均明顯降低(P<0.01)，以模型組最著，聯(lián)用組及扶正組與DDP組最接近(P>0.05)，化痰組、活血組和解毒組ES含量則較低(P<0.01)。結(jié)論扶正散結(jié)湯各組拆方中藥均能抑制腫瘤生長(zhǎng)，其作用機(jī)制可能與抑制VEGF、上調(diào)AS和ES的水平從而達(dá)到抑制血管生成有關(guān)；血清學(xué)檢測(cè)可以作為研究中藥在腫瘤微血管生成方面作用機(jī)制的輔助方法。

【關(guān)鍵詞】扶正散結(jié)方；Lewis肺癌；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子；血管抑素；內(nèi)皮抑素

作者簡(jiǎn)介：陳超(1984- )，2012級(jí)在讀碩士研究生。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合臨床。E-mail：chenchao618@163.com

通訊作者：竇永起(1965- )，碩士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合臨床。E-mail：dyqi_301@yeah.net

【中圖分類號(hào)】R285.5

收稿日期：(2014-05-04)

Study on the effect of separated prescriptionsFuzhengSanjieRecipe on Lewis lung cancer mouse serum VEGF, AS and ESCHENChao，CHENHui-bin，TENGMing-jian，etal.Departmentoftraditionalmedicine，PLAGeneralHospital，Beijing100853，China.

Correspondingauthor：DOUYong-qi,E-mail：dyqi_301@yeah.net

Abstract【】ObjectiveTo investigate the feasibility analysis of Fuzheng Sanjie Recipe angiogenesis in tumor growth in terms of the mechanism of inhibition by serum cytokines. Methods80 C57BL/6 mice were randomly divided into controlgroup, Model group, DDP group,Fuzheng group,Huatan group, Huoxue group,Jiedu group andCombination group. After establishing the model of Lewis Lung Cancer, give them different drugs intervention for 14 days and thenmeasured the diameter of tumor and the mice weight. ELISA was used to detect the changes of peripheral serum VEGF，AS and ES in the mice. ResultsTumor growth in combination group and DDP group were slow, followed by the rest TCM groups, the tumor growth in model group was the fastest. the content of VEGF levels in the combination group was the lowest, followed by Huoxue group and DDP group, the rest of the TCM group content was higher (P<0.01). AS content, compared with the control group, other groups were decreased (P<0.05), model group was particularly significant (P<0.01), with DDP group and combination group decreased less. ES content, compared with the control group, the other group were significantly lower (P<0.01),the model group decreased most, and there was no difference between the combination group,Fuzheng group and DDP group, the ES content in Huatan group , Huoxue group and Jiedu group were lower (P<0.01). Conclusion Separated Fuzheng Sanjie recipe can all inhibit the growth of tumors, and its mechanism may be related to inhibiting the expression of VEGF and upregulation the content of AS and ES；the results of serological test can be used as an auxiliary method of TCM in terms of tumor angiogenesis mechanisms.

【Key words】FuzhengSanjieRecipe；Lewis lung cancer；Vascular endothelial growth factor；Angiostatin；Endostatin

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散轉(zhuǎn)移與血管形成密切相關(guān)，而腫瘤血管的形成與多種因素相關(guān)。自擬扶正散結(jié)湯是臨床經(jīng)驗(yàn)方，用于腫瘤的長(zhǎng)期維持治療具有良好效果。課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)該方及其拆方對(duì)腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管抑素(angiostatin，AS)、內(nèi)皮抑素(endostatin，ES)等有明顯調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察Lewis肺癌小鼠血清中血管生成相關(guān)因子的含量，來探討其作為輔助方法分析扶正散結(jié)方抑制腫瘤生長(zhǎng)在微血管生成方面作用機(jī)制的可行性。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與瘤株

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57BL/6小鼠，SPF級(jí)，雄性6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(軍)2012-0004。

瘤株：Lewis Lung Cancer瘤株由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。

1.2試劑及儀器

順鉑(順氯氨鉑，cisplatin，DDP)(齊魯制藥公司，批號(hào)：2030111DB)、小鼠VEGF試劑盒(Andygene，批號(hào)：HTAC017)、AS試劑盒(Andygene，批號(hào)：HTAC017)、ES試劑盒(Andygene，批號(hào)：HTAC017)、Elisa試劑盒、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE53CS，上海亞榮生化儀器廠)、酶標(biāo)儀、臺(tái)式冷凍離心機(jī)(1-15K，SIGMA)、DHG-9240A電熱恒溫箱(北京陸希科技有限公司)。

1.3藥品及制備

扶正散結(jié)湯主要配伍組份拆分為益氣扶正(簡(jiǎn)稱扶正，由生黃芪25 g、女貞子15 g組成)、化痰散結(jié)(簡(jiǎn)稱化痰，由半夏15 g、天南星10 g組成)、活血化瘀(簡(jiǎn)稱活血，由莪術(shù)15 g、郁金15 g組成)；清熱解毒(簡(jiǎn)稱解毒，由白花蛇舌草15 g、半枝蓮15 g組成)；四組聯(lián)用(簡(jiǎn)稱聯(lián)用，由生黃芪25 g、女貞子15 g、半夏15 g、天南星10 g、莪術(shù)15 g、郁金15 g、白花蛇舌草15 g、半枝蓮15 g組成)。以上藥物均由中國人民解放軍總醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)鑒定后，傳統(tǒng)方法水煎、過濾、60℃濃縮，分別制成含生藥濃度為0.8 g/mL、0.4 g/mL、0.6 g/mL、0.6 g/mL、2.45 g/mL的藥液，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4小鼠Lewis肺癌移植瘤制備

參考文獻(xiàn)方法[1]復(fù)制小鼠Lewis移植瘤模型。液氮中取出Lewis肺癌瘤株于37℃溫水中復(fù)蘇，離心后調(diào)整濃度至1×107/mL，在無菌條件下接種于2只C57BL/6小鼠右腋皮下，10天后脫頸處死小鼠，取生長(zhǎng)良好腫瘤組織，用生理鹽水洗凈剪碎后加生理鹽水勻漿器研磨，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算活細(xì)胞數(shù)>95%，調(diào)整腫瘤細(xì)胞懸液濃度為1×107/mL。于每只小鼠右腋皮下接種0.1 mL，方法同上，傳代3次后接種于70只小鼠。

1.5動(dòng)物分組

C57BL/6小鼠80只，隨機(jī)分為8組：空白組、模型組、DDP組、扶正組、化痰組、活血組、解毒組、聯(lián)用組，每組10只。除空白組外，其余各組小鼠接種肺癌移植瘤細(xì)胞，于接種第2天開始各中藥組給予相應(yīng)中藥煎劑0.2 mL/d，給藥劑量參照文獻(xiàn)[2]計(jì)算方法給藥；空白組、模型組、DDP組給予等體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃14天。同時(shí)DDP組在接種第2天開始予以腹腔注射DDP 2 mg/(kg·d)，1次/2天，共注射7次，其余各組予以腹腔注射生理鹽水10 mL/kg。給藥第14天小鼠稱重后，固定小鼠股骨動(dòng)脈取血，靜置0.5小時(shí)后，放入離心機(jī)中，2000 r/min離心15分鐘取上清液，-20℃低溫冰箱保存。

1.6觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.6.1小鼠體質(zhì)量變化的測(cè)定從灌胃第1天起，每?jī)商煸诠辔盖胺Q取小鼠體質(zhì)量。

1.6.2腫瘤生長(zhǎng)情況的測(cè)定接種成瘤后，每2天測(cè)量1次荷瘤小鼠腫瘤最長(zhǎng)徑(a)和最短徑(b)，以腫瘤體積=ab2/2(腫瘤最長(zhǎng)徑=a，最短徑=b)表示腫瘤大小，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。

1.6.3血清VEGF、AS、ES的測(cè)定采用雙夾心ELISA法，按試劑盒說明步驟測(cè)定VEGF、AS、ES的含量。以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(optical density，OD)，測(cè)定在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

1.7數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量

表1　扶正散結(jié)湯拆方對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響 ±s，g)

注：與空白組比較， a P<0.05， b P<0.01；與模型組比較 c P<0.05， d P<0.01；與DDP組比較， e P<0.05， f P<0.01

注：與模型組比較aP<0.05，bP<0.01；與DDP組比較，cP<0.05，dP<0.01

2結(jié)果

2.1小鼠體質(zhì)量的變化

自灌胃第1天開始，隔日稱取小鼠體質(zhì)量，空白組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)較快；模型組小鼠體質(zhì)量有所增長(zhǎng)，但增長(zhǎng)緩慢；DDP組小鼠注射DDP后體質(zhì)量增長(zhǎng)不明顯，幾乎無明顯變化；各中藥組大部分小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)較模型組及DDP組快(P<0.05)。

2.2腫瘤生長(zhǎng)曲線的變化

皮下接種第7天，皮下可以觸及大小約25 mm3腫塊，所有造模小鼠均出現(xiàn)腫塊，成瘤率100%，藥物干預(yù)的初始階段，各組腫瘤生長(zhǎng)速度差別不大，移植瘤體積無明顯差異(P>0.05)。隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)，各組腫瘤均逐漸增大，生長(zhǎng)速度也逐漸加快。造模后13天，模型組腫瘤的平均體積最大，其次為活血組(P<0.05)，其余各組腫瘤體積均較小(P<0.01)；與DDP組比較，以聯(lián)用組生長(zhǎng)最慢，與DDP組無明顯差異，其余各配伍組體積增長(zhǎng)較快(P<0.01)。從生長(zhǎng)曲線可以看出各個(gè)藥物干預(yù)組生長(zhǎng)速度較模型組減低，其中順鉑組生長(zhǎng)速度最慢、聯(lián)用組次之，生長(zhǎng)速度從慢到快依次排列為順鉑組、聯(lián)用組、解毒組、化痰組、扶正組、活血組、模型組。見圖1。

圖1　扶正散結(jié)湯拆方對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線的變化的影響

2.3ELISA檢測(cè)血清VEGF、AS、ES結(jié)果

VEGF含量:與空白組比較，模型組、DDP組及各配伍組分組VEGF含量均明顯升高(P<0.01)，聯(lián)用組升高較少(P<0.05)；與模型組比較，DDP組、各中藥組含量均顯著降低(P<0.01)，以聯(lián)用組、DDP組和活血組尤為明顯；與DDP組比較，聯(lián)用組含量降低(P<0.05)，活血組與DDP組含量無明顯差異，其余中藥組含量較高(P<0.01)。

AS含量:與空白組比較，各組含量均下降(P<0.05)，模型組尤為顯著(P<0.01)，DDP組及聯(lián)用組降低程度最低；與模型組比較，各組血清AS含量下降程度均較輕(P<0.01)，以順鉑組和聯(lián)用組尤輕；聯(lián)用組與DDP組比較AS含量無顯著性差異，其中以聯(lián)用組AS含量為各中藥組最高，其次為活血組，其余各中藥組含量較低，差異有顯著性意義(P<0.05)。

ES含量:與空白組比較，各組ES含量均明顯降低(P<0.01)，以模型組最著；與模型組比較，各組血清ES含量下降程度均較輕(P<0.01)，以順鉑組和聯(lián)用組尤輕；聯(lián)用組及扶正組與DDP組最接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，化痰組、活血組和解毒組ES含量則較低(P<0.01)。

表3　扶正散結(jié)湯拆方對(duì)小鼠Lewis肺癌血清VEGF、

注：與空白組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01；與DDP組比較，eP<0.05，fP<0.01

3討論

血管生成促進(jìn)因子主要包括VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，其中VEGF為主要的促血管生成因子，主要通過影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的PI3K等信號(hào)通路而發(fā)揮調(diào)控作用[3]；血管生成抑制因子主要包括AS、ES、凝血栓蛋白(TSP-1)等[4]，AS主要通過抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移來發(fā)揮其抗腫瘤的作用[5]，而ES具有廣泛的抗癌活性，能干擾新的血管生成，是最有效的內(nèi)源性血管生長(zhǎng)抑制劑之一[6-8]。中醫(yī)藥在抑制腫瘤生長(zhǎng)、穩(wěn)定和控制病灶、延緩復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面，已得到廣泛認(rèn)可。自擬扶正散結(jié)湯是臨床經(jīng)驗(yàn)方，根據(jù)不同情況采用益氣扶正、化痰散結(jié)、活血化瘀和清熱解毒法等治法聯(lián)合加減，不僅可以提高放化療的效果、減輕放化療副反應(yīng)，并且可作為腫瘤病人長(zhǎng)期維持治療的方藥。課題組實(shí)驗(yàn)研究表明該方及其各配伍組份均可抑制腫瘤生長(zhǎng)，其機(jī)制與抑制腫瘤細(xì)胞分裂、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡及對(duì)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等方面的作用有關(guān)[9]，同時(shí)課題組也發(fā)現(xiàn)該方配伍組份能降低腫瘤組織中VEGF、升高ES的表達(dá)，表明該方不同配伍組份可通過對(duì)不同因子的影響而抑制腫瘤血管生成，進(jìn)而發(fā)揮抑瘤作用。

本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)量小鼠體質(zhì)量、繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線可以看出，各組中藥對(duì)腫瘤生長(zhǎng)均有抑制作用，其中以順鉑組效果最好，聯(lián)用組與之相當(dāng)，其他中藥組較弱，但在體質(zhì)量增長(zhǎng)方面，各中藥組體質(zhì)量均優(yōu)于順鉑組，說明中藥組可改善生存質(zhì)量，綜合抑瘤效果和體質(zhì)量增長(zhǎng)評(píng)價(jià)，以中藥聯(lián)用組為最優(yōu)。血清檢測(cè)結(jié)果顯示，各組VEGF、AS及ES血清含量變化與組織學(xué)檢測(cè)的結(jié)果一致，且與腫瘤生長(zhǎng)體積的變化相吻合。和順鉑組一樣，各拆方配伍組及聯(lián)用組可以抑制VEGF升高的趨勢(shì)，減輕AS、ES的降低程度；而在抑制VEGF方面聯(lián)用組優(yōu)于順鉑組，活血組與順鉑組相當(dāng)，在上調(diào)AS、ES水平方面以聯(lián)用組效果最好，與順鉑組相當(dāng)，扶正組次之。表明該方各配伍中藥在抑制VEGF、促進(jìn)AS、ES的表達(dá)方面具有各自不同的特點(diǎn)，而以四法聯(lián)用效果最優(yōu)，可以通過影響血管生成來抑制腫瘤生長(zhǎng)。

綜上所述，扶正散結(jié)湯拆方能抑制腫瘤生長(zhǎng)，并改善生存質(zhì)量；可通過抑制VEGF、上調(diào)AS、ES的表達(dá)水平來抑制血管生成，進(jìn)而發(fā)揮抑瘤作用。血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果與組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致，表明通過檢測(cè)血清中血管生成相關(guān)因子的含量，作為輔助方法分析中藥抑制腫瘤生長(zhǎng)在微血管生成方面的作用機(jī)制是可行的。

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(本文編輯：董歷華)