益氣養心飲對實驗性心力衰竭大鼠TRL4通路的影響

·論著·

益氣養心飲對實驗性心力衰竭大鼠TRL4通路的影響

王萌鄧悅劉美含沈奕岑

【摘要】目的通過觀察益氣養心飲改善實驗性心力衰竭大鼠心室重構、炎癥狀態相關指標，探討中藥對TLR4通路表達及炎性因子產生的影響和分子機制。方法選擇4月齡Wistar雄性大鼠300只隨機分出假手術組10只，剩下290大鼠造模篩選出30只，按心臟彩色多普勒超聲測心臟射血分數(ejection fraction, EF)<60%隨機區組分為模型組、中藥組、纈沙坦組，每組各10只，以纈沙坦為陽性對照組，觀察益氣養心飲對慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)大鼠toll樣受體4(toll-like acceptor 4, TLR4)、核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)相關炎癥因子表達的影響，并取心肌組織切片，采用HE在光鏡下觀察損傷程度。采用單因素方差分析對所有實驗數據進行統計學處理。結果(1) 與CHF模型組相比，各給藥組CHF大鼠TNF-α、IL-6水平均明顯下降，有統計學意義(P=0.000<0.05)；(2) CHF模型組大鼠心肌TLR4、NF-κB蛋白表達明顯高于假手術組(P=0.000<0.05)；而各給藥組TLR4、NF-κB蛋白表達較CHF模型組均明顯下降(P=0.000<0.05)；(3) 各給藥組CHF大鼠心肌組織經HE染色觀察,其損傷均有不同程度的減輕。結論益氣養心飲能夠改善CHF大鼠的炎癥狀態，降低CHF大鼠血漿與心肌中TNF-α、IL-6的含量，抑制心肌組織TLR4、NF-κB炎癥因子表達，可能是其抑制慢性心力衰竭進程的機制之一。

【關鍵詞】慢性心力衰竭；炎癥；益氣養心飲；大鼠

【中圖分類號】R541.6

作者簡介：王萌(1981- )，女，碩士，醫師。研究方向：心血管方向。E-mail: 793674799@qq.com

通訊作者：鄧悅(1962- )，博士，教授，博士生導師。研究方向：心血管方向。E-mail: dyue7138@sina.com

收稿日期：(2014-04-08)

作者單位：130000 長春中醫藥大學附屬醫院傳統診療中心(王萌)，心內科(鄧悅)；吉林大學第三醫院中日聯誼醫院電診科(劉美含)；長春市南關區正一堂中醫門診(沈奕岑)

Effect ofYiqiYangxinDecoction on TRL4 pathways in rats with chronic heart failureWANGMeng,DENGYue,LIUMei-han,etal．TheAffiliatedHospitaltoChangchunUniversityOfChineseMedicine,Changchun130000,China

Correspondingauthor:DENGYue,E-mail:dyue7138@sina.com

Abstract【】Objective We study effects of Chinese medicine on the expression of toll-like acceptor 4 (TLR4) pathway and the molecular mechanisms of inflammatory factors by observing the ventricular remodeling and inflammatory states of rats with experimental heart failure improved by Yiqi Yangxin Decoction. Methods From the 300 4-month-old male Wistar rats, 10 rats were randomly assigned to the sham-operation group. 30 rats were selected from the rest of 290 rats by molding method, and then randomly assigned to the model group, the Chinese Medicine group and Valsartan group (10 in each group) according to the ejection fraction (EF) <60%. With Valsartan group as the positive control, we investigated the expression of TLR4, nuclear factor-κB (NF-κB), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) of rats with chronic heart failure (CHF). Myocardial damage was observed by microscope. All the data were processed by one-way ANOVA. Results (1) Compared with the CHF model group, the levels of TNF- α and IL - 6 in each group were decreased significantly (P < 0.05). (2) The proteins expression of TLR4 and NF-κB in myocardium of the CHF model group was significantly higher than which in sham operation group (P<0.05). The expression of TLR4 and NF-κB proteins in each group was significantly decreased compared with the CHF model group (P<0.05). (3) The damage of myocardial tissue in each group of rats with CHF, observed by HE immunohistochemical staining, was alleviated to varying degrees. Conclusion could improve the inflammation of rats with CHF, decrease the content TNF-α and IL-6 in the plasma and myocardium of rats, inhibit the expression of TLR4, NF-κB in myocardial tissue e, which might be one of the mechanisms for Yiqi Yangxin Decoction to inhibit the developing of CHF.

【Key words】Chronic heart failure; Inflammation; Ventricular remodeling;YiqiYangxinDecoction; Rats

近年來，大量研究證明炎性反應是慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)病理生理的重要機制之一，且對于其炎癥通路及炎性細胞因子的研究也成為目前的研究熱點。有報道指出心力衰竭時，內源性免疫應答作為心臟的內源性應急反應，通過心肌組織中toll樣受體(toll-like acceptor, TLR)介導，激活核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)，促使致炎細胞因子：腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)產生，引起心肌損害[1]。因此細胞因子TNF-α、IL-6、TLR4受體和核轉錄因子NF-κB的檢測可作為心力衰竭病例生理狀態和預后評價的標記物。

1實驗材料與方法

1.1實驗動物

4月齡清潔Wistar雄性大鼠300只，體質量為(250±20) g，購進日期2013年6月1日，均由吉林大學藥學院動物實驗中心提供。

1.2藥物

藥物益氣養心飲：黃芪25 g、丹參15 g、川芎10 g、紅景天12 g、葶藶子20 g、萊菔子15 g、枳實12 g、白茅根30 g。生藥由長春中醫藥大學附屬醫院制劑中心提供，由中藥房代煎，吉林大學醫學院動物實驗研究室濃縮而成，中藥液含生藥量為3.36 g/mL， 4℃冰箱保存。成藥：纈沙坦，北京諾華制藥有限公司，規格：80 mg×7粒/盒，批號：201304。

1.3試劑

兔抗鼠TLR4多克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司；兔抗鼠NF-kBp65單克隆抗體(C-20)：ZS-372，北京中杉金橋生物技術有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗，北京中杉金橋生物技術有限公司；TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒，R&D system公司。

1.4主要儀器

旋渦混合器(上海XW-80A)，超聲器(MODEL CV188)，數顯恒溫水箱(金壇HH-W-420)，震蕩培養箱(哈爾濱HZQ-X100)。

1.5動物造模與分組

300只Wistar雄性大鼠隨機分出假手術組10只，僅穿線不結扎冠狀動脈左前降支(全部存活)；剩下290大鼠參照文獻[2-3]采用結扎冠狀動脈左前降支法來建立心肌梗死大鼠模型，按心臟彩色多普勒超聲測心臟射血分數(ejection fraction, EF)<60%為造模成功，共65只，再按EF值篩選出最優的30只，最后按EF值隨機區組分為模型組、中藥組、纈沙坦組各10只。

1.6給藥

模型組和假手術組給予滅菌蒸餾水每只每天2 mL；中藥組給藥量為2.085 g/kg；纈沙坦組為20 mg/kg。每天一次，連續灌胃28天。

1.7觀測項目

給藥28天后，大鼠經眼球取血后摘取心臟，摘取其心尖部心肌組織，一部分組織在10%福爾馬林溶液中固定；另一部分組織-80℃低溫保存。

取部分心肌組織采用HE染色法，觀測心肌組織形態學改變。

Western blot實驗檢測心肌TLR4、NF-κB的蛋白表達。取左室心肌50 mg，提取總蛋白；起初用60 V電泳至溴酚藍指示劑進入分離膠后，將再電壓改為120 V至電泳結束。100 V恒壓轉膜60分鐘；隨后將膜置于含5%脫脂奶粉的0.1% Tween20的TBST溶液的自封袋中，室溫搖床封閉l小時；加一抗：TLR4(1∶200)、NF-κB p65(1∶500)，4℃冰箱過夜；次日再用TBST洗膜3次；加二抗(1∶5000)：室溫下搖床搖動1小時；TBST洗膜3次；將A、B發光液以1∶1的比例混勻l分鐘后滴加在膜上，用保鮮膜包好；在暗室中用X光片曝光，并用常規方法顯影、定影；運用Image J軟件對其進行分析。

采用大鼠血清因子ELISA試劑盒測各組標本血清中TNF-α、IL-6的濃度。

1.8統計學分析

2結果

2.1大鼠心肌組織形態學改變

假手術組：大鼠心肌細胞排列規整，心肌閏盤、肌纖維橫紋清晰，心肌細胞核位于邊緣，核大小、形態正常，心肌纖維未見斷裂缺損及空白區，無炎性細胞浸潤，并未出現細胞萎縮與肥大現象。模型組：CHF大鼠心內膜下層可見大片纖維化區域和散在的局部心肌壞死灶，心肌纖維數目減少，橫紋變淺，形成疤痕組織，結締組織增生明顯；剩余的心肌細胞相互交織，無橫紋、心肌閏盤，心肌纖維明顯增粗，排列紊亂，腫脹、斷裂、橫紋肌消失，甚至溶解，心肌結構松弛，發生炎性細胞浸潤及間質纖維化現象，細胞核增大，亦有部分核固縮，可見空白區，相鄰細胞閏盤間隙明顯增寬。給藥組：與假手術組比較，心肌細胞排列稍紊亂，心肌細胞間隙間仍有部分纖維組織，有少量炎性細胞浸潤；但與模型對照組相比較，心肌細胞排列較為整齊，纖維增生程度相對減輕，殘余心肌細胞明顯增多，橫紋較清晰，疤痕組織增生明顯減輕；中藥組與陽性藥對照組無明顯差異。見圖1。

A假手術組　B模型組　C中藥組　D纈沙坦組 圖1　中藥益氣養心飲對CHF大鼠心肌病理圖 (HE染色×200)

2.2各組藥物對CHF大鼠心肌TLR4、NF-κB表達的影響

在計算TLR4時，經單因素方差分析，F=1212.98，P=0.000，P<0.05，有統計學意義，經LSD兩兩比較后發現，假手術組大鼠心肌表達的TLR4蛋白與中藥組、纈沙坦組無統計學差異；顯著低于模型組(P<0.01)。與模型組相比，中藥組、纈沙坦組心肌TLR4蛋白的表達顯著減少(P<0.05)。中藥組與纈沙坦組相比有差異(P<0.05)。見圖2、表1。

A假手術組； B模型組； C中藥組； D纈沙坦組 圖2　各組藥物對大鼠心肌中TLR4、NF-κB 表達的Western blot電泳條帶

組別TLR4NF-κB假手術組10620.91±196.31a12993.38±198.67a模型組39378.46±124.49b108335.01±176.54b益氣養心飲組15234.16±281.10a32244.94±215.96a纈沙坦組26806.79±307.20a31463.57±228.09a

注：與模型組相比，aP<0.05；與假手術組相比，bP<0.01

在計算NF-κB時，經單因素方差分析，F=31429.96，P=0.000，P<0.05，有統計學意義，經LSD兩兩比較后發現，假手術組大鼠心肌表達的NF-κB p65蛋白與中藥組、纈沙坦組無統計學差異；顯著低于模型組(P<0.01)。與模型組相比，中藥組、纈沙坦組心肌NF-κB p65蛋白的表達顯著減少(P<0.05)。中藥組與纈沙坦組相比有差異(P<0.05)。見圖2、表1。

2.3各組藥物對CHF大鼠血清中TNF-α、IL-6含量的影響

在計算TNF-α時，經單因素方差分析，F=52.826，P=0.000，P<0.05，有統計學意義，經LSD兩兩比較后發現，假手術組大鼠TNF-α與中藥組、纈沙坦組無統計學差異；顯著低于模型組(P<0.01)。與模型組相比，中藥組、纈沙坦組TNF-α的含量顯著減少(P<0.05)。中藥組與纈沙坦組相比無明顯差異(P>0.05)。見表2。

在計算IL-6時，經單因素方差分析，F=46，P=0.000，P<0.05，有統計學意義，經LSD兩兩比較后發現，假手術組大鼠IL-6與中藥組、纈沙坦組無統計學差異；顯著低于模型組(P<0.01)。與模型組相比，中藥組、纈沙坦組IL-6的含量顯著減少(P<0.05)。中藥組與纈沙坦組相比無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2　ELISA法檢測各組大鼠血清中TNF-α、IL-6

注：與模型組相比，aP<0.05；與假手術組相比，bP<0.01

3討論

TLR4信號轉導通路是目前發現的重要的炎性通路之一，它與諸多疾病的發生及發展過程緊密相關，其下游炎癥信號的級聯式反應往往會令疾病朝不良的方向轉歸，因此阻斷或抑制TLR4信號通路上各個節點便成為了目前醫學領域研究的熱點[4]。TLR4通路的具體傳導途經如下[5]：TLR4高表達→激活NF-κB→啟動細胞因子TNF-α、CRP、IL-6→激活TLR4。

本實驗結果顯示：與模型組相比，益氣養心飲組和纈沙坦組均明顯抑制了TLR4、NF-κB的表達，雖然與假手術組比較，沒能完全抑制其表達至正常水平，但足以說明各給藥組在一定程度上抑制了TLR4通路的激活，進而抑制了NF-κB的激活，有效的抑制其進一步啟動下游炎癥因子的活力。

有研究顯示[6]，NF-κB和TNF-α之間也存在著正反雙向反饋機制，如炎癥刺激時可以使內皮細胞的NF-κB活化，進而促進內皮細胞分泌TNF-α，然而TNF-α又是NF-κB的激活劑，通過其正反饋作用，再進一步激活NF-κB，以增加其它細胞因子的分泌，最終引起級聯反應。

所以，在心力衰竭的致病機制中，各通路、各環節相互交織，互為促進，因而只要抑制其中任一因素，均能在一定程度上阻斷其傳導，有效的控制心力衰竭的發展。本實驗顯示：與模型組相比較各給藥組TNF-α、CRP、IL-6含量水平均呈明顯下降趨勢，特別是各給藥組BNP水平的降低，不僅證明益氣養心飲、纈沙坦、補益強心片對于CHF大鼠的治療有效，更印證了此次實驗模型復制成功。

綜上所述，益氣養心飲，抑制了CHF大鼠TLR4通路的各個環節，從而實現了保護心肌，逆轉心室重構，改善心力衰竭的作用。

該方用黃芪益氣固表、斂汗固脫、利水消腫，有強心之作用，使心臟收縮振幅增大，輸出量增加，對久病或疲勞衰竭的心臟作用更為明顯，此為本方之君藥；丹參現代研究可擴張冠狀動脈，與黃芪配伍血瘀隨氣壯而開，氣虛隨血和而利，直中病機[7]，且能更好的改善心肌缺血、梗塞及心臟功能；紅景天益智養心，現代研究可穩定心率，具有抗疲勞，抗神經衰弱之功效，共為本方之臣藥；佐以川芎、萊菔子、葶藶子、白茅根四藥，共奏其化瘀利水消腫之功效。川芎活血行氣，增加冠脈血流量，改善心肌缺氧狀況，而且還能增腎血流量，并能利尿。川芎乃血中氣藥，配伍黃芪可增其益氣之功，配丹參可助其活血之力[7]；萊菔子消食除脹，降氣化痰，有降壓作用，同時還有降低血管阻力，改善心臟血流動力學的作用；葶藶子溫肺豁痰利氣，有顯著的強心、利尿作用；白茅根則有清熱生津，利尿通淋之效，實驗指出白茅根水煎液具有一定的抗炎作用；使以枳實破氣消積化痰，可用治多種氣滯、痰凝等病證，且枳實配黃芪，相反相成；黃芪甘溫，能夠益氣升陽，配合諸藥，發揮其養心通絡之功，起正性肌力作用。

參考文獻

[1]廖玉華. 心力衰竭治療的新視野[J]. 臨床心血管病雜志, 2005, 21(1): 1-2.

[2]Fisbein MC, Melecan D, Marko PR. Experimentalmyocardial infarction in the rat: qualitative and quantitative changes during pathologic evolution[J]. Am J Pathol, 1978, 90(1): 57-70.

[3]PfefferMA, Pfeffer JM, FisbeinMC, et al. Myocardial infarct size and ventricular function in rats[J]. Circ Res, 1979, 44(4): 503-512.

[4]陳潔, 姜虹. TLR4信號通路與炎性反應[J]. 醫學綜述, 2009, 15(19): 2902-2904.

[5]Hall G, Hasday J D, Rogers T B. Regulating the regulator: NF-κB signaling in heart[J]. Journal of molecular and cellular cardiology, 2006, 41(4): 580-591.

[6]胡圣大. 外周血白細胞NF-κB系統活性變化對慢性心力衰竭的意義[D]. 蘇州: 蘇州大學, 2007.

[7]王萌. 鄧悅教授運用養心湯加減治療“雙心”疾病[J]. 吉林中醫藥, 2013, 33(6): 553-554.

(本文編輯：黃凡)