馬齒莧黃酮類化合物抑菌機理的研究

（西安工程大學環境與化學工程學院，陜西西安710048）

研究發現，馬齒莧黃酮類化合物具有很高的抑菌活性，不僅可將其應用在藥品、保健品、綠色產品上，還可以加工成防腐劑應用于食品的防腐保鮮上［1－3］，但目前對其抑菌機理的研究甚少。因此，研究其抑菌機理對馬齒莧天然資源的開發利用意義重大［4］。

目前，國內外關于黃酮類化合物抑菌機理的觀點有：Could提出，類黃酮可破壞微生物細胞壁及細胞膜的完整性，導致細胞內容物外滲，影響其新陳代謝，進而抑制微生物的生長［5］；Ulanowska 等［6］研究了金雀異黃酮對細菌細胞的影響，發現加入類黃酮抑制了細菌細胞DNA 和RNA 的合成，進而影響蛋白質合成；韓淑琴等［7］發現，仙人掌醇提物對微生物的菌體結構造成破壞，使菌體扭曲變形，導致細胞壁破裂，內容物外滲，達到抑菌效果。以上關于黃酮類化合物的抑菌機理都只是一種假定設想，沒有詳實的實驗證實。

鑒于此，作者將馬齒莧黃酮類化合物作用于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌，采用濾紙片法測定其抑菌效果，通過測定菌液中還原糖含量、可溶性蛋白質含量和電導率的變化情況，研究馬齒莧黃酮類化合物的抑菌機理，為開發更安全、高效的天然食品防腐劑提供幫助。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

馬齒莧，采自西安市市郊；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌，陜西省微生物研究所提供。

葡萄糖、牛血清白蛋白、硫酸銅、次甲基藍、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、氫氧化鈉、考馬斯亮藍G－250、Tris試劑、磷酸等均為分析純。

XS－04型多功能粉碎機，上海兆申科技有限公司；101型電熱鼓風干燥箱，北京科偉永興儀器公司；HIRAYAMA 型高壓蒸汽滅菌鍋，浙江科通儀器有限公司；752N 型紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；PYX－DHS－50×65型隔水電熱恒溫培養箱，上海躍進醫療器械有限公司；W2010型電熱恒溫水浴鍋，上海申順生物科技有限公司；SW－CJ－1B（U）型單人單面超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；DDS－11AT 型數字電導率儀，上海雷磁新涇儀器有限公司；Eppendorf Centrifuge 5810R 型高速離心機，德國艾本德股份公司。

1.2 方法

1.2.1 馬齒莧黃酮類化合物的提取

除去馬齒莧殘根雜質，洗凈，自然陰干后置于65 ℃烘箱中烘干，取出后用多功能粉碎機粉碎，過60目篩，備用。

精確稱取一定量馬齒莧粉用乙醇溶解，超聲波輔助提取得到馬齒莧黃酮類化合物提取液，再經DHP－600大孔吸附樹脂純化［8］，得到的馬齒莧黃酮類化合物置于棕色收集瓶中，于4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 抑菌實驗

1.2.2.1 抑菌效果的測定

采用濾紙片法進行測定：用移液管吸取0.2 mL菌懸液，輕輕吹于含有固體培養基的培養皿中，再用無菌涂布棒將菌懸液涂抹均勻。用無菌鑷子夾取充分蘸有馬齒莧黃酮類化合物的無菌濾紙片（直徑6 mm），瀝干后輕輕均勻貼在固體培養基表面，以蘸有乙醇溶液的濾紙片作為空白對照。

將培養皿置于恒溫培養箱培養，觀察抑菌效果，測量抑菌圈直徑，每組重復測3次，取平均值。

1.2.2.2 最低抑菌濃度（MIC）的測定

將純化后的馬齒莧黃酮類化合物用倍比稀釋法稀釋成不同濃度，分別用1 mL 無菌移液管移取0.5 mL，浸泡滅菌的濾紙片，搖勻，靜置一段時間后取出，置于涂有菌懸液的固體培養基上，分散均勻，然后將培養皿置于恒溫培養箱中培養一段時間后取出，觀察抑菌效果，測量抑菌圈直徑。無抑菌圈的濃度即為最低抑菌濃度［9］。

1.2.3 還原糖含量的測定

用無菌水調節菌懸液濃度為1×109CFU·mL－1左右。吸取0.2mL 菌懸液置于液體培養基中，加入不同濃度的馬齒莧黃酮類化合物，在恒溫培養箱中培養，每隔1h取出，7 000r·min－1離心10min，去除上清液，按照葡萄糖測定方法測定菌液中還原糖含量［10－11］。葡萄糖標準曲線方程為：c＝1.8939A＋0.0164，R2＝0.9909，還原糖含量計算公式如下：

式中：c為由標準曲線方程求得的還原糖質量，mg；V為提取液的體積，mL；a為顯色時吸取樣品液體積，mL；w為樣品質量，g。

1.2.4 可溶性蛋白質含量的測定

用無菌水調節菌懸液濃度為1×109CFU·mL－1左右。吸取10mL菌懸液置于液體培養基中，加入不同濃度的馬齒莧黃酮類化合物，搖勻，分別在恒溫培養箱中培養靜置0.5h、1h、2h、6h、12h、24h和36h，以經70%乙醇處理的作為對照組。離心后收集菌液，經0.01mol·L－1pH 值7.0～8.0的Tris－HCl溶液處理，按照牛血清白蛋白（BSA）測定方法測定可溶性蛋白質含量。BSA 標準曲線方程為：c＝0.1257A＋0.0007，R2＝0.9942，可溶性蛋白質含量計算公式如下：

式中：m′為從標準曲線上查得的蛋白質質量，mg；V為樣品提取液總體積，mL；VS為測定時所取樣品提取液體積，mL；m為樣品質量，g。

1.2.5 電導率的測定

用無菌水調節菌懸液濃度為1×109CFU·mL－1左右。吸取10mL菌懸液置于液體培養基中，加入不同濃度的馬齒莧黃酮類化合物，振蕩搖勻。分別測定0 min、10 min、20 min、40 min、70 min、100 min、180 min時的電導率，每組重復3次，取平均值。

2 結果與討論

2.1 馬齒莧黃酮類化合物的抑菌效果

馬齒莧黃酮類化合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌的抑菌效果見圖1，最低抑菌濃度見表1。

圖1 馬齒莧黃酮類化合物對大腸桿菌（a）、金黃色葡萄球菌（b）、酵母菌（c）的抑菌效果Fig.1 Antibacterial efficiency of flavonoids from purslane against Escherichia coli（a），Staphylococcus aureus（b），Saccharomycetes（c）

由圖1和表1可知，馬齒莧黃酮類化合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌等均有一定的抑制作用，其濃度越高，抑菌圈直徑越大，抑菌效果越明顯；其中對大腸桿菌和酵母菌有較強的抑制作用，最低抑菌濃度均為0.313 mg·mL－1，對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，最低抑菌濃度為0.156mg·mL－1。

表1 馬齒莧黃酮類化合物的最低抑菌濃度Tab.1 The minimum inhibition concentration of flavonoids from purslane

2.2 抗菌機理研究

2.2.1 馬齒莧黃酮類化合物對菌液中還原糖含量的影響（圖2）

圖2 馬齒莧黃酮類化合物對大腸桿菌（a）、金黃色葡萄球菌（b）、酵母菌（c）菌液中還原糖含量的影響Fig.2 Effect of flavonoids from purslane on reducing sugar content of bacteria liquid of Escherichia coli（a），Staphylococcus aureus（b），Saccharomycetes（c）

由圖2可知，菌液中還原糖含量均隨馬齒莧黃酮類化合物濃度的增大而顯著增加，表明菌體可能受到抑菌成分的破壞［12］，導致體內還原糖滲出，使菌液中還原糖含量增加；在馬齒莧黃酮類化合物濃度為100 mg·mL－1時，大腸桿菌、酵母菌在抑菌成分作用3h、金黃色葡萄球菌在抑菌成分作用2h時，菌液中還原糖含量達到最多，之后，還原糖含量逐漸減少，可能是菌液中存活菌的呼吸作用消耗了部分還原糖所致。

2.2.2 馬齒莧黃酮類化合物對菌液中可溶性蛋白質含量的影響（圖3）

圖3 馬齒莧黃酮類化合物對大腸桿菌（a）、金黃色葡萄球菌（b）、酵母菌（c）菌液中可溶性蛋白質含量的影響Fig.3 Effect of flavonoids from purslane on soluble protein content of bacteria liquid of Escherichia coli（a），Staphylococcus aureus（b），Saccharomycetes（c）

由圖3可知，菌液中蛋白質含量隨馬齒莧黃酮類化合物濃度的增大而增加，表明菌體可能受到抑菌成分的破壞，導致體內可溶性蛋白質外滲，使得菌液中可溶性蛋白質含量增加；隨著抑菌成分作用時間的延長，菌液中可溶性蛋白質含量逐漸減少，可能是存活的少量菌生長，消耗了菌液中的部分蛋白質，也可能是細菌細胞膜自身修復功能，使得胞內蛋白質外滲減少，菌液中可溶性蛋白質含量相應減少［13］。

2.2.3 馬齒莧黃酮類化合物對菌液電導率的影響（圖4）

由圖4可知，抑菌成分作用10min時，各菌液的電導率顯著上升，且隨馬齒莧黃酮類化合物濃度的增大而升高；10 min后，電導率沒有明顯變化。表明馬齒莧黃酮類化合物作用10min時就使菌體細胞內容物滲出，阻止細胞繼續生長從而達到抑菌目的。

圖4 馬齒莧黃酮類化合物對大腸桿菌（a）、金黃色葡萄球菌（b）、酵母菌（c）菌液電導率的影響Fig.4 Effect of flavonoids from purslane on conductivity of bacteria liquid of Escherichia coli（a），Staphylococcus aureus（b），Saccharomycetes（c）

3 結論

馬齒莧黃酮類化合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌均有一定的抑制作用，且隨著濃度的增大抑菌效果明顯增強。相同濃度下，馬齒莧黃酮類化合物對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強。馬齒莧黃酮類化合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌菌液中還原糖含量、可溶性蛋白質含量和電導率均有一定的影響，且隨濃度的增大還原糖含量、可溶性蛋白質含量和電導率的變化越顯著，其中對金黃色葡萄球菌的影響最明顯。由此推斷馬齒莧黃酮類化合物的抑菌機理主要是破壞了細菌的細胞膜，使其內容物外滲，從而達到抑菌目的。

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