慢性阻塞性肺疾病患者抗菌肽LL—37表達水平的檢測及意義

宋亞茹　李榮凱　翟成凱

[摘要] 目的 檢測抗菌肽LL-37慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者血清中和誘導痰中的表達水平及其在COPD發病中的作用。 方法 選擇27例符合標準的穩定期COPD患者（COPD穩定組），28例符合標準的急性加重期COPD患者（COPD急性加重組）及24例健康對照者（自2014年1～8月），應用ELISA法檢測血清中和誘導痰中LL-37的含量，由定量數據分析其與FEV1%和SGRQ 分數的直線相關關系。 結果 與健康對照組相比，COPD穩定組和COPD急性加重組誘導痰中LL-37的含量均明顯升高（P<0.01），三組之間血清中LL-37的含量無明顯差異（P>0.05）。COPD穩定組和COPD急性加重組誘導痰中LL-37的水平與FEV1%呈負相關（P<0.05或P<0.01），而與SGRQ 分數正相關（P<0.05或P<0.01）。 結論 COPD患者誘導痰中LL-37含量升高，且其表達水平與FEV1%和SGRQ 分數有相關性，LL-37可能在COPD的發病中發揮重要作用。

[關鍵詞] 慢性阻塞性肺疾病；LL-37；圣喬治呼吸問卷分數；炎癥

[中圖分類號] R562.25 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）32-0008-03

[Abstract] Objective To examine the concentrations of LL-37 in sera and induced sputum from chronic obstructive pulmonary diseases（COPD） patients and to access the role of LL-37 in the pathogenesis of COPD. Methods The LL-37 levels were determined in sera and induced sputum from twenty-seven patients with stable COPD（SCOPD group）， twenty-eight patients with acute exacerbation of COPD（AECOPD group）and twenty-four healthy controls （from Jan to Aug 2014）by ELISA， and then the linear correlations with FEV1% and SGRQ scores were analyzed using quantitative data. Results Compared with healthy control group， the levels of LL-37 in induced sputum were markedly higher in SCOPD group and AECOPD group（P<0.01）. However， the levels of LL-37 in sera were no difference among these three groups（P>0.05）. Furthermore， the LL-37 levels in induced sputum negatively correlated with FEV1% in both SCOPD group（P<0.05）and AECOPD group（P<0.01）. On the contrary，the LL-37 levels in induced sputum positively correlated with SGRQ scores in both SCOPD group（P<0.05） and AECOPD group（P<0.01）. Conclusion The expression levles of LL-37 are increased in induced sputum from COPD patients compared with healthy controls，and correlated with FEV1% and SGRQ scores in COPD patients， suggesting that LL-37 may play an important role in the pathogenesis of COPD.

[Key words] Chronic obstructive pulmonary diseases； LL-37； SGRQ scores； Inflammation

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種持續存在的以不完全可逆的氣流受限為特征的慢性呼吸道疾病，近年來的研究表明，氣道局部浸潤的固有免疫細胞如巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞活化后釋放的炎癥介質和蛋白酶成分在COPD的致病過程中扮演重要角色[1，2]，然而精確的發病機制尚未完全闡明。內源性抗菌肽是機體固有免疫系統的重要組成部分，在人類已經鑒定出十多種抗菌肽，而防御素家族和Cathelicidins家族是機體最重要的內源性抗菌肽。到目前為止，LL-37是Cathelicidins家族的唯一成員[3]。LL-37具有光譜抗菌活性，參與抵抗和殺傷革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、真菌和病毒等，還可以中和革蘭陰性菌細胞壁的脂多糖內毒素[4-5]。然而，LL-37在人類COPD患者的表達及其重要性尚不清楚。

1 對象與方法

1.1 研究對象

COPD組：病例收集自2014年1～8月在新鄉市第一人民醫院呼吸科住院的COPD患者55例，其中男42例，女13例，病例入選標準均符合中華醫學會呼吸病學分會制定的COPD診斷標準[6]。病例組又分為穩定期27例和急性加重期28例。健康對照組：于新鄉市第一人民醫院體檢中心選擇無心肺疾病，且近期無呼吸道感染史，肺功能正常的健康志愿者24例，其中男17例，女7例。所有入選者均知情并簽署知情同意書，并經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

肺功能測定：所有受試對象的肺功能均在同一肺功能檢測醫師指導下使用德國耶格肺功能儀測定，肺功能指標包括第一秒用力呼氣容積（FEV1）占預計百分比（FEV1% pred）和第一秒用力呼氣容積占用力肺活量（FVC）的百分比（FEV1/FVC（%））等。受試對象的健康狀況使用St.George's呼吸調查表（St.George's Respiratory Questionnaire，SGRQ）評估[7，8]，SGRQ的評估分數范圍是0～100分，分數越低表示健康狀況越好。

1.3 檢測指標

1.3.1 血液標本和誘導痰標本收集 所有受試對象均于清晨空腹抽取外周靜脈血5 mL，凝固離心后小心吸取上清液即血清凍存于-80℃冰箱。受試對象先吸入沙丁胺醇200 μg，20 min之后通過超聲噴霧器吸入3%高滲生理鹽水，隨即收集誘導出的痰液并稱重，粘液稀釋離心后吸取上清液凍存于-80℃冰箱，待檢測。

1.3.2 LL-37的測定 采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清中和誘導痰中LL-37的含量，嚴格按照試劑盒（上海佳和生物科技有限公司）說明書操作。

1.4 統計學處理

計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間均數差異采用雙側非配對t檢驗，多樣本均數間比較采用單因素方差分析，相關性分析采用Spearman 秩相關分析。所有分析均應用GraphPad Prism 5.0統計學軟件進行，所有統計結論采用0.01與0.05兩概率界值。

2 結果

2.1 三組間臨床資料分析

三組研究對象的臨床資料特征見表1，與健康對照組相比，COPD穩定組和COPD急性加重組均存在不同程度的氣流受限，肺功能檢測相關指標FEV1%pred和FEV1/FVC差異有統計學意義（P<0.01）。另外，COPD穩定組和COPD急性加重組的吸煙指數明顯高于健康對照組（P<0.05或P<0.01），SGRQ亦明顯高于健康對照組（P<0.01）。而各組在年齡構成方面差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2 血清中和誘導痰中LL-37的表達變化

健康對照組與COPD穩定組血清中LL-37的水平無明顯變化[（291.8±15.52）pg/mL vs （282.9±17.36）pg/mL，P>0.05]，與COPD急性加重組血清中LL-37的水平亦無明顯變化[（291.8±15.52）pg/mL vs （274.6±17.44）pg/mL，P>0.05]，見圖1。與健康對照組相比，COPD穩定組誘導痰中LL-37水平明顯升高[（2.7±0.25）ng/mL vs （6.3±0.42）ng/mL，P<0.01]，COPD急性加重組誘導痰中LL-37的水平也顯著升高[（2.7±0.25）ng/mL vs （9.5±0.45）ng/mL，P<0.001]。急性加重組誘導痰中LL-37水平高于穩定組，差異有統計學意義[（9.5±0.45）ng/mL vs （6.3±0.42）ng/mL，P<0.01]，見圖2。

2.3 LL-37與FEV1%和SGRQ的相關性分析

相關性分析結果顯示：COPD穩定組誘導痰中LL-37水平與肺功能指標FEV1%負相關，相關系數r=-0.432（P<0.05）；急性加重組誘導痰中LL-37的水平亦與肺功能指標FEV1%負相關，相關系數r=-0.562（P<0.01），見圖3。此外，COPD穩定組和急性加重組誘導痰中LL-37的水平與SGRQ均呈正相關關系，相關系數分別為r=0.459（P<0.05）和r=0.669（P<0.001），見圖3。

3 討論

內源性抗菌肽是機體固有免疫系統的重要組成部分，在抗感染免疫過程中發揮重要作用。LL-37首次從骨髓細胞中發現，是人類Cathelicidins家族的唯一成員[9]，LL-37分布廣泛，主要由局部固有免疫細胞如巨噬細胞、中性粒細胞和局部上皮細胞分泌釋放[2，3]。然而LL-37在人類COPD患者中的表達及重要性尚未研究。在本項研究中，為探討LL-37在COPD致病過程中的可能作用，我們首先檢測LL-37在COPD患者血清中和誘導痰中的表達水平，接著分析LL-37的表達水平與肺功能相關指標的相關性。

COPD穩定組和COPD急性加重組誘導痰中LL-37的水平與健康對照組相比顯著升高，并且COPD急性加重組高于COPD穩定組，造成這種差異的原因可能是氣道炎癥應答的不同狀態所致。一般情況下，急性加重期同時伴有流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌感染，相對于穩定期，這種感染會進一步誘發局部炎癥應答，LL-37水平分泌增加可能做為一種反饋機制抑制此種炎癥應答。免疫組化結果顯示LL-37主要表達于支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、肺部浸潤的中性粒細胞和巨噬細胞等炎細胞[10]，推測這些細胞是導致LL-37水平升高的重要來源。COPD患者誘導痰中LL-37的異常升高不僅僅是局部免疫細胞浸潤數量的增加導致，而是于炎癥環境中多種細胞共同參與交互作用調節的結果。我們進一步分析了LL-37與肺功能指標FEV1%和SGRQ的相關性，重要的是，發現LL-37的水平與FEV1%存在明顯的負相關，提示LL-37的表達水平可以在一定程度上預測肺功能的狀況。此外，LL-37的水平與SGRQ存在明顯的正相關，我們建議采用LL-37和SGRQ雙重指標可能更能反映COPD的疾病嚴重程度。

總之，這些研究結果提示LL-37可能在COPD的發病過程中發揮重要作用，LL-37發揮作用的機制以及能否用于臨床診斷和治療COPD有待于進一步研究。

[參考文獻]

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（收稿日期：2015-08-31）