二甲雙胍抑制晚期糖基化終產(chǎn)物誘導的大腸癌細胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

二甲雙胍抑制晚期糖基化終產(chǎn)物誘導的大腸癌細胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

郭娜1逄曙光

(章丘市人民醫(yī)院輸血科，山東章丘250200)

摘要〔〕目的探討二甲雙胍對人大腸癌細胞增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響。方法采用噻唑藍(MTT)法評估暴露于晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)(100 μg/ml)和二甲雙胍(10 mmol/L)后，SW480細胞存活率；采用碘化丙啶(PI)染色和流式細胞儀檢測細胞周期；采用Annexin V和PI雙染色檢測細胞凋亡；應(yīng)用Transwell遷移實驗評估細胞的侵襲能力；應(yīng)用免疫印跡法檢測EMT相關(guān)標志蛋白E-cadherin和Vimentin的表達。結(jié)果在AGEs預處理的SW480細胞，二甲雙胍抑制其增殖，誘導細胞周期阻滯在G0/G1期，增強細胞凋亡；二甲雙胍也降低腫瘤細胞的侵襲和EMT，增加E-cadherin蛋白表達、降低Vimentin蛋白表達。結(jié)論二甲雙胍對AGEs誘導的大腸癌細胞顯示了抗腫瘤效應(yīng)，其機制可能與抑制EMT過程有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕大腸癌；二甲雙胍；晚期糖基化終末產(chǎn)物；糖尿病；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

中圖分類號〔〕R735.3+4〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金資助(81170771，81270175)；山東省科技發(fā)展計劃(2012GSF11803)；濟南市國際合作計劃項目(201011008)

通訊作者：逄曙光(1966-)，女，主任醫(yī)師，教授，博士生導師，主要從事內(nèi)分泌病研究。

1山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院

第一作者：郭娜(1982-)，女，主治醫(yī)師，主要從事內(nèi)分泌病研究。

Decreased invasion and epithelial mesenchymal transition in AGEs induced colorectal cancer cells by Metformin

GUO Na, PANG Shu-Guang.

Zhangqiu Municipal People's Hospital, Zhangqiu 250200, Shandong, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of Metformin on the proliferation, invasion and epithelial-mesenchymal transition (EMT) of human colorectal cancer (CRC) cells.MethodsMTT assay was used to assess viability of SW480 cells after exposure to advanced glycation end-products (AGEs) (100 μg/ml) and metformin (10 mmol/L). Cell cycle analysis was performed by Propidium iodide (PI) staining and flow cytometry. Apoptosis was detected by Annexin V-FITC and PI double staining. Transwell migration assays was performed to assess cell invasion. The expressions of E-cadherin and Vimentin were detected by Western blot.ResultsMetformin decreased proliferation, induced cell cycle arrest in G0/G1 phase and enhanced apoptosis. Metformin also decreased cell invasion and EMT induced by AGEs treatment, which was evidenced by increasing E-cadherin protein expression and decreasing Vimentin protein expression.ConclusionsMetformin has effects on proliferation, cell cycle, apoptosis, invasion, and EMT of human CRC cells induced by AGEs.

【Key words】Colorectal cancer (CRC); Metformin; Advanced glycation end-products (AGEs); Diabetes mellitus; Epithelial-mesenchymal transition (EMT)

大腸癌(CRC)患者的死亡主要是由于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移造成的，特別是在晚期腫瘤。晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)是指蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等大分子自發(fā)與葡萄糖或其他還原單糖在沒有酶參與的條件下反應(yīng)生成的穩(wěn)定的共價加成物，與糖尿病的慢性并發(fā)癥密切相關(guān)〔1〕。二甲雙胍是一種胰島素增敏劑，用于降低胰島素抵抗性和恢復胰島素敏感性〔2〕。在前列腺癌、胰腺癌等腫瘤中，二甲雙胍具有顯著的抗腫瘤效應(yīng)〔3〕。應(yīng)用二甲雙胍治療糖尿病患者，其CRC的發(fā)病率顯著降低〔4〕。但在CRC中，二甲雙胍的抗腫瘤作用是否通過AGEs誘導的病理機制發(fā)揮作用還不清楚。本研究擬探討二甲雙胍對AGEs誘導處理的CRC細胞的作用及其機制，以期為CRC的治療提供新的思路和方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑人CRC細胞株SW480購自中科院上海生命科學院細胞庫。二甲雙胍購自美國Calbiochem公司。AGEs，二甲基亞砜(DMSO)均購自美國Sigma公司。胎牛血清由杭州四季青生物工程公司生產(chǎn)。DMEM(高糖)為美國Gibco產(chǎn)品。小鼠抗人E-cadherin，Vimentin和β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠第二抗體，均購自美國Santa Cruz公司。Matrigel膠購自BD Biosciences 公司。

1.2細胞培養(yǎng)將SW480細胞以(2～4)×105/ml密度接種于含10%胎牛血清(FBS)的高糖型DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液中同時補充有100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素和2 mmol/L谷氨酰胺。培養(yǎng)置于37℃、飽和濕度、含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次。用0.25%胰酶消化生長至對數(shù)生長期后的細胞，含10%胎牛血清的DMEM配成細胞懸液，以2×104/ml濃度接種于96孔或24孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個復孔，每孔加入100 μl DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)過夜后如細胞貼壁良好，換用無血清的DMEM培養(yǎng)24 h，使其生長同步化，然后加入AGEs(100 μg/ml)處理。正常對照組為SW480細胞加入等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.3細胞增殖試驗用噻唑藍(MTT)法測定二甲雙胍對SW480細胞的細胞毒作用，通過檢測活細胞線粒體中的琥珀脫氫酶間接反映活細胞數(shù)。將對數(shù)生長期的SW480細胞以2×105細胞/ml密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μl，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，加入AGEs(100 μg/ml)預處理，然后加入二甲雙胍(10 mmol/L)，培養(yǎng)12、24、48、72 h后取細胞測細胞活力。每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，置于37℃、暗處孵育4 h后，離心3 000 r/min、10 min，使藍紫色產(chǎn)物formazan沉淀下來。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入100 μl 二甲基亞砜(DMSO)，置于37℃充分溶解后，在酶標儀上570 nm處測定OD值。

1.4細胞周期應(yīng)用碘化丙啶(PI)染色分析DNA含量來測定細胞周期。對數(shù)生長期的SW480細胞用無血清的DMEM培養(yǎng)24 h，使其生長同步化。然后以2×104/ml濃度接種于24孔培養(yǎng)板，分為對照組、AGEs組、二甲雙胍組和AGEs+二甲雙胍組。培養(yǎng)24 h后，每組收集(1～2)×106細胞，離心3 000 r/min，5 min。PBS液洗滌后，邊震蕩沉淀細胞，邊加入75%乙醇，放置于4℃固定24 h。PBS再洗滌1次，離心后，加PI溶液(PI終濃度50 μg/ml；RNaseA終濃度0.5 mg/ml)，放置于室溫，暗處15 min，流式細胞儀檢測。

1.5細胞凋亡用Annexin V-FITC和PI雙染檢測細胞凋亡。對數(shù)生長期的SW480細胞培養(yǎng)24 h后，每組收集2×105細胞，離心3 000 r/min，5 min。PBS洗滌后用100 μl 1×binding buffer重懸細胞，加2.5 μl Annexin V和5 μl PI(終濃度10 μg/ml)，暗處放置15 min，流式細胞儀檢測。

1.6細胞侵襲試驗采用Boyden小室侵襲實驗檢測SW480細胞的侵襲能力。Transwell小室的下室加入500 μl培養(yǎng)液，加100 μl SW480細胞懸液于Transwell小室的上室。培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，用乙醇常規(guī)固定濾膜，錐蟲藍染色。穿過濾膜的細胞多數(shù)黏附在濾膜下表面，因此用棉簽拭去濾膜上室面的細胞，鏡下計數(shù)穿過Matrigel膠細胞數(shù)。每組設(shè)3復孔。4個實驗組分別設(shè)定無Matrigel膠的孔作為空白組，以空白組的穿膜細胞數(shù)為分母，各實驗組穿過Matrigel膠的細胞數(shù)為分子，得到的百分率作為癌細胞體外侵襲指數(shù)。

1.7免疫印跡分析收獲細胞后，用PBS洗滌，0.25%胰蛋白酶消化，收集所有細胞后離心，用Bradford 法測定蛋白質(zhì)含量。每孔取50 μg總蛋白與蛋白上樣緩沖液混合后煮沸5 min。蛋白上樣后，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，恒壓電泳約2 h。再以100 mA穩(wěn)流轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TTBS緩沖液封閉2 h，洗膜，加入小鼠抗人E-cadherin和Vimentin單克隆抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜。洗膜后，加辣根過氧化物酶結(jié)合的兔抗小鼠第二抗體(1∶1 000)，室溫震蕩孵育1 h，加增強型化學發(fā)光試劑發(fā)光，膠片經(jīng)曝光、顯影、定影和晾干后，進行圖形處理及半定量分析。應(yīng)用圖形軟件對特異性條帶進行灰度掃描，以E-cadherin或Vimentin蛋白對β-actin蛋白的灰度比值作為蛋白的相對表達值。

1.8統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS16.0軟件行t檢驗。

2結(jié)果

2.1二甲雙胍抑制AGEs誘導的CRC細胞生長與對照組相比，AGEs處理能促進細胞的增殖，增加各個時間點的細胞活力。單獨加入二甲雙胍不影響細胞活力。然而，在AGEs預處理的細胞中，加入二甲雙胍能顯著抑制細胞活力(P<0.05)，見圖1。

圖1　二甲雙胍抑制AGEs誘導的CRC細胞增殖

2.2二甲雙胍對CRC細胞周期的影響SW480細胞與AGEs(100 μg/ml)和(或)二甲雙胍(10 mmol/L)共同孵育24 h。AGEs處理降低G0/G1期比例，增加S期比例。二甲雙胍增加AGEs預處理CRC細胞G0/G1期比例，減少S期比例(P<0.05)。然而，AGEs和二甲雙胍均不影響G2/M期細胞的比例，見圖2。

圖2　二甲雙胍抑制AGEs誘導的CRC細胞周期 阻滯于G 0/G 1期

2.3二甲雙胍對CRC細胞凋亡的影響AGEs本身不會引起SW480細胞凋亡率的變化(凋亡指數(shù)，對照組7.46±1.14，AGEs組6.44±1.38)。然而，二甲雙胍處理不僅增加SW480細胞凋亡(凋亡指數(shù)12.13±1.91)，也增加AGEs預處理的SW480細胞凋亡〔凋亡指數(shù)(25.27±4.00)〕(P<0.05)。此外，在AGEs預處理的SW480細胞，加入二甲雙胍后顯示了比單獨二甲雙胍處理更高的凋亡率。

2.4二甲雙孤抑制AGE誘導的腫瘤侵襲和EMTAGEs可顯著提高SW480細胞侵襲指數(shù)(AGE組：64.3±7.2，對照組：31.1±5.8)。二甲雙胍處理能顯著降低AGEs誘導的侵襲指數(shù)(35.0±4.3)。然而，與對照細胞相比，二甲雙胍單獨處理的SW480細胞沒有顯示侵襲指數(shù)的顯著差異(24.9±4.5)。

免疫印跡結(jié)果顯示，二甲雙胍處理能顯著抑制AGEs誘導的EMT，表現(xiàn)為E-cadherin蛋白表達增加，Vimentin蛋白表達降低。然而，與對照SW480細胞相比，二甲雙胍單獨處理對兩個EMT標志蛋白的表達沒有顯著影響。見表1。

表1　二甲雙胍抑制AGEs誘導的大腸癌細胞

與對照組比較：1)P<0.05；與AGEs組比較：2)P<0.05

3討論

在這項研究中，我們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對CRC細胞具有顯著的抗腫瘤效應(yīng)，能抑制AGEs預處理的SW480細胞增殖，誘導細胞周期阻滯在G0/G1期，并促進細胞凋亡。二甲雙胍處理也能抑制腫瘤的侵襲和EMT，表現(xiàn)為上皮來源的E-cadherin蛋白表達增加和間質(zhì)來源的Vimentin蛋白降低。

大量流行病學調(diào)查顯示了糖尿病和CRC之間的正相關(guān)，糖尿病本身成為CRC發(fā)病的危險因素〔5〕。在無癥狀個體中，很多升高的糖代謝標志，如血糖水平、HOMA值、HbA1c和C肽水平以及代謝綜合征，都與大腸腺瘤的流行呈顯著正相關(guān)〔6〕。

AGEs是由還原糖，如葡萄糖與蛋白質(zhì)、脂類和核酸的氨基基團形成的酶促反應(yīng)形成產(chǎn)物。AGEs通過與相應(yīng)受體RAGE結(jié)合而發(fā)揮促炎癥反應(yīng)作用。在正常人血液中可以檢出可溶性RAGE，它們能與AGEs結(jié)合，從而避免與組織RAGE結(jié)合，起到保護作用。AGEs和RAGE在許多組織和細胞中表達，并與一些代謝性、神經(jīng)退行性和炎癥性疾病如糖尿病的發(fā)病相關(guān)〔7〕。最近，AGEs和RAGE被發(fā)現(xiàn)與一些腫瘤有關(guān)〔8〕。糖尿病患者CRC的發(fā)病率顯著升高〔9〕。在男性吸煙者，高水平的血清可溶性RAGE與較低的CRC發(fā)病率相關(guān)〔10〕。AGEs能增強大鼠結(jié)腸黏膜 RAGE的表達，并促進腫瘤的發(fā)展〔11〕。因此在我們的實驗中，我們把AGEs作為誘導劑體外處理細胞，發(fā)現(xiàn)AGEs能促進CRC細胞增殖，與其他作者最近報道AGEs通過提高碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(ChREBP)表達促進CRC細胞生長的結(jié)果相符合〔12〕。

二甲雙胍廣泛應(yīng)用于治療2型糖尿病〔13〕，能抑制能量敏感的AMPK/mTOR信號通路抑制蛋白質(zhì)合成和細胞增殖〔14〕。二甲雙胍顯示了廣泛的抗腫瘤效應(yīng)，如抑制乳腺癌、卵巢癌、胃癌和前列腺癌的增殖〔15〕。我們的結(jié)果也顯示了二甲雙胍對CRC細胞的抑制增殖作用，其機制可能與二甲雙胍誘導細胞周期阻滯和促進細胞凋亡有關(guān)。不僅如此，我們還發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍還能抑制CRC細胞侵襲和EMT過程。

CRC患者的死亡主要來自于癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，原位癌細胞向轉(zhuǎn)移性癌細胞轉(zhuǎn)化是一個由上皮細胞向間質(zhì)細胞分化的過程，伴隨著細胞侵襲能力增強。而EMT是這個過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔16〕。二甲雙胍在許多腫瘤中能抑制EMT過程〔17〕，其機制可能與二甲雙胍激活的下游信號分子AMPK有關(guān)〔18〕。我們首次發(fā)現(xiàn)了二甲雙胍抑制CRC細胞的EMT過程可能是其抑制CRC細胞侵襲的重要原因。

總之，二甲雙胍能對AGEs誘導的CRC細胞發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，表現(xiàn)為抑制細胞增殖、誘導細胞周期阻滯、促進細胞凋亡、抑制癌細胞侵襲和EMT。由于二甲雙胍對AGEs預處理的CRC細胞顯示了更強的抑制侵襲和EMT的作用，我們推測，二甲雙胍對CRC的抗腫瘤效應(yīng)可能是通過干擾AGEs在CRC細胞誘導的病理機制而起作用。應(yīng)用二甲雙胍將成為糖尿病相關(guān)CRC的一種治療策略。

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〔2014-01-23修回〕

(編輯李相軍)