骨髓間充質(zhì)干細胞移植對腦缺血大鼠Notch1-Dll4信號通路的影響

作者單位：1 350000福建醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；2 350000福建國際旅行衛(wèi)生保健中心

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骨髓間充質(zhì)干細胞移植對腦缺血大鼠Notch1-Dll4信號通路的影響

林菲菲1熊慧玲2

作者單位：1 350000福建醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；2 350000福建國際旅行衛(wèi)生保健中心

【摘要】目的 探討骨髓間充質(zhì)干細胞移植對大鼠腦缺血后Notch1-Dll4信號通路的影響。方法 60只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組，MCAO組，BMSC組，DAPT組。制備大鼠MCAO模型，BMSC組及DAPT組分別于造模成功后24 h經(jīng)側(cè)腦室注入BMSCs或含DAPT的BMSCs，術(shù)后4 d、7 d、14 d取腦，計數(shù)腦缺血周邊區(qū)微血管數(shù)量，RT-PCR法檢測Notch1、Dll4的表達。結(jié)果 BMSC組大鼠腦缺血周邊區(qū)的微血管數(shù)量明顯多于MCAO組及DAPT組（P＜0.05）；BMSC組大鼠Notch1、Dll4表達水平較MCAO組及DAPT組明顯增高（P＜0.05）。結(jié)論 骨髓間充質(zhì)干細胞移植可能通過上調(diào)Notch1-Dll4信號通路的表達來促進大鼠腦缺血周邊區(qū)血管新生。

【關(guān)鍵詞】腦缺血；骨髓間充質(zhì)干細胞；Notch1

骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）可能通過促進血管新生來改善腦缺血大鼠神經(jīng)功能［1］，在血管新生過程中，VEGF對血管發(fā)育的啟動至關(guān)重要，而Notch1-Dll4信號通路可通過抑制新生血管過量芽生，促進新生血管網(wǎng)的正常構(gòu)建［2］，本研究予骨髓間充質(zhì)干細胞移植干預(yù)腦缺血大鼠，檢測腦組織中新生血管情況及Notch1-Dll4信號通路表達情況，進一步探討B(tài)MSCs促進腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的機制。

1　主要材料

清潔級成年雄性SD大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司；L-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清為GIBIC0公司產(chǎn)品；兔抗人Ⅷ因子多克隆抗體購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

2　方法

2.1 SD大鼠BMSCs細胞的分離培養(yǎng)

取體重60～80 g的清潔級雄性SD大鼠，分離兩側(cè)股骨，暴露骨髓腔，反復(fù)沖洗，將骨髓懸液過濾并離心后，棄上清，重懸細胞后移至培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后去除未貼壁細胞，更換培養(yǎng)液，后每3 d換液1次，原代細胞生長融合至80% ～90%時行傳代培養(yǎng)，取第3代細胞進行移植。

2.2 實驗動物分組及干預(yù)

60只雄性清潔級成年SD大鼠，體重200～250 g。隨機分為Sham組、MCAO組、BMSC組、DAPT組，每組15只，線栓法制備MCAO模型，BMSC組于造模成功后24 h經(jīng)側(cè)腦室注射30 μl含l×106個細胞的細胞懸液，DAPT組于造模成功后24 h經(jīng)側(cè)腦室注射30 μl含有γ分泌酶抑制劑（DAPT，Notch信號通路特異性抑制劑，濃度為50 ug/m1）的BMSCs懸液。各組再按不同時間點隨機分成3組，每組5只，術(shù)后4 d、7 d、14 d取材。

2.3 微血管密度（microvessel density，MVD）檢測

冰凍切片標(biāo)本予兔抗人Ⅷ因子抗體行免疫熒光染色。按Weidner等［3］方法行MVD計數(shù)，每單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇為一個血管計數(shù)，每個標(biāo)本取2～3張切片，每張切片在低倍鏡下選擇同一皮質(zhì)缺血周邊區(qū)的5個血管內(nèi)皮細胞染色密集區(qū)，轉(zhuǎn)至200倍熒光顯微鏡下進行微血管計數(shù)，取平均值作為微血管密度。

2.4 RT-PCR法檢測Notch1，Dll4的表達

（1）取大鼠缺血周邊區(qū)腦組織提取總RNA。（2）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：嚴(yán)格按MBI Fermentas公司試劑盒說明進行。（3）PCR擴增。（4）電泳：擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)對電泳條帶進行吸光度（OD值）的半定量分析，結(jié)果以目的基因與β-actin OD值的比值表示。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)過方差齊性檢驗和正態(tài)性檢驗，每組樣本結(jié)果用（x-±s）表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，組間兩兩比較用q檢驗，P < 0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1 細胞的擴增培養(yǎng)

原代培養(yǎng)細胞24 h后開始貼壁，3 d時可見貼壁細胞呈典型的成纖維細胞樣外觀，10 d左右細胞生長達80%～90%融合，呈均一長梭形，傳代細胞呈均勻分布，生長迅速，約4～5 d可鋪滿瓶壁，細胞呈梭形。

3.2 缺血周邊區(qū)腦組織MVD分析

差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05，表1），而加用DAPT后BMSCs促血管增生作用受到明顯抑制，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01，表1）。

注：a：P＜0.05 vs. MCAO組；b：P<0.01 vs. DAPT組

3.3 腦缺血周邊區(qū)Notch1，Dll4 mRNA的表達，見表2。

4　討論

研究表明將BMSCs移植到腦缺血大鼠體內(nèi)后，腦缺血區(qū)新生血管數(shù)量明顯多于對照組，促進了腦缺血大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，其機制可能是腦缺血區(qū)的血管生長因子VEGF等的表達水平上調(diào)［1］。兩種細胞均由血管內(nèi)皮細胞分化而來，受VEGF 與Notch1-Dll4信號通路共同調(diào)控。本研究提示，缺血后4 d在腦缺血周邊區(qū)即可見Notch1和Dll4 mRNA表達升高，7 d達到高峰，之后減弱，BMSCs移植組各個時間點Notch1和Dll4 mRNA的表達明顯高于MCAO組，而加用DAPT后各個時間點Notch1 和Dll4 mRNA的表達明顯受到抑制，提示BMSCs的確可促進大鼠腦缺血周邊區(qū)Notch1-Dll4信號通路的表達［2-3］；同時本研究發(fā)現(xiàn)缺血后4 d在腦缺血周邊區(qū)即可見新生微血管，隨著天數(shù)增加，微血管數(shù)量逐漸增多，與Notch1，Dll4 mRNA的表達趨勢一致，表明缺血性腦損傷后腦組織新生血管的形成可能與BMSCs移植后促進腦組織中Notch1-Dll4信號通路的表達上調(diào)有關(guān)。

表2　大鼠腦缺血周邊區(qū)Notch1、Dll4 mRNA表達情況 （n=5， x- ±s）

參考文獻

［1］ 金志賢，王清，畢虹，等.間充質(zhì)干細胞移植對大鼠肺氣腫的療效及其可能機制［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2015，95（22）：1731-1735.

［2］ 呂曉霞，黃誠，尹至，等.自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植對膝骨性關(guān)節(jié)炎的療效觀察［J］.中華細胞與干細胞，2015，5（2）：28-32.

［3］ 孫佳佳，周軍，楊惠林.骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療脊髓損傷的研究進展［J］.中華創(chuàng)傷，2015，31（6）：568-570.

Effects of Bone Mesenchymal Stem Cells on the Expression of Notch1-Dll4 Signaling Pathway in the Brain of Rats With Focal Cerebral ischemia

LIN Feifei1XIONG Huiling21 The third hospital affiliated to fujian medical university neurology，F(xiàn)uzhou 350000， China，2 Fujian international travel health care center， Fuzhou 350000，China

【Abstract】

Objective To investigate the effects of BMSCs on the expression of Notch1-Dll4 in the brains of rats with focal cerebral ischemia. Method Sixty male adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups： Sham group， MCAO group， BMSC group， DAPT group. 24 hours after MCAO，BMSCs were injected into the lateral ventricle of rats in BMSC group， and the same dose of BMSCs contained DAPT was given to the rats in DAPT group. Rats are sacrificed at 4 d， 7 d and 14 d after MCAO. The amount of were counted， and the level of Notch1， Dll4 were detected by RT-PCR. Results The amount of microvessels increased in BMSC group （P＜0.05）. Compared with the MCAO group， the Notch1， Dll4 expression in ischemic brain was upregulated （P＜0.05）. Conclusion BMSCs can improve the by upregulating the expression of Notch1-Dll4 signaling pathway after MCAO in rats.

【Key words】Cerebral ischemia，BMSCs，Notch1

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2015.26.112

【文章編號】1674-9316（2015）26-0154-03

【文獻標(biāo)識碼】B

【中圖分類號】R683.42