3MBA類FtsZ蛋白抑制劑的分子動力學模擬及抗菌作用機制

張 賀 盧俊瑞 穆江蓓 劉金彪 楊旭云 王美君 張瑞波(天津理工大學化學化工學院,天津300384)

3MBA類FtsZ蛋白抑制劑的分子動力學模擬及抗菌作用機制

張 賀 盧俊瑞*穆江蓓 劉金彪 楊旭云 王美君 張瑞波
(天津理工大學化學化工學院,天津300384)

采用分子動力學模擬、蛋白質二級結構測定(DSSP)、口袋體積測量(POVME)以及MM-PBSA (molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area)方法,系統(tǒng)研究了金黃色葡萄球菌絲狀溫度敏感性蛋白Z(SaFtsZ)-二磷酸鳥苷(GDP)二元復合物和SaFtsZ-GDP-3MBA(3-甲氧基苯甲酰胺)類衍生物三元復合物體系的穩(wěn)定性、蛋白質二級結構、蛋白質構象、關鍵殘基質心距、活性口袋體積以及相對結合自由能的變化規(guī)律.研究表明:當不含抑制劑存在時SaFtsZ-GDP二元復合物體系穩(wěn)定性較差,其T7Loop區(qū)域殘基(203-209)波動較大,且蛋白二級結構發(fā)生明顯變化,活性口袋體積急劇減小,底物通道顯著變窄且不穩(wěn)定.而含有抑制劑PC190723、Compound1的類衍生物三元復合物體系的表現(xiàn)截然不同,這主要是由于它們均能和活性口袋T7Loop區(qū)周圍殘基形成關鍵性的氫鍵以及疏水作用,與FtsZ蛋白緊密結合.在SaFtsZ-GDP-3MBA三元復合物體系中,3MBA僅能與活性口袋中部分殘基形成疏水作用,與FtsZ蛋白親和力較弱,使其不能穩(wěn)定地存在于活性口袋中,進一步導致它的抗菌活性明顯低于PC190723、Compound1.這些發(fā)現(xiàn)深入揭示了3MBA類衍生物對FtsZ蛋白的作用機制和影響規(guī)律,為該類FtsZ蛋白抑制劑的結構優(yōu)化和產品開發(fā)應用提供了重要的理論依據(jù).

3MBA類衍生物;FtsZ;分子動力學模擬;抗菌作用機制;結合自由能

1 引言

近年來,抗生素濫用導致了嚴重的細菌耐藥性問題,而已有抗菌藥物主要是針對細菌細胞壁的合成、細菌蛋白質的合成、核苷酸的合成、葉酸的合成等四類靶標,致使現(xiàn)行抗菌藥物較易產生細菌耐藥性.解決上述問題,迫切需要開發(fā)具有新的作用靶點或新的作用機制的抗菌藥物.

近年來,細菌分裂蛋白逐漸成為抗菌藥物研究的熱點.1-3細菌分裂蛋白在形態(tài)上高度保守、不易變異.細菌細胞分裂過程中,FtsZ蛋白首尾相接,在細胞中央區(qū)域組裝聚合,形成與細胞質膜內表面鑲嵌的Z環(huán),最終以Z環(huán)為平面分裂成兩個子細胞.FtsZ作為起始蛋白,具有三磷酸鳥苷酶(GTPase)活性,能夠催化三磷酸鳥苷(GTP)水解生成二磷酸鳥苷(GDP),從而為Z環(huán)形成收縮和解聚提供能量.4-7研究表明,T7Loop附近區(qū)域是啟動FtsZ蛋白組裝的關鍵開關,而組裝開關的啟動必須要求C端序列區(qū)域殘基(223-310)向N端序列區(qū)域殘基(12-171)移動,并關閉兩區(qū)域之間的活性口袋通道.8如果能夠找到合適的化合物,有效阻斷FtsZ蛋白的組裝或抑制GTP酶的活性,就能夠導致細菌的裂解死亡.6,9

目前已經發(fā)現(xiàn)了多種不同骨架結構的FtsZ抑制劑,按照其來源可分為天然化合物和全合成化合物兩類.天然化合物主要有綠垂曲霉(viriditoxin)、苯并啡啶堿類生物堿血根堿(sanguinarine)、二萜酚(totarol)、白花丹素(plumbagin)、GTP類似物Br-GTP等.10-16天然化合物往往因其生物利用度較差或體內毒副作用較強等限制了它們的應用.如綠垂毒素雖然對多重耐藥菌,如葡萄球菌屬、腸球菌屬、肺炎鏈球菌等具有較好的抗菌活性(MIC=2-32μg·mL-1),但其生物利用度存在不足,必須對其結構進行優(yōu)化,以提高其抗菌活性和靶向性.10全合成化合物主要通過高通量篩選、分子對接等方法尋找得到. 2005年Stokes等17從大約105000個化合物中篩選出活性化合物PC58538,并通過結構優(yōu)化得到了代表性的化合物PC170942,其對金黃色葡萄球菌的MIC為64μg·mL-1.2006年Ito等18從大約95000個化合物中篩選出活性化合物A-189,其對GTP酶的抑制活性(IC50)為80μg·mL-1,對金黃色葡萄球菌的MIC為16μg·mL-1,研究表明其主要通過抑制GTP酶的活性來干擾FtsZ蛋白的組裝,從而抑制了細菌生長.2009年Beuria等19研究了29種骨架結構的81個化合物對FtsZ蛋白組裝的影響,發(fā)現(xiàn)其中繞丹寧衍生物(OTBA)對FtsZ蛋白的特異性較強,且對哺乳動物的微管蛋白幾乎無抑制作用,其抑制枯草芽孢桿菌細胞增殖的MIC約為1μg·mL-1,是一種有潛力的先導化合物.迄今為止,在全合成化合物中3-甲氧基苯甲酰胺(3MBA)是公認的最具開發(fā)前景的先導化合物.早在1999年Ohashi等20便發(fā)現(xiàn)了3MBA能夠抑制枯草芽孢桿菌的二分裂,但抗菌活性較低,對金黃色葡萄球菌屬的MIC為4000μg· mL-1.2008年Haydon等21通過對3MBA衍生物修飾,得到了優(yōu)異的FtsZ靶向抑制劑PC190723 (9PC).研究表明,9PC能顯著抑制FtsZ蛋白的GTP酶活性,對GTP酶的IC50達到0.55μg·mL-1,對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC達到0.5-1μg· mL-1.為了驗證其體內活性,Haydon等21對腹腔接種潛在致死量金黃色葡萄球菌的小鼠樣本進行皮下或靜脈注射30 mg·kg-1劑量的9PC溶液,結果發(fā)現(xiàn)小鼠存活率達到100%.2012年Stokes等22對3MBA衍生物進行修飾,得到一種具有優(yōu)異體內、外活性的化合物Compound 1(Com1),其在小鼠體內的生物利用率達到82%.Com1對所有葡萄球菌屬的平均MIC達到0.12μg·mL-1,對枯草芽孢桿菌的MIC達到0.03μg·mL-1,抗菌活性與抗菌藥物三氯生相近.23,24上述研究表明,3MBA作為FtsZ蛋白抑制劑先導化合物具有突出優(yōu)勢和巨大潛力.圖1給出了3MBA及其典型衍生物的化學結構.

研究表明,抑制劑與FtsZ蛋白主要有兩個結合位點,即GTPase活性區(qū)域和T7Loop區(qū)的疏水性活性口袋.如天然產物綠垂霉素、Br-GTP均作用于GTPase活性區(qū)域,是GTP的競爭性抑制劑,但因抑制能力較弱,導致其抗菌活性相對較差.其余多數(shù)抑制劑,如3MBA、9PC、Com1等均作用于T7Loop的活性口袋區(qū)域.9PC具有2個獨特化學基團,即苯甲酰胺和噻唑并吡啶,能夠與FtsZ蛋白形成氫鍵及疏水等作用,而抑制劑在活性口袋中結合的穩(wěn)定性是決定其親和力以及靶向選擇性的關鍵因素.25在SaFtsZ-GDP-9PC三元復合物體系中,9PC的酰胺基團主要與FtsZ蛋白活性口袋上Val207、Asn263的羰基形成氫鍵,2-Cl基團處于疏水殘基Leu200、Leu209附近,6-CL基團處于疏水殘基Val203、Leu297附近.噻唑并吡啶能夠與H7螺旋區(qū)域和C端區(qū)域之間的殘基(Gly193,Gly196,Ile197,Met226, Ile228,Thr309等)形成疏水作用.這些結合模式均有利于三元復合物體系的形成和穩(wěn)定,構成了9PC作為抑制劑的分子生物學基礎.

圖1 3MBA及其衍生物的化學結構Fig.1 Chemical structures of the 3MBAand its derivatives

盡管FtsZ蛋白已被公認為是一種較好的抗菌藥物作用靶點,而且已經發(fā)現(xiàn)合成了一批FtsZ抑制劑,但因其體內抗菌活性、作用機制等研究尚不夠深入,迄今,FtsZ蛋白抑制劑仍未進入臨床應用.因此,利用FtsZ蛋白晶體結構,研究抑制劑與FtsZ蛋白的結合模式和作用機制,對FtsZ蛋白抑制劑的開發(fā)應用具有重要意義.本文以FtsZ蛋白晶體結構為基礎,應用分子動力學模擬、蛋白質二級結構測定(DSSP)、口袋體積測量(POVME)以及MM-PBSA方法,對SaFtsZ-GDP二元復合物體系及SaFtsZ-GDP-3MBA類抑制劑三元復合物體系進行研究,系統(tǒng)研究了T7Loop的疏水性活性口袋區(qū)域的穩(wěn)定性、蛋白二級結構、蛋白質構象、關鍵殘基質心距離,活性口袋體積以及相對結合自由能的特征和變化規(guī)律,揭示了3MBA類抑制劑對細胞分裂蛋白FtsZ的內在作用機制,為針對FtsZ靶點的藥物設計、篩選和開發(fā)應用提供了重要的理論依據(jù).

2 實驗部分

2.1 蛋白質結構準備

從PDB結構數(shù)據(jù)庫獲得代號為4DXD26的金黃色葡萄球菌FtsZ蛋白晶體結構,刪除晶體結構中的水分子,建立SaFtsZ-GDP-9PC三元復合物體系,刪除其中9PC的結構信息建立SaFtsZ-GDP二元復合物體系.通過AutoDock27分子對接獲得SaFtsZGDP-3MBA以及SaFtsZ-GDP-Com1三元復合物體系.在AutoDock對接中,盒子中心坐標定義為晶體配體中醚氧原子的空間坐標(x-center:-14.018;ycenter:42.480;z-center:18.071),格點間距為3.75× 10-2nm,盒子大小為50個格點組成的正方體區(qū)域.采用拉馬克遺傳算法進行計算,其運行次數(shù)設置為200次,最大能量評估次數(shù)設置為2.5×106,最多迭代次數(shù)設置為2.7×105,其他參數(shù)為默認值.使用acpype程序28生成配體及GDP的拓撲文件,用于構建分子動力學模擬中的復合物拓撲文件.

為了深入認識抑制劑對FtsZ蛋白的作用機制,通過ZDOCK 3.0.2程序29進行蛋白與蛋白全局剛性對接采集SaFtsZ蛋白二聚體結構,對接產生2000個二聚體結構.之后對所有結構進行打分排序,從中挑選出打分較好并且滿足結合位點信息的結構用于結果分析,并與晶體結構中詹氏甲烷球菌MjFtsZ-GTP二聚體(PDB代號為1W5A)的構象對比.

2.2 分子動力學模擬

運用Gromacs 4.6.4分子動力學模擬軟件,30在Amber ff99SB力場31下,分別對上述四種復合物體系進行分子動力學模擬.體系質心均位于截角八面體盒子中心,溶質外圍加上1.0 nm的TIP3P模型32的水分子層.首先用最陡下降法對復合物進行50000步的能量優(yōu)化,以消除分子間的高能碰撞,然后分別進行100 ps的NVT和100 ps的NPT模擬,使體系溫度保持在300 K、壓強保持在105Pa左右的平衡狀態(tài),最后分別對四種復合物體系進行100 ns無約束的分子動力學模擬.采用周期性邊界條件和PME(Particle Mesh Ewald)方法處理長程靜電作用.通過V-rescale和Parrinello-Rahman控制系統(tǒng)的溫度和壓力.33,34使用LINCS算法35固定所有成鍵原子之間的相對距離.模擬過程中采用的積分步長為2 fs,每5步更新一次非鍵連接表,每1 ps保存一次軌跡結構用于后續(xù)數(shù)據(jù)的分析.36

所有計算機模擬工作均在HP Z820工作站上完成,主要配置:CPU為Intel(R)Xeon(R)E5-2680@ 2.7 GHz,內存為64 GB,硬盤為2 T,配有GPU (NVIDIATesla C2075)加速計算顯卡.

2.3 T7Loop區(qū)活性口袋體積測定

分別從四種體系100 ns的分子動力學軌跡文件中每隔50 ps提取一幀復合物坐標文件.將提取的2000個坐標文件與初始坐標文件進行疊加,采用POVME程序37對每幀疊加之后的蛋白進行活性口袋體積計算.以9PC中的醚氧原子的空間位置(-14.018,42.480,18.071)為中心坐標,以1.0 nm為半徑構建球體,使球體包含整個活性口袋.使用POVME程序生成半徑為0.1 nm的體積-格點文件,刪除與氨基酸殘基相疊合的格點,同時保留以中心坐標為球心,半徑0.4 nm范圍內缺失不多于2個的連續(xù)格點.38最后根據(jù)格點的數(shù)量計算得到活性口袋體積隨時間變化的曲線圖.

2.4 結合自由能計算

從分子動力學模擬過程中得到的配體與受體蛋白的相對結合自由能通常比分子對接得分具有更高的實驗結果相關性以及篩選能力.通過g_mmpbsa工具運用MM-PBSA方法計算得到配體與FtsZ蛋白之間的相對結合自由能G.G=EMM+Gsolv,其中EMM=Gele+Gvdw,Gsolv=Gpolar+Gnon-polar.相對結合自由能計算中忽略了熵的變化.其中Gele為靜電作用, Gvdw為范德華力,Gsolv為溶劑化作用,Gpolar為極性溶劑化作用,Gnon-polar為非極性溶劑化作用.極性和非極性項的計算則采用APBS軟件,39電性項的參數(shù)gridspacing取0.05 nm,探針半徑0.14 nm,復合物介電常數(shù)設為1,溶劑的介電常數(shù)設為80.非極性項Gnon-polar采用溶劑可及表面(SASA)模型計算:Gnon-polar= γSSASA+β.其中γ為表面張力參數(shù),β為擬合修正參數(shù), γ=2.27 kJ·mol-1·nm-2,β=3.85 kJ·mol-1.34,40相對結合自由能值為從分子動力學模擬最后10 ns軌跡中每隔100 ps獲得構象的平均結合自由能.配體與FtsZ蛋白的相對結合自由能反映了配體與蛋白結合能力的強弱,決定了配體能否穩(wěn)定存在于活性口袋中.而配體與活性位點結合的穩(wěn)定性往往是決定抑制劑親和力以及靶向選擇性的關鍵因素.

3 結果分析與討論

3.1 MjFtsZ二聚體和SaFtsZ二聚體結合模式

如圖2所示,A代表詹氏甲烷球菌MjFtsZ-GTP二聚體構象,B代表金黃色葡萄球菌SaFtsZ-GDP-9PC復合物體系二聚體構象.在MjFtsZ-GTP二聚體構象中,FtsZ蛋白首尾相接,FtsZ蛋白的Loop區(qū)嵌入到另一個FtsZ蛋白的核苷酸結合區(qū)域,行使催化功能,水解GTP轉化為GDP,為細菌分裂提供能量.在SaFtsZ-GDP-9PC復合物體系二聚體構象中,蛋白構象與圖2A相似,T7Loop區(qū)與另一個FtsZ蛋白的核苷酸結合區(qū)域靠近,配體9PC存在于T7Loop區(qū)周圍的活性口袋,能夠穩(wěn)定FtsZ蛋白構象.

圖2 MjFtsZ蛋白二聚體和SaFtsZ蛋白二聚體構象Fig.2 Conformations of MjFtsZ protein dimer and SaFtsZ protein dimer

3.2 四種體系的穩(wěn)定性與殘基波動情況

對四種體系分別進行100 ns的分子動力學模擬.以晶體初始蛋白構象為參照,分析蛋白中Cα原子的均方根偏差(RMSD)隨模擬時間變化趨勢,考察四種體系蛋白構象的穩(wěn)定性以及殘基波動情況.從圖3中可知,二元復合物的RMSD值在30 ns左右達最大值后逐漸平衡,平衡后RMSD值在0.180-0.297 nm之間,RMSD平均值為0.223 nm,SaFtsZGDP-3MBA體系在前60 ns其RMSD值不斷升高,隨后逐漸平衡,平衡后RMSD值為0.190-0.300 nm, RMSD平均值為0.238 nm,兩種體系與初始蛋白晶體構象相比變化幅度較大.SaFtsZ-GDP-9PC三元復合物體系在10 ns后已達到平衡,平衡后RMSD值在0.098-0.209 nm區(qū)間內變化,RMSD平均值僅為0.149 nm.SaFtsZ-GDP-Com1三元復合物體系在30 ns左右達到平衡,平衡后的RMSD值為0.120-0.227 nm,RMSD平均值僅為0.163 nm.配體9PC、Com1的存在使蛋白構象變化與整體變化幅度均較小.這主要是因為9PC或Com1能夠穩(wěn)定FtsZ蛋白的整體構象,使其能夠較好地保持初始蛋白構象.

為研究FtsZ蛋白氨基酸殘基的波動情況,分別計算四種體系在分子動力學模擬過程中氨基酸殘基的均方根漲落值(RMSF).如圖4所示,二元復合物中所有殘基的平均RMSF值為0.111 nm,在3MBA、9PC、Com1存在的三元復合物中所有殘基的平均RMSF值分別為0.123、0.110、0.110 nm,四種體系氨基酸殘基RMSF值較為相近,氨基酸殘基整體波動情況較為一致,但在SaFtsZ-GDP-3MBA體系中部分氨基酸殘基波動明顯.為此深入研究四種體系RMSF值差異性較大的區(qū)域,對T7Loop區(qū)域以及H7螺旋區(qū)域(Met179-Ala202)進行進一步分析.發(fā)現(xiàn)當9PC、Com1存在時活性口袋T7Loop區(qū)殘基RMSF值波動較小,平均值分別僅為0.094、0.117 nm,表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性.而3MBA存在的三元復合物或無配體的二元復合物體系中,T7Loop區(qū)殘基的RMSF值波動較大,平均值分別為0.243、0.123 nm,相對于其他兩個三元復合物體系的T7Loop區(qū)殘基表現(xiàn)出較大的波動性.對H7螺旋區(qū)域殘基RMSF值進行對比發(fā)現(xiàn),在配體3MBA、9PC、Com1存在時RMSF平均值分別為0.152、0.129、0.147 nm,而無配體存在時H7螺旋區(qū)域殘基的RMSF平均值僅為0.102 nm.配體的存在反而使得H7螺旋區(qū)域殘基有較大的浮動,配體對這一區(qū)域殘基RMSF值的影響導致三元復合物體系所有殘基的RMSF平均值與二元復合物體系所有殘基的RMSF平均值較為相近.以上數(shù)據(jù)表明,當9PC、Com1存在時能夠降低T7Loop區(qū)殘基的柔性,使得靠近苯甲酰胺基團的活性口袋區(qū)域構成一個較為穩(wěn)定的體系.這主要是由于苯甲酰胺基團能夠和T7Loop區(qū)殘基形成較強的氫鍵以及疏水作用,使其靶向作用于這一活性口袋區(qū)域.

圖3 四種體系Cα相對于晶體結構位置的均方根偏差隨模擬時間的變化Fig.3 Alpha-carbon root mean square deviations(RMSD) of the four models relative to the crystal structure,as a function of time

圖4 動力學模擬過程中蛋白各個殘基的均方根漲落Fig.4 Root mean square fluctuations(RMSF)of residues in the protein during dynamics simulations

圖5 Met179-Ala202殘基二級結構隨模擬時間的變化Fig.5 Secondary structure changes of the Met179-Ala202 residues as a function of time

3.3 四種體系中蛋白二級結構變化情況

通過DSSP程序41計算四種體系蛋白二級結構隨時間變化的規(guī)律,發(fā)現(xiàn)主要變化集中在T7Loop區(qū)域以及H7螺旋區(qū)域.二元復合物體系T7Loop區(qū)中Ser204-Gly205殘基的二級結構為coil卷曲,然而隨著模擬的進行,主要在coil卷角、bend彎曲之間相互轉化,最終以bend彎曲形式穩(wěn)定存在.三元復合物中除3MBA體系外該區(qū)域以coil卷曲形式穩(wěn)定存在.3MBA體系該區(qū)域二級結構隨著模擬的進行,在coil卷角、bend彎曲、turn轉角之間不斷轉化.

圖5所示為二元復合物體系與典型的SaFtsZGDP-9PC三元復合物體系H7螺旋區(qū)域二級結構隨模擬時間變化的情況.在模擬初期,SaFtsZ-GDP二元復合物體系中H7螺旋區(qū)域中Gln195-Ala202殘基的二級結構為α螺旋,隨著模擬的進行該區(qū)域二級結構在310螺旋、α螺旋、turn轉角之間轉化,最終二級結構穩(wěn)定以turn轉角形式存在.H7螺旋區(qū)域中Ala182-Glu185殘基的二級結構在310螺旋、α螺旋、turn轉角之間轉化,平衡之后以310螺旋穩(wěn)定存在.而在SaFtsZ-GDP-9PC三元復合物體系中Gln195-Ala202殘基的二級結構構象較為單一穩(wěn)定,主要以α螺旋規(guī)則構象存在,僅觀察到T7Loop區(qū)與H7螺旋區(qū)連接處殘基Leu200-Ala202二級結構在α螺旋、turn轉角之間不斷轉化,最終主要以turn轉角形式存在.H7螺旋區(qū)域中Ala182-Asp187殘基的二級結構從35 ns左右開始在310螺旋、α螺旋、turn轉角之間不斷轉化.可見,配體的存在能夠較好地穩(wěn)定T7Loop區(qū)域殘基的二級結構,但同時引起了H7螺旋區(qū)域Ala182-Asp187殘基二級結構的變化.

3.4 T7Loop區(qū)活性口袋與配體的結合模式

為了更清晰地描述3MBA類衍生物與活性口袋關鍵殘基的相互作用,通過對四種體系最后10 ns分子動力學模擬軌跡進行聚類分析,分別得到四種體系具有代表性的構象.在聚類分析過程中,基于所有原子的RMSD,應用gromos計算方法提取構象類似的幀為一類,選取最大類的構象進行結合模式的分析.應用Pymol程序42和LigPlot+軟件43和對三元復合物體系進行結合模式的分析,如圖6所示, 3MBA并沒有與FtsZ蛋白形成氫鍵作用,僅僅與活性口袋兩側部分殘基形成疏水作用.而9PC、Com1不僅能夠與T7Loop區(qū)Gly205、Val207或Leu209殘基形成氫鍵作用,而且均能與活性口袋一側Asn263殘基形成關鍵的氫鍵作用,同時與活性口袋區(qū)域中的Gly193、Gly196、Leu200、Thr309等殘基形成疏水作用.在最后10 ns代表性構象中三元體系配體3MBA、9PC、Com1與初始配體構象的RMSD值分別為1.03、0.16、0.300 nm.可見配體9PC和Com1均能較好地保持初始構象,而配體3MBA構象變化極大.通過與初始構象結合模式進一步對比,發(fā)現(xiàn)在初始構象中9PC、Com1均能與Gly205、Val207或Leu209殘基形成氫鍵作用.其中在初始構象中Com1并沒有和Asn263殘基形成氫鍵作用.然而在分子動力學模擬過程中,通過分子構象的不斷變化,Com1與Asn263殘基形成氫鍵并穩(wěn)定存在. 3MBA雖然在初始蛋白構象能夠與Gly205、Val207、Leu209、Asn263殘基形成氫鍵作用,但與其形成疏水作用的殘基相對較少,導致疏水作用較弱,影響3MBA在活性口袋的穩(wěn)定性,隨著模擬時間的進行,氫鍵作用逐漸消失,3MBA逐漸遠離活性口袋區(qū)域.

圖6 最后10 ns中三種體系代表構象結合模式圖Fig.6 Representative binding modes of the three models during the last 10 ns

3.5 T7Loop區(qū)活性口袋關鍵殘基質心距離

T7Loop區(qū)活性口袋形狀類似于狹長的通道,抑制劑進入活性口袋后占據(jù)底物通道,使得活性口袋區(qū)域保持較為穩(wěn)定的構象.為了更清晰地描述底物通道的變化,通過測量四種體系T7Loop區(qū)周圍Leu200殘基與Asn263殘基之間的質心距,考察活性口袋通道兩側距離隨模擬時間的變化.表1所示為四種體系Leu200殘基與Asn263殘基質心距的初始距離、最小距離、最大距離以及平均距離.圖7所示為SaFtsZ-GDP二元復合物體系以及選取的SaFtsZ-GDP-9PC三元復合物體系中Leu200殘基與Asn263殘基質心距隨模擬時間的變化曲線.在二元復合物體系中,Leu200殘基與Asn263殘基初始質心距為0.787 nm,在模擬初期0.2 ns左右達最大值(0.951 nm),隨著時間的增加質心距逐漸變小,在26 ns左右達到最小值(0.504 nm),之后逐漸穩(wěn)定,模擬過程中質心距平均值僅為0.651 nm,而在SaFtsZGDP-9PC三元復合物體系中,Leu200殘基與Asn263殘基初始質心距為0.822 nm,隨模擬時間波動較小,在1.2 ns左右達最大值1.037 nm,最小值僅為0.775 nm,模擬過程中質心距平均值為0.853 nm,遠遠高于二元復合物的質心距相對應值,這些數(shù)據(jù)表明FtsZ活性口袋區(qū)域底物通道殘基具有較高的柔性,無配體存在的二元復合物體系中活性口袋通道距離變窄.而配體9PC、Com1的存在能夠穩(wěn)定活性口袋通道,較好地保持初始蛋白構象,Leu200殘基與Asn263殘基質心距較初始距離稍微增加,導致底物通道距離變寬.SaFtsZ-GDP-Com1三元復合物體系Leu200殘基與Asn263殘基質心距的相對應值均稍高于SaFtsZ-GDP-9PC三元復合物體系.而SaFtsZ-GDP-3MBA三元復合物體系中配體的存在并沒有對質心距造成很大的影響.在分子動力學模擬初期,配體3MBA的存在一定程度上穩(wěn)定了底物通道,但隨著模擬時間的進行,可以看出Leu200殘基與Asn263殘基質心距和二元復合物體系質心距趨勢類似,僅僅比二元復合物體系質心距平均值高0.017 nm,可見3MBA并不能很好的穩(wěn)定存在于活性口袋中.

表1 氨基酸Leu200與Asn263質心距特征值Table 1 Eigenvalues of center-of-mass distance between residues Leu200 andAsn263

圖7 Leu200殘基與Asn263殘基之間的質心距離隨時間的變化曲線Fig.7 Center-of-mass distance between residues Leu200 andAsn263 as a function of time

3.6 T7Loop區(qū)活性口袋體積分析

活性口袋體積隨模擬時間變化的規(guī)律如圖8所示,SaFtsZ-GDP二元復合物體系活性口袋體積隨著模擬時間迅速減小,波動范圍較廣,體積在0-0.197 nm3區(qū)間上下波動,后60 ns體積平均僅為0.016 nm3,而三元復合物的體積變化較小,以SaFtsZGDP-9PC三元復合物體系為例,模擬平衡后,活性口袋體積變化較小,以平均體積0.399 nm3保持穩(wěn)定存在.而在SaFtsZ-GDP二元復合物體系中,底物通道距離變窄,活性口袋體積呈顯著性縮小變化.這主要是由于在9PC體系中,9PC既能與Val207、Asn263等殘基形成氫鍵,又能與活性口袋中Gly193、Leu200、Val203、Leu209、Thr309等殘基形成疏水作用,從而穩(wěn)定存在于活性口袋中.與9PC體系比較,Com1體系活性口袋體積變化較為類似,而配體3MBA存在時,體系的活性口袋體積變化明顯,平均活性口袋體積則介于9PC體系和二元體系之間.

圖8 四種體系中活性口袋體積隨時間的變化Fig.8 Volumes of the active pockets of the four models as a function of time

由于T7Loop區(qū)附近區(qū)域是啟動FtsZ蛋白組裝的開關,而組裝開關的啟動必須要求C端序列移向N端序列并關閉兩個結構域之間的狹長活性口袋區(qū)域.在9PC、Com1存在時,兩個結構域中Leu200殘基與Asn263殘基質心距較初始質心距增加,同時活性口袋體積波動較小,能夠較好地保持初始蛋白構象,進一步表現(xiàn)為阻礙C端序列移向N端序列,使FtsZ蛋白組裝開關呈關閉狀態(tài),進而影響細菌分裂.

3.7 MM-PBSA相對結合自由能分析

通過MM-PBSA方法計算SaFtsZ-GDP-3MBA、SaFtsZ-GDP-9PC、SaFtsZ-GDP-Com1體系相對結合自由能Gbinding大小依次為-62.85,-157.19,-199.27 kJ·mol-1.配體9PC、Com1與FtsZ蛋白的相對結合自由能均小于-150 kJ·mol-1,結合能值是衡量配體是否能夠穩(wěn)定存在于活性口袋的重要指標,較低的結合能使得配體與FtsZ蛋白能夠較好的結合.與9PC和Com1相比,3MBA與FtsZ蛋白相對結合自由能較高,僅為-62.85 kJ·mol-1,因此3MBA雖然在模擬初期能夠與FtsZ蛋白形成氫鍵以及疏水作用,但由于結合能力相對較弱,隨著分子動力學模擬的進行,3MBA并不能很好地穩(wěn)定存在于活性口袋中.這與以上研究結果中Leu200和Asn263殘基質心距變化,T7Loop區(qū)域活性口袋體積變化是一致的.同樣生物活性測試結果中3MBA、9PC、Com1對金黃色葡萄球菌屬的MIC值分別為4000、0.5-1、0.12μg· mL-1.AutoDock分子對接中3MBA、9PC、Com1的結合能分別為-27.00、-42.11、-43.70 kJ·mol-1.可見MM-PBSA相對結合自由能計算結果與生物活性測試結果以及AutoDock分子對接結果反映的規(guī)律相一致.

為進一步分析相對結合自由能中不同結合能的貢獻,對三種配體與FtsZ蛋白的分項結合自由能進行比較,結果如表2所示.

從表2中可以看出,范德華作用對相對結合自由能的貢獻最為突出,然后依次是靜電作用和非溶劑化作用.在形成復合物的過程中,范德華作用、非極性溶劑化能和靜電作用均有利于配體的結合,而溶劑化能為正值,不利于配體的結合.這主要是由于溶質分子在進入溶劑后要排開一部分溶劑,同時阻斷溶劑分子之間的相互作用,這個過程是熱力學不利的.

為了更進一步考察配體與FtsZ蛋白分子動力學模擬過程中各部分殘基對相對結合自由能的貢獻,通過自由能分解得出各個殘基對結合自由能的貢獻.為方便分析,將結合能分成＞-2 kJ·mol-1、-2--4 kJ·mol-1、-4--6 kJ·mol-1、＜-6 kJ·mol-1四級.表3列出了三元復合物體系在結合過程中主要殘基對結合自由能的貢獻.

表2 三種配體與FtsZ蛋白的分項結合自由能Table 2 Partial binding energy of three ligands with FtsZ protein

表3 主要殘基對結合自由能的貢獻Table 3 Binding energy contributions of some main residues

從表3中可以看出,SaFtsZ-GDP-3MBA三元復合物體系中,僅有Glu301、Leu302、Val307三個殘基與3MBA形成較強的相互作用能.而9PC、Com1存在的三元體系中,T7Loop區(qū)域周圍殘基如Asp199、Leu200、Leu209均能與配體形成很強的相互作用能.尤其是SaFtsZ-GDP-Com1三元復合物體系,能夠與配體形成＜-6.0 kJ·mol-1的殘基有Ile197、Ile311、Asp199、Leu200.其中Leu200與配體的相互作用能最低,僅為-8.89 kJ·mol-1,這對Com1能夠穩(wěn)定存在于活性口袋的貢獻是巨大的.

4 結論

應用分子動力學模擬以及相關計算方法研究了3MBA類衍生物與金黃色葡萄球菌FtsZ蛋白T7Loop區(qū)周圍活性口袋的作用規(guī)律.研究表明,在分子動力學模擬中,SaFtsZ-GDP二元復合物體系和抑制劑存在的三元復合物體系均能形成低能的動態(tài)平衡狀態(tài).與二元體系和3MBA三元體系相比,配體9PC、Com1存在的三元復合物體系中,9PC、Com1均能夠限制FtsZ蛋白的構象,同時對蛋白質二級結構、關鍵殘基質心距、活性口袋體積的變化起到關鍵性的控制作用,使T7Loop區(qū)底物通道保持穩(wěn)定存在,表現(xiàn)為C端序列不能移向N端序列, FtsZ蛋白組裝開關呈關閉狀態(tài).主要原因是9PC、 Com1既能與Val207、Leu209、Asn263等殘基形成氫鍵,又能與活性口袋中Gly193、Gly196、Leu200、Thr309等殘基形成關鍵性的疏水作用,從而穩(wěn)定存在于活性口袋.而3MBA與FtsZ蛋白形成疏水作用的殘基相對較少,因此疏水作用較弱,影響3MBA在活性口袋的穩(wěn)定性,隨著模擬時間的延長,3MBA逐漸遠離活性口袋區(qū)域.對三種配體的生物活性測試結果、分子對接結果以及MM-PBSA相對結合自由能計算結果比較發(fā)現(xiàn),三種實驗結果反映的規(guī)律相一致.上述研究結果為深入認識抑制劑對FtsZ蛋白的抗菌作用機制,以及以FtsZ蛋白為靶點的藥物設計、篩選和產品開發(fā)提供了重要的理論依據(jù).

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Molecular Dynamics Simulation and Antibacterial Mechanism of 3MBA Derivatives as FtsZ Protein Inhibitors

ZHANG He LU Jun-Rui*MU Jiang-Bei LIU Jin-Biao YANG Xu-Yun WANG Mei-Jun ZHANG Rui-Bo
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Tianjin University of Technology,Tianjin 300384,P.R.China)

In this paper,the complex stability,secondary structure,protein conformation,residue distance, active site volume,and binding free energy of the binary complex of filamentous sensitivity division protein Z of Staphylococcus aureus-guanosine diphosphate(SaFtsZ-GDP)and the ternary complex of SaFtsZ-GDP-3MBA(3-methoxybenzamide)derivatives were studied using molecular dynamics simulations,definition of secondary structure of proteins(DSSP),pocket volume measurer(POVME),and the molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area(MM-PBSA)method.The results show that the SaFtsZ-GDP binary complex was unstable in the absence of inhibitor,and the residues of its T7Loop area(residues 203-209)show obvious fluctuations.The secondary structure of the protein in the T7Loop area also changes significantly,the active pocket volume decreases dramatically and the substrate channel size becomes narrow and unstable.However, the SaFtsZ-GDP-3MBA derivatives ternary complex looks completely different in the presence of inhibitor PC190723 or Compound 1.Both of the inhibitors can form hydrogen bonds and hydrophobic interactions with high affinity to FtsZ.However,the ligand only forms hydrophobic interactions with partial residues of the active site as a function of simulation time in the SaFtsZ-GDP-3MBA ternary complex.This low affinity means that3MBAcannot stably exist in the active site,and so the antibacterial activity of 3MBAis significantly lower than that of PC190723 or Compound 1.The study shows the antibacterial mechanism and effect of 3MBAderivatives on FtsZ,and provides an important theoretical basis for inhibitor structural optimization,development and applications.?Editorial office ofActa Physico-Chimica Sinica

3-MBAderivative;FtsZ;Molecular dynamics simulation;Antibacterial mechanism; Binding free energy

O641

10.3866/PKU.WHXB201501061www.whxb.pku.edu.cn

Received:October 27,2014;Revised:January 6,2015;Published on Web:January 6,2015.

?Corresponding author.Email:lujunrui@tjut.edu.cn;Tel:+86-22-60216638.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(21476174,21176194).

國家自然科學基金(21476174,21176194)資助項目