石墨烯及其衍生物的抗菌性研究進展

摘要：該文主要介紹近年來關于石墨烯及其衍生物在抗菌性方面的應用研究進展，包括石墨烯及其衍生物的抗菌性，抗菌性的測定方法對比，以及生物安全性評估等內容。研究表明：石墨烯及其衍生物具有良好的抗菌性和生物相容性，同時也是抗菌活性物質的理想載體。通過劑量調控和化學修飾可以保持石墨烯的優越性，同時又避免其誘發生物毒性，拓寬其在生物醫學工程領域的研究與應用。

關鍵詞：石墨烯；氧化石墨烯；抗菌性

文獻標志碼：A

文章編號：1674-5124（2015）03-0008-06

0 引言

利用抗菌劑來抑制和殺滅有害細菌是提高人類健康水平的一個重要方法，傳統的抗菌劑，如抗生素、季銨鹽等不但會導致微生物的抗藥性，還會造成嚴重的環境污染。2010年，中國科學院上海應用物理所黃慶課題組首次發現了石墨烯材料的抗菌作用，即氧化石墨烯可以破壞細菌的細胞膜，導致胞內物質外流并殺死細菌。由于這是一種潛在的沒有耐藥性的物理“抗生素”，該工作發表后立即引起了科學界的廣泛興趣，之后，越來越多的研究證實了這點。但也有研究發現氧化石墨烯可以提高細胞的生長能力，促進細菌的生長。基于此，本文綜述了近年來關于石墨烯及其衍生物在抗菌性方面的研究進展，主要包括石墨烯及其衍生物的抗菌性，抗菌性的測定方法對比，以及生物安全性評估等內容，以期為石墨烯及其衍生物在抗菌材料方面的研究應用提供參考。

1 石墨烯及其衍生物

2004年，英國曼徹斯特大學物理學家安德烈·海姆（andre geim）和康斯坦丁·諾沃肖洛夫（konscantinnovoselov）將石墨薄片的兩面粘在一種特殊的膠帶上，撕開膠帶把石墨片一分為二。不斷重復上述操作，薄片越來越薄，最后成功地得到了僅由一層碳原子構成的薄片一石墨烯，并因此獲得2010年的諾貝爾物理學獎。石墨烯是由碳原子以sp'雜化連接的單原子層構成的新型二維原子晶體，其基本結構單元為有機材料中最穩定的苯六元環，它可以被看做是構成零維的富勒烯、一維的碳納米管及三維的石墨和金剛石的基本結構單元（圖1）。單層石墨烯的厚度僅為0.35nm，是世界上已知最薄的二維材料，具有豐富而奇特的物理化學特性，如石墨烯的比表面積高、導熱性和力學性能突出、電子傳遞性能非凡，并具有一定的抗菌活性，可應用在電子、信息、能源、物理學、生物醫藥和材料學等領域，具有廣闊的應用前景。然而，由于石墨烯化學穩定性高，結構完整，較難與其他介質發生相互作用，并且其片層之間的范德華力較強，所以石墨烯不能分散于水和常見的有機溶劑中，限制了其在生物醫學領域的發展和應用。因此，人們主要通過物理或者化學方法對石墨烯進行改性，提高其溶液分散性。氧化石墨烯（graphene ox-ide，GO）就是石墨烯改性的代表衍生物之一。氧化石墨烯一般由石墨經強酸氧化而得。主要有3種制備氧化石墨的方法：Brodie法、Staudenmaier法和Hum-mers法，其中Hummers法是目前最常用的一種。氧化石墨烯與石墨烯的結構基本相同，只是在單層碳原子結構的基面上連接有大量的含氧基團（見圖2），平面上含有-OH和C-O-C，而在其片層邊緣含有C=O和COOH。與石墨烯相比，氧化石墨烯具有良好的潤濕性能和表面活性，而且能被小分子或者聚合物插層后剝離，在改善材料的熱學、電學、力學等綜合性能方面發揮著非常重要的作用。與以往的碳基材料相比，氧化石墨烯具有以下特點：1）氧化石墨烯具有單原子層結構，良好的親水性使其能夠在水中完全分散為單層，意味著它具有更大的比表面積和表面活性與其他介質材料結合；2）修飾的氧化功能團提高了氧化石墨烯的表面活性，它們能夠直接與介質材料發生靜電吸附或鍵合作用，從而獲得穩定的復合結構；3）氧化石墨烯具有類似于表面活性劑分子的自組裝能力，能夠在平整的固體表面自組裝形成具有多層結構的連續的紙狀薄膜；4）氧化石墨烯的原子層骨架具有良好的機械強度，可以起到機械支撐作用；5）與以往常采用的碳納米管相比，氧化石墨烯價格便宜、制備簡單，適合大規模生產。

2 石墨烯及氧化石墨烯的抗菌性

目前，石墨烯材料的抗菌性研究主要分為兩個方面。一方面是石墨烯和氧化石墨烯本身的抗菌活性研究。2010年，中國科學院上海應用物理所黃慶課題組首先報道了石墨烯在抗菌材料方面的研究。他們發現，氧化石墨烯懸液在與大腸桿菌孵育2h后抑制率達到90%以上，其抗菌性來源于氧化石墨烯對大腸桿菌細胞膜的機械切割破壞。另外，通過真空抽濾法將氧化石墨烯制備成肉眼可見的片狀石墨烯膜，也能有效地抑制大腸桿菌的生長。Zhao等采用輻射接枝的方法將氧化石墨烯連接到棉布上制備了氧化石墨烯基抗菌棉織物，并測定其抗菌性。研究結果表明氧化石墨烯基抗菌棉織物表現出很強的抗菌性，抑菌率大于98%.且這種棉織物在被洗滌100次后抑菌率依然保持在90%以上。Akhavan等分別采用革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）對沉積在不銹鋼基質上的氧化石墨烯納米墻（graphene oxide nanowalls）和石墨烯納米墻（graphene nanowalls）的抗菌性進行了研究，發現氧化石墨烯和石墨烯對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都具有良好的抗菌性能；石墨烯抗菌能力更強，可能是由于還原過程增加了石墨烯的銳度，增強了其與細菌之間的接觸切割作用。Liu等研究了氧化石墨烯和還原氧化石墨烯（rGO）對大腸桿菌活力的影響，發現GO的抗菌能力高于rGO，大尺寸的GO比小尺寸的GO擁有更好的抗菌性。同時，研究發現氧化石墨烯和還原氧化石墨烯都可以氧化細菌體內的還原型谷胱甘肽。因此認為材料的抗菌性除了來自對細胞膜的破壞外，還可能來自材料引發的氧自由基進而誘發的氧化損傷。其抗菌性可能存在以下3個環節：首先細菌黏附在材料上，然后石墨烯通過尖銳的邊角切割細胞膜，接著超氧離子介導氧化應激最終導致細菌死亡。Krishnamoorlhy等研究證實了石墨烯可以通過脂質過氧化作用進行抗菌，間接說明了石墨烯的抗菌性可能與其氧化損傷相關。2013年Tu等提出了一種新的石墨烯抗菌機理，他們認為，石墨烯不但可以通過接觸切割作用對細菌細胞膜進行破壞，還可以通過大規模的直接抽提細胞膜上的磷脂分子，來破壞細胞膜并殺死細菌。該研究將理論模擬和實驗結果相結合，計算機分子學模擬指出石墨烯獨特的二維結構使其可以與細菌細胞膜上的磷脂分子發生超強的相互作用，導致大量磷脂分子脫離細胞膜并吸附到石墨烯的表面（見圖3）。透射電子顯微鏡實驗直接觀察到了細菌細胞膜與氧化石墨烯作用后產生的大范圍空腔結構（見圖4），為理論計算結果提供了實驗證據。這種提取細胞膜脂類分子從而殺死細菌的分子機制很好地詮釋了石墨烯基納米材料的抗菌機理及細胞毒性原理。張歡對3種不同尺寸的氧化石墨烯（205.8，146.8，33.78nm）的抗菌性研究結果顯示，氧化石墨烯與細菌細胞膜發生的這種脂類分子提取作用和GO的片層尺寸相關，尺寸越大，作用越強，抗菌性也越好。

石墨烯抗菌性研究的另一方面是氧化石墨烯負載銀的抗菌活性研究，以及氧化石墨烯與其他材料復合后的抗菌性研究。Zhu等采用靜電自組裝技術將納米銀顆粒負載到氧化石墨烯上制備出了GO-Ag復合材料，抗菌實驗結果表明，GO-Ag復合物對革蘭氏陰性菌一大腸桿菌的最小抑菌率（MIC）為3.2μg/mL，而納米銀顆粒對大腸桿菌的最小抑菌率為6.4μg/mL，同樣，GO-Ag復合物對革蘭氏陽性菌一枯草芽孢桿菌的最小抑菌率（MIC）為6.4μg/mL，而納米銀顆粒對枯草芽孢桿菌的最小抑菌率為9.6μg/mL，說明GO-Ag復合物具有更好的抗菌性。Liu等的研究也發現當GO-Ag質量濃度為80μg/mL時，GO-Ag復合物對大腸桿菌的抑菌率可達到99%，遠高于同濃度時GO的抑菌率（10%）和納米銀的抑菌率（86%）。當材料質量濃度提高到100μg/mL時，GO的抑菌率（17%）和納米銀的抑菌率（96%）也不及GO-Ag復合物質量濃度僅為80μg/mL時的抑菌率（99%）。類似的研究均發現納米GO-Ag；復合材料具有更好的抗菌性。此外，Lim等將GO、rGO分別與殼聚糖進行復合后測定其復合物的抗菌性，結果表明GO或rGO與殼聚糖復合后并不影響其自身的抑菌作用，由于GO與殼聚糖有協同抗菌作用，使得復合物的抗菌能力優于同濃度下GO或rGO的抑菌率。Santos等將聚乙烯咔唑連接到GO上形成新型復合物，其抗菌性研究結果也得出了類似的結論，這說明石墨烯材料在復合過程中依然保持了其抗菌特性，在涂料、包裝、抗菌織物和醫用材料中具有廣闊的應用前景。專利CN10397595IA介紹了一種氧化石墨烯/銀絡合抗菌材料，該發明將銀與有機或無機絡合物結合形成小分子，再結合氧化石墨烯來增強其穩定性，并通過緩釋性來延長抗菌性能，提高了氧化石墨烯銀系抗菌材料與其他助劑同浴時的穩定性，還降低了銀系抗菌材料的成本，具有高效、無毒、環保的優點。專利CN103651564A以氧化石墨烯溶液和青霉素陰離子捅層水滑石膠體溶液的混合液為原料，用溶液澆鑄法制備得到了氧化石墨烯/水滑石抗菌納米復合薄膜材料。將該納米復合薄膜暴露在新培養的溶壁微球菌溶液中24h后，薄膜表面幾乎沒有細菌附著，只有少量的細菌代謝產物，表明復合薄膜具有良好的抗菌性能。專利CN103191464A介紹了一種抗菌多孔氧化石墨烯/殼聚糖復合支架的制備方法。該方法以羧基化的氧化石墨烯為抗生素載體，利用氧化石墨烯表面的羧基與抗生素上的氨基發生靜電作用將抗生素吸附到氧化石墨烯上；再將抗菌金屬離子螯合在殼聚糖分子中，最后把載有抗生素的羧基化石墨烯和載有抗菌金屬的殼聚糖溶液混合，冷凍干燥，得到載有兩種不同抗菌材料的復合支架。該復合支架能在短期內釋放抗生素以及長期釋放抗菌金屬離子，兼顧了短期抗菌與長期抗菌作用，抗菌效果好。

3 石墨烯抗菌性的測定方法比較

在微生物學中，抗菌劑的抗菌效果通常是通過檢測微生物在抗菌劑作用前后數目的變化來表示。常用的方法有平板菌落計數法、光電比濁度法、顯微鏡直接計數法、膜過濾法等。呂敏等采用光電比濁計數法、抑菌環法和平板菌落計數法對比測定了GO的抗菌效果。結果顯示抑菌環法和光電比濁計數法測定的GO無抗菌性，而平板菌落計數法測定的GO有明顯的抗菌性，抑菌率約80%。他們認為抑菌環實驗法測定GO的抗菌性時，因GO不具有溶解性，其懸液滴加在濾紙上時GO不能擴散，無法殺死濾紙邊緣的細菌而形成明顯的抑菌環；光電比濁法測定GO抗菌性時，由于其比表面積大，易吸附培養基中的蛋白質形成易于細菌生長的附著點，促進細菌的生長。因此，這兩種方法都不能準確反映GO的抗菌效果；而采用平板菌落計數法測定GO抗菌性時，細菌與GO懸液充分接觸，作用后的細菌數目通過平板計數直接反映出來，避免了其他干擾因素，能夠客觀準確地反映GO的抗菌效果。由此可見，使用不同的檢測方法，同一種抗菌劑也會得出不同的實驗結果。這就要求實驗人員在進行抗菌性檢測的時候，要根據抗菌劑的性質來進行合理選擇。

4 石墨烯的生物安全評價

石墨烯及其衍生物在組織工程、藥物載體、生物檢測、生物成像等生物醫學領域具有潛在的應用前景，但其生物安全性評價的研究還比較缺乏。Zhang等采用示蹤技術研究了GO在小鼠體內的分布和生物毒性，發現GO血液循環時間長，網狀內皮系統吸收低。當暴露在Img/kg GO下14d時，未發現明顯的病理變化；當GO劑量提高到10mg/kg時，小鼠肺部會出現明顯的病理性改變，提示高劑量的GO存在肺毒性。Zhang等研究發現，石墨烯對PC12細胞的代謝影響存在濃度依賴性，當石墨烯質量濃度低于0.01μg/mL時，細胞活性基本沒有降低，可以用在載藥、生物檢測和治療中。Wang等的研究也發現，GO對人成纖維細胞的毒性存在濃度依賴性。當GO質量濃度低于20μg/mL時，GO對細胞無明顯毒性，當GO質量濃度大于50μg/mL時出現明顯的細胞毒性，細胞存活率下降。Lu等也對GO的細胞毒性進行了研究，發現當GO質量濃度達到lOOmg/L時，細胞的相對存活率仍接近100%，說明GO細胞毒性較低。Kalbacova等研究了成骨細胞及間充質干細胞在石墨烯支架材料表面的細胞黏附及增殖能力，結果表明，石墨烯能夠促進成骨細胞及間充質干細胞黏附及增殖，提示石墨烯片無細胞毒性，有望成為具有骨傳導和骨誘導作用的骨移植物質。Zhang等的研究發現，同等質量濃度下，GO尺寸越小，其細胞毒性越小。Chang等的研究發現，3種不同尺寸G0（588，556，148nm）在質量濃度小于50μg/mL時，無明顯的細胞毒性，但GO存在細胞氧化應激作用，高濃度可使細胞活性稍微降低。上述研究說明石墨烯對細胞活性的影響存在一定的濃度依賴性，并且隨GO尺寸的減小細胞毒性隨之降低。

Zhang等在氧化石墨烯的生物毒性、可控聯合載藥和靶向運輸等方面進行了研究，結果表明，納米GO可被細胞吸收但沒有明顯的細胞毒性，對一些芳香類的小分子藥物具有超強的吸附能力，非常適合作為靶向藥物載體，葉酸修飾的GO在質量濃度高達100μg/mL仍沒有明顯的細胞毒性。Yang等將聚乙二醇（PEG）修飾的GO注射到小鼠體內，發現GO主要沉積在網狀內皮系統，在肺內未見到明顯的炎癥反應，并且納米GO可以逐漸通過肝臟代謝。Ruiz等考察了胺基化的石墨烯對血小板活力的影響，結果顯示胺基化的石墨烯不會引起血小板聚合，并且小鼠靜脈注射后不會引起肺血栓栓塞。這說明石墨烯通過功能化修飾后可以降低其誘發的生物毒性，進而發揮石墨烯的抗菌性和生物相容性，具有更安全的生物醫學應用。

5 結束語

本文總結了近年來關于石墨烯及其衍生物在抗菌性及生物安全性方面的研究報道，研究表明，石墨烯與細菌作用時表現出優異的抗菌性能，與細胞或生物體作用時只表現出微弱的細胞毒性，說明石墨烯是一種既具有抗菌性又具有良好生物相容性的納米材料，在生物醫學方面具有極大的應用潛力。石墨烯同時還是抗菌活性物質的理想載體，在開發新型抗菌材料方面有巨大潛力，但目前還只是針對石墨烯及其衍生物本身的抗菌活性和其他一些應用進行了初步研究。石墨烯的生物安全性研究雖然已經積累了一定的研究基礎，但其生物效應和安全性數據目前還不是很充分，需要綜合多方面的因素進行深入研究。此外，石墨烯與生物體相互作用的機制研究尚處于初級階段，還有待進一步地深入研究。當然，石墨烯材料對生物體存在的潛在危害并不是絕對的，可以通過化學修飾和劑量調控保持石墨烯的優越性又避免其誘發生物毒性，使其更為安全、廣泛地應用于各個領域，隨著研究的不斷深入，石墨烯材料將極大地造福于人類。