曲霉NS1產木聚糖酶發酵條件優化

摘要

以真菌NS1為研究對象，采用單因素試驗研究碳源、碳源組成、氮源、碳酸鈣、表面活性劑及初始pH對產木聚糖酶的影響。結果表明：最佳碳源為玉米芯；復合碳源玉米芯+木聚糖最有利于木聚糖酶的分泌；最佳氮源是硫酸銨；當初始pH為5.0，碳酸鈣濃度為1.5%，表面活性劑為SDS時，木聚糖酶活力最高。

關鍵詞曲霉NS1；木聚糖酶；發酵條件的優化

中圖分類號S-03；Q539文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）26-006-02

AbstractThe xylanase expression of Aspergillus NS1 was studied with the single factor experiment of carbon source， carbon source concentration， nitrogen source， calcium carbonate， surfactants and pH value. The results of the experiments showed： the optimal carbon source and nitrogen source is corn cob， ammonium sulfate， respectively. The compound carbon sources are comcob and xylan. The concentration of Calcium carbonate of 1.5% and SDS added were optimal for expression of xylanase at pH5.0.

Key wordsAspergillus NS1； Xylanase； Optimization of fermentation conditions

木聚糖是半纖維素的重要組成成分，是植物細胞壁中一種主要的多糖，是自然界中僅次于纖維素的多糖，約占地球可再生有機碳源的1/3[1]，是自然界中一種重要的生物資源，也是最容易提取、降解和利用的一類半纖維素[2]。木聚糖酶是一種重要的工業用酶，可廣泛應用于飼料加工、紙漿漂白、食品、生物能源等領域，具有極大的商業應用價值[3]。木聚糖酶對紙漿進行預處理，可以大大減少化學漂白劑的用量，從而降低對環境的污染，而且可以提高紙漿的白度[4]；木聚糖酶可以提高動物腸道內容物的黏度[5]；低聚木糖和木糖能增加腸道內有益菌的數量，降低畜禽的腹瀉率等[6]，用來水解多糖物質，達到澄清飲料和酒類的目的[7]；低聚木糖還可用作食品工業中的黏稠劑和脂肪替代品，或者用在食品添加劑中作為抗凍劑、低熱量甜味劑等[8]。

我國有著豐富的玉米芯、小麥麩、秸稈、花生殼等富含半纖維素類自然資源的農林廢棄物，但是長期以來未受到充分重視和開發利用。以農林廢棄物為發酵原料生產木聚糖酶，不僅可以取得巨大的經濟效益，而且可以處理農林廢料，變廢為寶，保護環境，加快農業發展，在一定程度上解決三農問題，提高我國農業可持續發展的能力[9-10]。以農林廢棄物為發酵原料，筆者篩選獲得一株高產木聚糖酶的菌株，并且對其進行發酵條件的優化，以期獲得較高酶活力的木聚糖酶。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試玉米芯、麩皮、黃豆桿、花生殼、稻草經充分風干后粉碎，過40～120目篩，其中玉米芯、麩皮、黃豆桿、花生殼、稻草均來自江蘇淮安近郊。

1.2供試菌種

試驗篩選、保存曲霉NS1菌株。

1.3培養基及主要試劑的配制

1.3.1

查氏培養基。硝酸鈉3.0 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，氯化鎂0.5 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，葡萄糖30 g/L，瓊脂15 g/L。

1.3.2

發酵基礎培養基。磷酸二氫鉀2 g/L，硫酸銨2 g/L，七水硫酸鎂0.3 g/L，氯化鈣0.3 g/L，七水硫酸亞鐵0.05 g/L，七水硫酸錳1.56 mg/L，硫酸鋅1.4 mg/L，氯化鈷0.2 mg/L，尿素0.5 g/ml，吐溫80 1.5 g/L。

1.4試驗方法

1.4.1

木聚糖酶發酵條件的優化。將低溫保存的曲霉NS1于查氏培養基上劃線，28 ℃培養3 d后制備孢子懸液，按照5%接種量接種于液體發酵培養基中，采用單因素法分別研究不同2%碳源（黃豆桿、玉米芯、花生殼、麩皮、稻草）、2%復合碳源組成（玉米芯+木糖、蔗糖、葡萄糖、木聚糖、麩皮、纖維素）、1%氮源（硫酸銨、尿素、蛋白胨、酵母膏、硝酸銨、硝酸鉀、0.5%蛋白胨+0.5%硝酸鉀）、碳酸鈣濃度（1%、1.5%、2%、2.5%）、初始pH（3、4、5、6、7）、表面活性劑（SDS、吐溫80、EDTA、甘油）等對曲霉NS1發酵產酶的影響。

液體發酵基礎培養基中分別添加2%玉米芯+2%木聚糖作為碳源，1%硫酸銨作為氮源，碳酸鈣濃度為1.5%，以SDS作為表面活性劑。在初始pH5.0條件下進行誘導產酶。

1.4.2

木聚糖酶酶活的測定。取50 mmol/L pH 5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液1.0 ml，加經適當稀釋的酶液0.5 ml于25 ml試管中，放入50 ℃水浴鍋中，立即加入0.5 ml相應的底物，準確保溫30 min，立即冷卻，加入3 ml DNS，沸水煮5 min，立即冷卻且定容到25 ml，在550 nm下測吸光度。一個木聚糖酶酶活力單位定義為：每分鐘水解生成1 μmol木聚糖所需要的酶量。

2結果與分析

2.1不同碳源對木聚糖酶表達的影響

碳源是影響高效生產木聚糖酶的關鍵因素之一。它在微生物生長過程中為機體提供維持生命活動所必需的能源物質，并且在產木聚糖酶過程中為誘導底物。由于不同種類的農業廢棄物所具有的碳源的性質、含量不同，微生物利用的程度不同，菌株利用農業廢棄物產木聚糖酶的能力存在差異。

由圖1可知，玉米芯作為碳源明顯高于其他農作物。這可能是由于玉米芯中含有的半纖維素以木聚糖為主，同時所含有的大量氮源和各種微量元素能促進酶的合成。

2.2不同碳源組成對木聚糖酶表達的影響

與單一的碳源相比，復合碳源能有效地提高絮凝率和菌濃度。選用不同的碳源+玉米芯，考察不同碳源組成對木聚糖酶表達的影響。

由圖2可知，當向培養基中添加木聚糖時，表達量最高，當酶活力達到73.36 IU/ml時木聚糖誘導微生物細胞產生木聚糖酶且分泌到胞外的效果較好。

2.3不同氮源對木聚糖酶表達的影響

氮源主要用于菌體細胞物質和含氮代謝物的合成。不同的固氮微生物能利用自然界存在的分子態氮，但更多的微生物只能利用無機或有機含氮化合物作為氮源。以玉米芯為唯一碳源，添加不同的有機氮源和無機氮源，質量分數為1.0%，考察氮源對木聚糖酶合成的影響。

由圖3可知，nsty1菌株在有機氮源為氮源的培養基中生長緩慢，但在硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀中生長良好，說明無機氮源適合于nsty1菌株分泌木聚糖酶。其中，最佳氮源為硫酸銨。可能原因是銨鹽被分解利用，使發酵液的pH下降，改變菌株生長的緩沖體系，反而利于菌株的生長和產酶。

2.4碳酸鈣對木聚糖酶表達的影響

由于在發酵過程中菌株呼吸作用會產生大量的酸，影響菌體生長和木聚糖酶合成，使得酶的活力變得很低。在培養基中添加CaCO3可以消除代謝副產物對酶活力的影響，但CaCO3的添加量過多，會使培養基變稠，影響通氣，進而影響菌體的生長和木聚糖酶的產量。

由圖4可知，在培養基中添加碳酸鈣會提高酶的產量。增大碳酸鈣添加量，可以提高酶活力，但二者并不呈正比。當碳酸鈣添加量由0增加至15 g/L，產木聚糖相對酶活力提高了68.8%；再增加碳源添加量時，酶活力反而有所降低，其原因可能是高濃度底物使培養基過于稠密，發酵液內溶氧量迅速下降至臨界值，不利于菌體呼吸作用，因而對菌體生長產生明顯抑制，出現高濃度條件下的“阻遏”作用以及明顯的傳質阻力作用。因此，15 g/L的碳源添加量對該菌種產酶較為適宜。

2.5不同表面活性劑對木聚糖酶表達的影響

有研究表明，在Bacillus pumilus ASH的培養基中添加體積分數為0.2%的橄欖油，發現木聚糖酶活力提高到原來的2倍，并且這類物質改變了細胞膜的通透性，從而促進木聚糖酶的胞外分泌。橄欖油相當于是一種表面活性劑。可見，表面活性劑是影響高效生產木聚糖酶的關鍵因素之一。

劑后相對酶活力提高。在培養基中添加表面活性劑會提高酶的產量。這可能是由于表面活性劑可改變細胞膜的通透性，并且提高氧在氣液界面的傳遞速度。

2.6初始pH對木聚糖酶表達的影響

由于微生物對生長壞境的酸堿要求不同，培養基初始pH對菌株產酶的影響很大。在發酵過程中選擇適宜的pH非常重要。

圖6初始pH對木聚糖酶表達的影響

由圖6可知 ，培養基的初始pH對產酶的影響很大，當pH為5時nsty1表達量最高。當初始pH上升或下降時，木聚糖酶相對酶活力明顯下降。原因可能是體系pH的改變影

響部分營養物質的解離狀態和霉菌細胞膜的生理功能，從

而影響微生物的生長和酶的合成[5]。堿性條件抑制微生物的生長和產酶，當pH為7檢測到的酶活極低，僅為最高值的 13.22%。

參考文獻

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