金屬離子對平菇和杏鮑菇纖維素酶活性的影響

摘要[目的] 研究金屬離子對平菇和杏鮑菇纖維素酶活性的影響。[方法]在以蠶沙、稻殼為基質(zhì)的平菇和杏鮑菇液體發(fā)酵過程中添加0.5 mmol/L的硫酸亞鐵、硫酸銅、硫酸錳和硫酸鋅，分析這些離子對濾紙酶、Cx酶2種纖維素酶活性的影響。[結(jié)果]結(jié)果表明在稻殼、蠶沙為基質(zhì)的培養(yǎng)基中，添加0.5 mmol/L Zn2+和Mn2+ 有效提高了纖維素酶活性。[結(jié)論]該研究為提高蠶沙和稻殼的纖維素利用率提供了新方法。

關(guān)鍵詞金屬離子；平菇；杏鮑菇；濾紙酶；Cx酶

中圖分類號S646.9文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）26-059-02

Abstract[Objective] The paper was in order to study the effect of ions on the activity of Pleurotus ostreatus and Pleurotus eryngii cellulase. [Method] After adding 0.5 mmol/L FeSO4， CuSO4， MnSO4 and ZnSO4 to Pleurotus ostreatus and Pleurotus eryngii liquid submerged cultures， the effects of ions on FPA and Cx enzyme activities under basal culture media contanning silkworm and rice husk were analyzed. [Result]This study showed that adding 0.5 mmol/L Zn2+ and Mn2+ was beneficial to the improvement of the activities of FPA. [Conclusion] It provided a new way to improve the utilization rate of the silkworm and rice husk.

Key wordsIon； Pleurotus ostreatus； Pleurotus eryngii； FPA； Cx enzyme

自然界中纖維素資源豐富，但是聚合度（DP）非常大，為2 000～15 000[1]。纖維素的利用與纖維素酶活性密切相關(guān)，通過微生物產(chǎn)生的纖維素酶轉(zhuǎn)化和降解纖維素是纖維素有效利用的途徑[2]。大多數(shù)微生物產(chǎn)生的纖維素酶是一個多組分的酶體系，相互協(xié)調(diào)作用將纖維素降解成葡萄糖[3]。金屬離子是真菌菌絲體生長及產(chǎn)酶過程中必需的營養(yǎng)物質(zhì)[4]。金屬離子作為某些酶的激活劑能夠提高這些酶的活性。學(xué)者對此進行了大量相關(guān)研究，但得出了不同的結(jié)論[5-6]。

該試驗以纖維素酶系中可反映纖維素降解、轉(zhuǎn)化能力的濾紙酶（FPA）和內(nèi)切β1，4葡聚糖苷酶（Cx酶）為研究對象，研究在蠶沙、稻殼基質(zhì)中添加不同金屬離子對平菇、杏鮑菇生長過程中分泌纖維素酶系影響，其中蠶沙和稻殼是自然界中纖維素含量高而利用率低的2種基質(zhì)。通過前期一系列試驗得出利于平菇和杏鮑菇生長的最適稻殼、蠶沙含量組合[7]，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同金屬離子，檢測菌絲生長過程中濾紙酶和Cx酶的活性，以便為提高纖維素利用率提供思路。

1材料與方法

1.1試驗基質(zhì)與試劑

稻殼：取自安徽黃山當?shù)孛讖S（新鮮風干）。蠶沙：取自安徽黃山當?shù)剞r(nóng)戶家。瓊脂、葡萄糖、蛋白胨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸錳、硫酸銅、硫酸亞鐵、硫酸鋅均為分析純。試驗試劑還有3，5二硝基水楊酸（DNS）溶液，1 mg/ml的葡萄糖標準液，0.05 mol/L pH5.0的檸檬酸緩沖液，0.05 mol/L pH 4.5的檸檬酸緩沖液，0.05 mol/L羧甲基纖維素鈉（CMC）溶液。

1.2試驗菌種

平菇（Pleurotus ostreatus）和杏鮑菇（P.Eryngii）菌種來源于安徽師范大學(xué)微生物重點實驗室。

1.3儀器與設(shè)備

YX280DII高壓滅菌鍋（廣州康邁醫(yī)療器械有限公司）、THZ-D空氣恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床（常州市萬豐儀器制造有限公司）、SW-CJ-2D超凈無菌工作臺（上海蘇凈實業(yè)有限公司）、JHF1-DHG-9023A電熱鼓風干燥箱（北京中西遠大科技有限公司 ）、LK-400A搖擺式高速中藥粉碎機（新昌縣紅利數(shù)控制造廠）、HZT-A1000電子天平（上海嘉展儀器設(shè)備有限公司）、UV-5100分光光度計（上海元析儀器有限公司）、HH-S電熱恒溫水浴鍋（金壇市文華科教實驗儀器廠）。

1.4試驗方法

1.4.1試驗基質(zhì)預(yù)處理。

稻殼曬干、粉碎、過篩，保存?zhèn)溆谩ＰQ沙85 ℃下烘干至恒重，粉碎成末、過篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2培養(yǎng)基制備。

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。液體菌種培養(yǎng)基： 20 g/L葡萄糖、2 g/L蛋白胨、0.5 g/L硫酸鎂、0.1 g/L氯化鈣、0.5 g/L磷酸二氫鉀。平菇基礎(chǔ)培養(yǎng)基：40 g/L稻殼粉，10 g/L蠶沙，0.5 g/L硫酸鎂，0.5 g/L磷酸二氫鉀；杏鮑菇基礎(chǔ)培養(yǎng)基：20 g/L稻殼粉，5 g/L蠶沙，0.5 g/L硫酸鎂，0.5 g/L磷酸二氫鉀。所有培養(yǎng)基pH自然，121℃滅菌20 min。

1.4.3液體菌種制備。將活化的平菇和杏鮑菇菌種分別接于斜面培養(yǎng)基，25 ℃恒溫箱培養(yǎng)7 d。液體菌種：將斜面菌種接種到100 ml液態(tài)一級培養(yǎng)基中，搖床振蕩（25 ℃，130 r/min）培養(yǎng)5 d，作為種子液，4 ℃保存?zhèn)溆谩０l(fā)酵試驗：取10 ml液體菌種，接種于100 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，搖床振蕩（25 ℃，130 r/min）培養(yǎng)7 d。

1.4.4酶液制備。無菌條件下，從培養(yǎng)液中移取6 ml上層液，4 000 r/min離心15 min，取上清液，即為酶液，4 ℃冰箱保存待用。

1.4.5酶活的測定。

1.4.5.1葡萄糖（G）標準曲線的制作。

配制不同濃度的葡萄糖溶液，分別加入1.5 ml DNS溶液，搖勻，沸水浴5 min，冷卻，定容。在540 nm波長下，測定各混合溶液的OD值。以葡萄糖含量（mg/ml）為橫坐標，以對應(yīng)的光密度值為縱坐標，繪制出葡萄糖標準曲線（圖1）。

1.4.5.2酶活的計算。

濾紙酶（FPA）和Cx酶酶活單位（U/L）定義為：在波長540 nm處每小時由底物生成1 μmol

葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活力單位（U）[8]。

2結(jié)果與分析

2.1金屬離子對平菇產(chǎn)纖維素酶活力的作用

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入0.5 mmol/L的硫酸銅、硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸錳，濾紙酶與Cx酶活力如表1、2所示。與對照組相比，表現(xiàn)為促進產(chǎn)酶活性的是Mn2+和Zn2+，表現(xiàn)為抑制產(chǎn)酶活性的是Fe2+和Cu2+。與所加的其他幾種離子相比，Zn2+酶活最高，高達1 574 U/L，高出對照16.2%。Mn2+和Zn2+組Cx酶酶活性較高，具有顯著促進作用，分別于接種后第4、5天達到峰值，即分別為2 412 U/L和2 969 U/L，分別高出對照378 U/L和1 183 U/L。

2.2金屬離子對杏鮑菇產(chǎn)纖維素酶活力的作用

金屬離子對杏鮑菇產(chǎn)纖維素酶活力的作用情況如表3、4所示。與對

照組相比，表現(xiàn)為促進產(chǎn)酶活性的是Mn2+和Zn2+，表現(xiàn)為抑制產(chǎn)酶活性的是Fe2+和Cu2+。濾紙酶于第4天增加明顯，第6天達到高峰，與其他幾種離子相比，Zn2+酶活最高，高達3 061 U/L，高出對照組37.5%。Cu2+抑制作用最強，Cx酶活性為863 U/L，僅為對照組的52.1%，對Cx酶促進作用最顯著的是Zn2+，第5天達到3 308 U/L峰值，高出對照組49.5%。

3結(jié)論與討論

大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)，物理、化學(xué)、生物等因子都能影響蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變，金屬離子對酶的催化作用尤其重要，金屬離子主要通過影響底物反應(yīng)定向或可逆改變金屬離子的氧化態(tài)來調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)等途徑參加催化過程[9]。

該試驗結(jié)果表明，對纖維素酶促進作用顯著的是Zn2+和Mn2+，此結(jié)論與趙玉蓉等[10]人研究的結(jié)果一致；對纖維素酶有明顯抑制作用的是Cu2+，與李德瑩等[11]人研究的金屬離子對纖維素酶活力的影響結(jié)果一致，可能是Cu2+為重金屬離子，隨其濃度增大抑制作用增強，濃度過量時尤為明顯，酶幾乎失活，發(fā)生不可逆的改變，該試驗選用的正是相對濃度較高的0.5 mmol/L Cu2+。Fe2+對產(chǎn)纖維素酶也有一定程度的抑制，可能是生產(chǎn)纖維素酶過程中，它占據(jù)了某些酶的活性中心導(dǎo)致木質(zhì)素酶活性降低，影響木質(zhì)素的降解進而影響纖維素的降解[12]。在稻殼、蠶沙為基質(zhì)的培養(yǎng)基中，添加Zn2+、Mn2+ 有利于纖維素酶活性的提高，從而為提高稻殼、蠶沙中的纖維素利用率提供理論參考。

參考文獻

[1] 張景強，林鹿，孫勇，等.纖維素結(jié)構(gòu)與解結(jié)晶的研究進展[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2008，28（6）：109-114.

[2] 王超，韓璐，潘力.無機離子和非離子表面活性劑對酸性纖維素酶活性的影響[J].現(xiàn)代食品科技，2009，25（2）：152-156.

[3] JRGENSEN H，KUTTER J P，OLSSONA L.Separation and quantification of cellulases and hemicellulases by capillary electrophoresis[J].Analytical biochemistry，2003，317：85-93.

[4] 諸葛斌，姚惠源，姚衛(wèi)蓉.生淀粉糖化酶的結(jié)構(gòu)和作用機理[J].工業(yè)微生物，2001，31（1）：49-51.

[5] FERCHAK J D，PYE E K.Effect of cellobiose，glucose，ethanol，and metal ions on the cellulase enzyme complex of Thermomonospora fusca[J].Biotechnology and bioengineering，1983，25（12）：2865-2872.

[6] 李金花，程遠征，張洪林.纖維素降解過程中金屬離子作用的研究[J].臨沂師范學(xué)院學(xué)報，2005，27（3）：30-32.

[7] 洪培，疏義林，胡宇，等.2 種真菌培養(yǎng)液對食用菌菌絲體生長的影響[J].中國食用菌，2013，32（2）：33-35.

[8] 劉德海，陳曉鴿.纖維素酶活性的測定[J].中國飼料，2002（17）：27-28.

[9] 張智研，張偉偉.金屬離子對纖維素酶水解玉米秸稈的影響[J].中國新技術(shù)新產(chǎn)品，2010（8）：3-4.

[10] 趙玉蓉，金宏，陳清華，等.金屬離子對纖維素酶及木聚糖酶活性影響的研究[J].飼料博覽，2005（1）：1-3.

[11] 李德瑩，龔大春，田毅紅，等.金屬離子對纖維素酶活力影響的研究[J].釀酒科技，2009（6）：41-42.

[12] 張麗萍，董超，王迎春，等.幾種離子對纖維素酶活力的影響[J].河北省科學(xué)院學(xué)報，2000，17（4）：235-238.