LED燈在植物研究上的現狀和展望

摘要

[目的] 對油楠基因組DNA提取、ISSR反應體系優化及引物篩選進行探討。[方法] 運用改良CTAB法對油楠樹皮進行基因組DNA提取， 利用單因素試驗，對油楠ISSRPCR反應各因素水平進行優化。[結果]運用改良CTAB法對油楠樹皮進行基因組DNA提取效果最佳；最優體系：20 μl反應體系中，模板用量20 ng，引物濃度0.6 μmol/L，dNTPs濃度0.2 mmol/L，Mg2+濃度2.0 mmol/L，Taq酶用量1.5 U，10倍反應緩沖液2 μl，ddH2O補至20 μl；以該體系為基礎進行引物篩選，在100條ISSR隨機引物中篩選出13條多態性較高、擴增條帶清晰、重復性好的引物。[結論]該研究豐富了油楠遺傳學基本資料，為油楠遺傳多樣性研究奠定基礎。

關鍵詞油楠；DNA提取；ISSRPCR；優化

中圖分類號S166文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2015）26-013-04

Abstract [Objective] DNA extraction， optimization of ISSRPCR system and primers screening of Sindora glabra were investigated.[Method] Using the modified CTAB method for genonmic DNA extraction of Sindora glabra leather， using the method of single factor experiment， ISSR PCR reaction factors level was optimized. [Result]The results showed that：the extraction effect for genomic DNA of Sindora glabra bark was the best. The optimal reaction system in 20 μl reaction system was 20 ng DNA， 0.6 μmol/L ISSR primer， 0.2 mmol/L dNTPs， 2.0 mmol/L Mg2+， 1.5 U Taq DNA polymerase and 2 μl tenfold reaction buffer solution with ddH2O added to 20 μl of total solution； According to this reaction system， 13 primers in 100 primers were chosen for high polymorphism， their charity and repetition.[Conclusion] The study enriched genetics basic information of Sindora glabra ， laid the foundation for the research of genetic diversity.

Key words Sindora glabra； DNA extraction； ISSRPCR； Optimization

油楠（Sindora glabra Merr. ex de Wit）隸屬于蘇木科（Caesalpiniaceae）油楠屬（Sindora Miq.），是國家二級重點保護野生植物，也是國內目前報道的樹體內直接產生樹脂油的“柴油樹”，具有油用、藥用、觀賞和材用等用途[1-3]。因此，加強油楠基礎研究和促進油楠資源開發利用勢在必行[4]。目前，研究多集中于植被分類、資源分布、生物學特性、產油特性和樹脂油理化特性分析等方面[1，5-11]，而對油楠遺傳多樣性等方面的研究鮮有涉及，在一定程度上限制了油楠的開發利用。由于長期過度利用，油楠野生資源已十分稀少，僅零星分布于海南，因此亟待開展油楠遺傳學基本資料的研究。

ISSR標記是由Zietkiewicz等[12]提出的一種標記技術，采用17～22堿基的重復錨定引物擴增重復序列之間的片段。ISSR綜合了RAPD和SSR的優點，又克服了RAPD標記穩定性和重復性差等缺點，具有操作簡單、重復性好、多態性豐富的特點，已被廣泛應用于品種鑒定[13-17]、指紋圖譜的構建[18-19]。由于取樣距離和樣品保存方式的影響，加之油楠組織內酚類及多糖物質較多，影響油楠DNA的提取、ISSR反應體系優化及引物篩選，筆者旨在解決以上問題，豐富油楠遺傳學基本資料，為今后油楠后續研究奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料包括油楠單株的幼葉或樹干基部樹皮韌皮部樣品，采集于海南樂東、昌江、陵水和五指山四大油楠主要分布區，采樣單株相隔100 m以上。樣品采集后立即裝入密封袋并用硅膠速干法處理，帶回室內貯藏于-20 ℃的冰箱中備用。

1.2主要儀器及試劑

PCR儀（BioRad PTC0200）、球磨儀（Retsch MOL.L1400）、真空離心濃縮儀（Eppendorf 5301）、電泳儀（BioRad PowerPac HV）、超低溫冰箱（Revco ULT1786）、超純水系統（MILLIPORE MilliQ）、制冰機（Scotman AF100）、超速冷凍離心機（Eppendorf 5801R）和其他相關儀器設備，以及DNA提取和ISSRPCR相關反應試劑等。

1.3試驗方法

1.3.1油楠總DNA的提取及DNA純度、濃度檢測。

在參照多種DNA提取和優化方法[20-21]的基礎上，采用改良CTAB法[22]提取油楠葉和樹皮的DNA，其具體操作步驟：取50 mg樹皮干樣，加入2 ml離心管中，再放入3～5粒鋼珠，液氮冷凍后置于球磨儀上（注意兩邊平衡），頻率設置25，振蕩3 min；向樣品管中加入1 ml CTAB提取液，65 ℃恒溫水浴45 min左右，期間每隔10 min搖動一次；取出樣品管，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液；加入等體積氯仿/異戊醇（體積比24∶1），搖勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液，若上清液較黏稠，重復該步驟；向上清液中加入1/2體積5 mol/L NaCl，混勻；加入1/2體積預冷異丙醇，4 ℃保存，隔夜處理；12 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入75%乙醇和無水乙醇各洗一次，洗后用紙巾吸干，置于真空干燥儀干燥；加入1×TE溶解后，置于-20 ℃冰箱備用。

基因組DNA純度檢測：1×TAE電泳緩沖液、1.2%瓊脂糖凝膠電泳（0.1%Goldview染色），電壓120 V，時間45 min左右；電泳后，使用數碼相機在凝膠成像儀上拍照記錄，檢測基因組DNA的質量。

DNA樣品濃度檢測：使用紫外分光光度計，測定樣品230、260、280 nm處的吸收值，計算其濃度，并稀釋成10 ng/μl。

1.3.2ISSRPCR反應體系的構建。

1.3.2.1ISSRPCR反應體系及反應程序的建立。

100條隨機ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的ISSR引物序列，由北京鼎國昌盛生物科技有限責任公司合成。反應體系參照穆立薔等[23]：在20 μl的反應體系中，Taq酶1.0 U，Mg2+ 2.0 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，引物0.4 μmol/L，10×Taq buffer 2 μl，模板DNA 30 ng。

ISSRPCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、50 ℃退火、72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃至恒溫。

1.3.2.2 PCR擴增產物的檢測。

PCR結束后，取PCR產物6 μl加入2 μl溴酚藍混勻，1.8%瓊脂糖凝膠，于1×TAE電泳緩沖液（Goldview濃度0.1%）中電壓120 V，電泳1 h左右。Marker為D2000 ladder Marker。電泳結束后于WD9403F紫外儀下觀察并照相記錄。

1.3.2.3 ISSRPCR反應體系的優化。

為確定油楠基因組DNA最佳ISSR擴增條件，根據預試驗結果，以U808為通用引物，反應體系優化主要采用單因子試驗設計，影響PCR反應的6個主要因素：DNA模板、引物濃度、dNTPs濃度、Mg2+濃度、Taq酶濃度、退火溫度，逐個在6個水平上進行優化試驗，建立油楠最佳ISSRPCR反應體系。各成分優化設計見表1。

2結果與分析

2.1油楠基因組DNA提取及質量檢測

采用硅膠干燥的老葉、嫩葉、樹皮韌皮部3種試驗材料。參照改良CTAB法提取DNA，結果見圖1（均為第一次提取）。由圖1可知，嫩葉效果最好，樹皮次之，老葉最差。由于天然林中油楠樹干高大通直，枝下高較大，采取葉片難度較大，因此采用樹皮提取DNA。鑒于樹皮第一次提取含較多雜質，通過二次提取以減少雜質，2次提取效果見圖2。

采用1.2%瓊脂糖檢測DNA質量，結果表明，DNA條帶清晰，質量較好，二次提取雜質較少。紫外分光光度計檢測DNA純度，OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0，麥明DNA中蛋白質、多糖等雜質污染較少，所提取DNA較純凈。表明用改良CTAB法二次提取的油楠DNA質量達到ISSRPCR對模板的要求。

2.2模板濃度對PCR的影響

DNA模板濃度是影響ISSRPCR反應體系的重要因素。DNA模板濃度過低會造成擴增不完整，而DNA模板濃度過高會導致非特異性條帶增多，條帶邊緣出現彌散現象，從而影響條帶的判讀[24-25]。通過對模板6個濃度梯度擴增結果的對比，發現模板濃度10～80 ng均能產生擴增，模板量為60～80 ng時，擴增條帶開始變得模糊，而模板量為10 ng時，擴增條帶較弱，同等擴增效果下，考慮到節省模板的原則，最終確定20 ng為DNA模板的最適用量。

2.3引物濃度對PCR的影響

引物濃度對ISSRPCR擴增結果有明顯影響，引物濃度過低，易導致模板與引物結合率低，影響擴增效率；而濃度過高則容易導致錯配及引物二聚體的出現[26]。由圖4可知，隨著引物濃度升高，擴增條帶逐漸增多且清晰，引物濃度為0.6 μmol/L時，擴增效果最佳；引物濃度為0.7～0.8 μmol/L時，擴增條帶有陰影，因此確定0.6 μmol/L為最佳引物濃度。

2.4dNTPs濃度對PCR的影響

dNTPs是ISSRPCR反應的原料，濃度過低，易造成PCR產率較低，條帶模糊；濃度過高，則會導致PCR錯配產生非特異性條帶[23-24，27]。由圖5可知，dNTPs為0.125～0.250 mmol/L時擴增條帶基本一致，dNTPs濃度為0.200 mmol/L時，條帶最為清晰；濃度大于0.200 mmol/L時，條帶出現模糊或減少的現象。因此，dNTPs最佳濃度選擇0.200 mmol/L。

2.5Mg2+濃度對PCR的影響Mg2+濃度是影響ISSRPCR的重要因素，它對整個PCR過程中Taq酶活性、退火溫度及特異性條帶的產生都有一定影響[28-29]。研究表明，Mg2+的最佳濃度在1.5～2.5 mmol/L[30-32]。由圖6可知，Mg2+濃度為1.25～2.50 mmol/L時均有擴增產物，濃度較低或較高時，擴增條帶缺失或模糊；Mg2+濃度為2.00 mmol/L時，擴增效果最好，帶型及亮度較好。因此，油楠ISSR反應體系中最佳Mg2+濃度為2.00 mmol/L。

2.6Taq酶濃度對PCR的影響

Taq酶是影響ISSRPCR的重要因素，濃度過低導致擴增產物較少，濃度過高則會造成假陽性擴增，即非特異性擴增[33-34]。由圖7可知，不同濃度擴增結果不盡相同，Taq酶用量為0.5～1.0 U時，條帶少且模糊，當Taq酶用量為1.5 U時，條帶清晰且擴增效率較高。因此，選擇Taq酶1.5 U為油楠ISSRPCR反應體系的最適用量。

43卷26期吳忠鋒等油楠基因組DNA提取·ISSR反應體系優化及引物篩選

2.7退火溫度對PCR的影響

引物退火溫度是影響PCR擴增的重要因素，退火溫度直接關系到引物與模板特異性結合程度以及擴增條帶的樣式，退火溫度過低會導致引物的非特異性結合，溫度過高則會影響引物與模板結合的穩定性[29]。由圖8可知，退火溫度過低時，非特異性條帶擴增明顯，而溫度過高時，特異性強，但會造成一些目的條帶的缺失。綜合考慮，選擇54 ℃為最佳退火溫度。

2.8ISSR引物的篩選

對100條隨機引物進行單模板初篩，選出能擴增出條帶的引物，在此基礎上，采用多模板復篩，選出多態性高、重復率好、特異性強的引物共13條，分別為U807、U808、U814、U825、U827、U841、U842、U860、U864、U880、U886、U888、U889。引物U808對部分油楠DNA的ISSR擴增圖譜見圖9，引物具體信息見表2。

3討論

DNA的提取質量是PCR成功與否的關鍵。目前，DNA提取材料一般選擇嫩葉[35-36]，野外采集葉樣時，由于林分中植株的枝下高較高，葉片采集難度大、成本高，將樹皮韌皮部作為試驗材料能很好地解決該問題。樹皮取樣一般多用于樹皮內含物測定[37]，以樹皮為試驗材料研究遺傳多樣性報道較少[38]，天然林取樣中尚未見報道。油楠類似于玩拗植物，植物組織內富含多糖及次生物質，DNA提取與純化難度較大。結合多種DNA提取方法，在提取液中加入β巰基乙醇、PVP以及高濃度NaCl提供的高鹽環境能有效減少酚類及多糖[39]，對試驗材料進行二次提取，可有效降低雜質含量，但會造成DNA的損耗，考慮到油楠組織內多糖及次生物質較多以及天然林中高大喬木采取嫩葉樣品較為困難，用樹皮作為DNA提取的試驗材料可為其他樹種天然居群遺傳多樣性研究提供新思路。

ISSR標記可有效揭示物種種群內和種群間遺傳多樣性差異，在分析其系統分化規律、遺傳結構、基因流動以及種源區劃上具有重要意義[40]。目前有關ISSRPCR反應體系優化方法的報道較多，包括單因素法[41-42]、正交試驗法[43]以及正交試驗設計與單因素分析相結合的方法[44]，單因素法能直觀快速得到最佳反應體系。此外，為保持該試驗結果的一致性，PCR基因擴增在同一臺PCR儀上進行。該研究對ISSRPCR各反應因子進行研究和篩選，建立了最佳反應體系，并篩選出13條ISSR引物，為進一步研究油楠遺傳多樣性及種質資源評價利用等方面提供重要參考依據。

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