LED燈在植物研究上的現(xiàn)狀和展望

摘要

[目的] 對油楠基因組DNA提取、ISSR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選進(jìn)行探討。[方法] 運(yùn)用改良CTAB法對油楠樹皮進(jìn)行基因組DNA提取， 利用單因素試驗(yàn)，對油楠ISSRPCR反應(yīng)各因素水平進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]運(yùn)用改良CTAB法對油楠樹皮進(jìn)行基因組DNA提取效果最佳；最優(yōu)體系：20 μl反應(yīng)體系中，模板用量20 ng，引物濃度0.6 μmol/L，dNTPs濃度0.2 mmol/L，Mg2+濃度2.0 mmol/L，Taq酶用量1.5 U，10倍反應(yīng)緩沖液2 μl，ddH2O補(bǔ)至20 μl；以該體系為基礎(chǔ)進(jìn)行引物篩選，在100條ISSR隨機(jī)引物中篩選出13條多態(tài)性較高、擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好的引物。[結(jié)論]該研究豐富了油楠遺傳學(xué)基本資料，為油楠遺傳多樣性研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞油楠；DNA提取；ISSRPCR；優(yōu)化

中圖分類號S166文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2015）26-013-04

Abstract [Objective] DNA extraction， optimization of ISSRPCR system and primers screening of Sindora glabra were investigated.[Method] Using the modified CTAB method for genonmic DNA extraction of Sindora glabra leather， using the method of single factor experiment， ISSR PCR reaction factors level was optimized. [Result]The results showed that：the extraction effect for genomic DNA of Sindora glabra bark was the best. The optimal reaction system in 20 μl reaction system was 20 ng DNA， 0.6 μmol/L ISSR primer， 0.2 mmol/L dNTPs， 2.0 mmol/L Mg2+， 1.5 U Taq DNA polymerase and 2 μl tenfold reaction buffer solution with ddH2O added to 20 μl of total solution； According to this reaction system， 13 primers in 100 primers were chosen for high polymorphism， their charity and repetition.[Conclusion] The study enriched genetics basic information of Sindora glabra ， laid the foundation for the research of genetic diversity.

Key words Sindora glabra； DNA extraction； ISSRPCR； Optimization

油楠（Sindora glabra Merr. ex de Wit）隸屬于蘇木科（Caesalpiniaceae）油楠屬（Sindora Miq.），是國家二級重點(diǎn)保護(hù)野生植物，也是國內(nèi)目前報(bào)道的樹體內(nèi)直接產(chǎn)生樹脂油的“柴油樹”，具有油用、藥用、觀賞和材用等用途[1-3]。因此，加強(qiáng)油楠基礎(chǔ)研究和促進(jìn)油楠資源開發(fā)利用勢在必行[4]。目前，研究多集中于植被分類、資源分布、生物學(xué)特性、產(chǎn)油特性和樹脂油理化特性分析等方面[1，5-11]，而對油楠遺傳多樣性等方面的研究鮮有涉及，在一定程度上限制了油楠的開發(fā)利用。由于長期過度利用，油楠野生資源已十分稀少，僅零星分布于海南，因此亟待開展油楠遺傳學(xué)基本資料的研究。

ISSR標(biāo)記是由Zietkiewicz等[12]提出的一種標(biāo)記技術(shù)，采用17～22堿基的重復(fù)錨定引物擴(kuò)增重復(fù)序列之間的片段。ISSR綜合了RAPD和SSR的優(yōu)點(diǎn)，又克服了RAPD標(biāo)記穩(wěn)定性和重復(fù)性差等缺點(diǎn)，具有操作簡單、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于品種鑒定[13-17]、指紋圖譜的構(gòu)建[18-19]。由于取樣距離和樣品保存方式的影響，加之油楠組織內(nèi)酚類及多糖物質(zhì)較多，影響油楠DNA的提取、ISSR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選，筆者旨在解決以上問題，豐富油楠遺傳學(xué)基本資料，為今后油楠后續(xù)研究奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)材料包括油楠單株的幼葉或樹干基部樹皮韌皮部樣品，采集于海南樂東、昌江、陵水和五指山四大油楠主要分布區(qū)，采樣單株相隔100 m以上。樣品采集后立即裝入密封袋并用硅膠速干法處理，帶回室內(nèi)貯藏于-20 ℃的冰箱中備用。

1.2主要儀器及試劑

PCR儀（BioRad PTC0200）、球磨儀（Retsch MOL.L1400）、真空離心濃縮儀（Eppendorf 5301）、電泳儀（BioRad PowerPac HV）、超低溫冰箱（Revco ULT1786）、超純水系統(tǒng)（MILLIPORE MilliQ）、制冰機(jī)（Scotman AF100）、超速冷凍離心機(jī)（Eppendorf 5801R）和其他相關(guān)儀器設(shè)備，以及DNA提取和ISSRPCR相關(guān)反應(yīng)試劑等。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1油楠總DNA的提取及DNA純度、濃度檢測。

在參照多種DNA提取和優(yōu)化方法[20-21]的基礎(chǔ)上，采用改良CTAB法[22]提取油楠葉和樹皮的DNA，其具體操作步驟：取50 mg樹皮干樣，加入2 ml離心管中，再放入3～5粒鋼珠，液氮冷凍后置于球磨儀上（注意兩邊平衡），頻率設(shè)置25，振蕩3 min；向樣品管中加入1 ml CTAB提取液，65 ℃恒溫水浴45 min左右，期間每隔10 min搖動一次；取出樣品管，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液；加入等體積氯仿/異戊醇（體積比24∶1），搖勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液，若上清液較黏稠，重復(fù)該步驟；向上清液中加入1/2體積5 mol/L NaCl，混勻；加入1/2體積預(yù)冷異丙醇，4 ℃保存，隔夜處理；12 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入75%乙醇和無水乙醇各洗一次，洗后用紙巾吸干，置于真空干燥儀干燥；加入1×TE溶解后，置于-20 ℃冰箱備用。

基因組DNA純度檢測：1×TAE電泳緩沖液、1.2%瓊脂糖凝膠電泳（0.1%Goldview染色），電壓120 V，時(shí)間45 min左右；電泳后，使用數(shù)碼相機(jī)在凝膠成像儀上拍照記錄，檢測基因組DNA的質(zhì)量。

DNA樣品濃度檢測：使用紫外分光光度計(jì)，測定樣品230、260、280 nm處的吸收值，計(jì)算其濃度，并稀釋成10 ng/μl。

1.3.2ISSRPCR反應(yīng)體系的構(gòu)建。

1.3.2.1ISSRPCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序的建立。

100條隨機(jī)ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的ISSR引物序列，由北京鼎國昌盛生物科技有限責(zé)任公司合成。反應(yīng)體系參照穆立薔等[23]：在20 μl的反應(yīng)體系中，Taq酶1.0 U，Mg2+ 2.0 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，引物0.4 μmol/L，10×Taq buffer 2 μl，模板DNA 30 ng。

ISSRPCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、50 ℃退火、72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃至恒溫。

1.3.2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。

PCR結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物6 μl加入2 μl溴酚藍(lán)混勻，1.8%瓊脂糖凝膠，于1×TAE電泳緩沖液（Goldview濃度0.1%）中電壓120 V，電泳1 h左右。Marker為D2000 ladder Marker。電泳結(jié)束后于WD9403F紫外儀下觀察并照相記錄。

1.3.2.3 ISSRPCR反應(yīng)體系的優(yōu)化。

為確定油楠基因組DNA最佳ISSR擴(kuò)增條件，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以U808為通用引物，反應(yīng)體系優(yōu)化主要采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，影響PCR反應(yīng)的6個主要因素：DNA模板、引物濃度、dNTPs濃度、Mg2+濃度、Taq酶濃度、退火溫度，逐個在6個水平上進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，建立油楠最佳ISSRPCR反應(yīng)體系。各成分優(yōu)化設(shè)計(jì)見表1。

2結(jié)果與分析

2.1油楠基因組DNA提取及質(zhì)量檢測

采用硅膠干燥的老葉、嫩葉、樹皮韌皮部3種試驗(yàn)材料。參照改良CTAB法提取DNA，結(jié)果見圖1（均為第一次提取）。由圖1可知，嫩葉效果最好，樹皮次之，老葉最差。由于天然林中油楠樹干高大通直，枝下高較大，采取葉片難度較大，因此采用樹皮提取DNA。鑒于樹皮第一次提取含較多雜質(zhì)，通過二次提取以減少雜質(zhì)，2次提取效果見圖2。

采用1.2%瓊脂糖檢測DNA質(zhì)量，結(jié)果表明，DNA條帶清晰，質(zhì)量較好，二次提取雜質(zhì)較少。紫外分光光度計(jì)檢測DNA純度，OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0，麥明DNA中蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)污染較少，所提取DNA較純凈。表明用改良CTAB法二次提取的油楠DNA質(zhì)量達(dá)到ISSRPCR對模板的要求。

2.2模板濃度對PCR的影響

DNA模板濃度是影響ISSRPCR反應(yīng)體系的重要因素。DNA模板濃度過低會造成擴(kuò)增不完整，而DNA模板濃度過高會導(dǎo)致非特異性條帶增多，條帶邊緣出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，從而影響條帶的判讀[24-25]。通過對模板6個濃度梯度擴(kuò)增結(jié)果的對比，發(fā)現(xiàn)模板濃度10～80 ng均能產(chǎn)生擴(kuò)增，模板量為60～80 ng時(shí)，擴(kuò)增條帶開始變得模糊，而模板量為10 ng時(shí)，擴(kuò)增條帶較弱，同等擴(kuò)增效果下，考慮到節(jié)省模板的原則，最終確定20 ng為DNA模板的最適用量。

2.3引物濃度對PCR的影響

引物濃度對ISSRPCR擴(kuò)增結(jié)果有明顯影響，引物濃度過低，易導(dǎo)致模板與引物結(jié)合率低，影響擴(kuò)增效率；而濃度過高則容易導(dǎo)致錯配及引物二聚體的出現(xiàn)[26]。由圖4可知，隨著引物濃度升高，擴(kuò)增條帶逐漸增多且清晰，引物濃度為0.6 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增效果最佳；引物濃度為0.7～0.8 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶有陰影，因此確定0.6 μmol/L為最佳引物濃度。

2.4dNTPs濃度對PCR的影響

dNTPs是ISSRPCR反應(yīng)的原料，濃度過低，易造成PCR產(chǎn)率較低，條帶模糊；濃度過高，則會導(dǎo)致PCR錯配產(chǎn)生非特異性條帶[23-24，27]。由圖5可知，dNTPs為0.125～0.250 mmol/L時(shí)擴(kuò)增條帶基本一致，dNTPs濃度為0.200 mmol/L時(shí)，條帶最為清晰；濃度大于0.200 mmol/L時(shí)，條帶出現(xiàn)模糊或減少的現(xiàn)象。因此，dNTPs最佳濃度選擇0.200 mmol/L。

2.5Mg2+濃度對PCR的影響Mg2+濃度是影響ISSRPCR的重要因素，它對整個PCR過程中Taq酶活性、退火溫度及特異性條帶的產(chǎn)生都有一定影響[28-29]。研究表明，Mg2+的最佳濃度在1.5～2.5 mmol/L[30-32]。由圖6可知，Mg2+濃度為1.25～2.50 mmol/L時(shí)均有擴(kuò)增產(chǎn)物，濃度較低或較高時(shí)，擴(kuò)增條帶缺失或模糊；Mg2+濃度為2.00 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增效果最好，帶型及亮度較好。因此，油楠ISSR反應(yīng)體系中最佳Mg2+濃度為2.00 mmol/L。

2.6Taq酶濃度對PCR的影響

Taq酶是影響ISSRPCR的重要因素，濃度過低導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物較少，濃度過高則會造成假陽性擴(kuò)增，即非特異性擴(kuò)增[33-34]。由圖7可知，不同濃度擴(kuò)增結(jié)果不盡相同，Taq酶用量為0.5～1.0 U時(shí)，條帶少且模糊，當(dāng)Taq酶用量為1.5 U時(shí)，條帶清晰且擴(kuò)增效率較高。因此，選擇Taq酶1.5 U為油楠ISSRPCR反應(yīng)體系的最適用量。

43卷26期吳忠鋒等油楠基因組DNA提取·ISSR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選

2.7退火溫度對PCR的影響

引物退火溫度是影響PCR擴(kuò)增的重要因素，退火溫度直接關(guān)系到引物與模板特異性結(jié)合程度以及擴(kuò)增條帶的樣式，退火溫度過低會導(dǎo)致引物的非特異性結(jié)合，溫度過高則會影響引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定性[29]。由圖8可知，退火溫度過低時(shí)，非特異性條帶擴(kuò)增明顯，而溫度過高時(shí)，特異性強(qiáng)，但會造成一些目的條帶的缺失。綜合考慮，選擇54 ℃為最佳退火溫度。

2.8ISSR引物的篩選

對100條隨機(jī)引物進(jìn)行單模板初篩，選出能擴(kuò)增出條帶的引物，在此基礎(chǔ)上，采用多模板復(fù)篩，選出多態(tài)性高、重復(fù)率好、特異性強(qiáng)的引物共13條，分別為U807、U808、U814、U825、U827、U841、U842、U860、U864、U880、U886、U888、U889。引物U808對部分油楠DNA的ISSR擴(kuò)增圖譜見圖9，引物具體信息見表2。

3討論

DNA的提取質(zhì)量是PCR成功與否的關(guān)鍵。目前，DNA提取材料一般選擇嫩葉[35-36]，野外采集葉樣時(shí)，由于林分中植株的枝下高較高，葉片采集難度大、成本高，將樹皮韌皮部作為試驗(yàn)材料能很好地解決該問題。樹皮取樣一般多用于樹皮內(nèi)含物測定[37]，以樹皮為試驗(yàn)材料研究遺傳多樣性報(bào)道較少[38]，天然林取樣中尚未見報(bào)道。油楠類似于玩拗植物，植物組織內(nèi)富含多糖及次生物質(zhì)，DNA提取與純化難度較大。結(jié)合多種DNA提取方法，在提取液中加入β巰基乙醇、PVP以及高濃度NaCl提供的高鹽環(huán)境能有效減少酚類及多糖[39]，對試驗(yàn)材料進(jìn)行二次提取，可有效降低雜質(zhì)含量，但會造成DNA的損耗，考慮到油楠組織內(nèi)多糖及次生物質(zhì)較多以及天然林中高大喬木采取嫩葉樣品較為困難，用樹皮作為DNA提取的試驗(yàn)材料可為其他樹種天然居群遺傳多樣性研究提供新思路。

ISSR標(biāo)記可有效揭示物種種群內(nèi)和種群間遺傳多樣性差異，在分析其系統(tǒng)分化規(guī)律、遺傳結(jié)構(gòu)、基因流動以及種源區(qū)劃上具有重要意義[40]。目前有關(guān)ISSRPCR反應(yīng)體系優(yōu)化方法的報(bào)道較多，包括單因素法[41-42]、正交試驗(yàn)法[43]以及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與單因素分析相結(jié)合的方法[44]，單因素法能直觀快速得到最佳反應(yīng)體系。此外，為保持該試驗(yàn)結(jié)果的一致性，PCR基因擴(kuò)增在同一臺PCR儀上進(jìn)行。該研究對ISSRPCR各反應(yīng)因子進(jìn)行研究和篩選，建立了最佳反應(yīng)體系，并篩選出13條ISSR引物，為進(jìn)一步研究油楠遺傳多樣性及種質(zhì)資源評價(jià)利用等方面提供重要參考依據(jù)。

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