盾葉薯蕷品種的ISSR指紋圖譜研究

摘要[目的]利用ISSR分子標記構建盾葉薯蕷品種鑒定的DNA指紋圖譜，為盾葉薯蕷藥材鑒定和良種選育提供技術支持。[方法]篩選ISSR引物，對10個盾葉薯蕷品種進行PCR擴增和電泳檢測，統計條帶并進行遺傳多樣性分析、聚類分析等；選擇核心引物，建立DNA指紋圖譜鑒定體系。[結果]從50條ISSR引物中篩選出9條，對10個品種擴增共得到86條譜帶，多態性條帶72條，多態性條帶比率為83.72%；選出3條ISSR核心引物建立了10個薯蕷品種的ISSR指紋鑒定圖譜。[結論]盾葉薯蕷品種遺傳多樣性豐富；3條核心引物所構建的植物圖譜中，每個品種均有各自特異的共有譜帶、特有譜帶、缺失譜帶，這些譜帶的組合可用于盾葉薯蕷品種鑒定。

關鍵詞盾葉薯蕷；ISSR；品種鑒定；ISSR指紋圖譜

中圖分類號S567文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）26-024-03

Abstract[Objective] With the aim to identify Dioscorea zingiberensis varieties， ISSR molecular markers was used to get its DNA fingerprint. [Method] ISSR primers were screened out， the PCR and polyacrylamide gel electrophoresis were carried out for the 10 D. zingiberensis. varieties， genetic diversity analyses and cluster analyses were performed， and the core primers were selected to set up an identified fingerprint system. [Result] 9 primers with clear band and high polymorphism were selected from 50. A total of 86 bands were amplified from 10 D. zingiberensis varieties， 72 bands among them were polymorphic， the percentage of polymorphism band （PPB） was 83.72%. Three core primers were select out to set up fingerprint of 10 D. zingiberensis Varieties. [Conclusion] The genetic diversity of D. zingiberens varieties was abundant. Each of 10 variety has its universal bands and specific bands， these unique bands can be used in the identification of the D. zingiberensis varieties.

Key wordsDioscorea zingiberensis C. H. Wright； ISSR； Variety identification； ISSR fingerprint

盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis C.H.Wright），又名黃姜，為薯蕷科（Dioscoreaceae）薯蕷屬（Dioscorea）多年生藤本植物[1]。其塊狀根中所含的薯蕷皂苷元是合成避孕藥、甾體激素類藥物的重要起始原料，也是生產皮質激素、性激素和蛋白同化激素類藥物的重要原料，被稱之為激素之母[2-3]。因此，盾葉薯蕷是一種重要的藥用植物資源。

我國盾葉薯蕷資源豐富，主要分布于長江流域各省區，在陜西、河南、湖北、四川和重慶等地作為經濟作物廣泛栽培[4]。然而，不同地域的盾葉薯蕷種質因受當地氣候、土壤等因素影響，其薯蕷皂苷的含量有明顯差異。為了篩選出優良的盾葉薯蕷品種以利于種植和薯蕷皂素的生產與加工，有必要對不同產地的盾葉薯蕷種質進行精準的鑒定。

簡單重復序列間隔區（intersimple sequence repeat，ISSR）是1994年由加拿大蒙特利爾大學[5]發展起來的一種基于微衛星序列的分子標記技術。該標記以顯性或共顯性的孟德爾方式遺傳，事先不需知道靶序列，由于具有更長的引物序列和較高的退火溫度，因此產生可靠性高、重復性好的擴增條帶，而且模板需要量少，多態性豐富，試驗操作相對簡單，無需試劑盒，結果記錄方便[6-7]。因此，ISSR被認為是研究種群遺傳多樣性一種非常有效的分子標記手段，已被廣泛應用于品種和種質鑒定、遺傳圖譜構建、物種和種群的親緣關系分析等方面的研究[8-9]。

筆者以陜西省南部秦嶺巴山地區的盾葉薯蕷種質為材料，應用ISSR分子標記引物檢測各盾葉薯蕷種質資源的DNA多態性，構建適合盾葉薯蕷種質資源鑒定的DNA指紋圖譜，以期為該地區盾葉薯蕷資源的評價篩選和分子鑒定提供重要的理論和技術支撐，為盾葉薯蕷產業的持續發展奠定良好的基礎。

1材料與方法

1.1材料

10個盾葉薯蕷種質材料采自陜西南部的秦嶺、巴山地區（表1）。野外采集植物幼嫩葉片，放入密封袋內用硅膠干燥，帶回實驗室后置于-20 ℃的冰箱內保存備用。

1.2方法

1.2.1DNA的提取與檢測。

采用改良的2×CTAB法提取植物的基因組DNA[10]。應用微量核酸蛋白檢測儀檢測其純度。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整度。

1.2.2引物篩選與PCR擴增。

選用2個純度高、完整性好盾葉薯蕷DNA為模板，對50條ISSR引物（UBC801～UBC850，由不列顛哥倫比亞大學設計，上海生工合成）進行PCR擴增，以篩選出條帶穩定的ISSR引物。PCR反應體系20 μl，包括50 ng模板DNA，1.0 μmol/L引物，1 U Taq聚合酶，0.4 mmol/L dNTP，2.5 mmol/L Mg2+。PCR反應程序：94 ℃預變性 2 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸7 min，最后在4 ℃保存。PCR產物用2%的瓊脂凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為1.0 TBE，電壓為4 V/cm。

從上述50條ISSR引物中篩選出9條擴增條帶穩定清晰的ISSR引物，并對這9條引物的溫度進行梯度試驗，以確定其最適退火溫度。然后，在最適退火溫度下用上述9條ISSR引物對10個薯蕷種質資源樣本進行PCR擴增和瓊脂糖電泳檢測。

1.3數據處理與分析

ISSR以擴增條帶在相對遷移位置上的“有（顯性）”或“無（隱性）”，分別賦以“1”或“0”，獲得0、1二元數據矩陣。利用POPGENE Version 1.32軟件分析盾葉薯蕷品種的多態位點比率（PPL），估算各種質間的Nei’s遺傳距離（GD），并用MEGA5軟件基于Nei’s遺傳距離矩陣，采用UPGMA法進行聚類分析構建這10個盾葉薯蕷種質資源的聚類圖。統計各引物的多態性位點比例；選擇多態性最高的3條引物構建能用于鑒定這10個種質資源的DNA鑒定體系。

2結果與分析

2.1薯蕷種質資源DNA的提取效果及ISSR引物篩選

用改良的2×CTAB法提取盾葉薯蕷各種質資源基因組DNA的純度良好，分光光度檢驗所得OD260/280為1.77±0.18；提取的DNA完整度也很好，瓊脂糖電泳檢測出的大片段明顯（圖1），能用于ISSR引物的PCR擴增。

2.210個盾葉薯蕷品種的遺傳多樣性與遺傳關系

用篩選出來的9條ISSR引物，對10份盾葉薯蕷種質樣本進行PCR擴增和瓊脂糖電泳檢測。引物UBC825對10個樣品的擴增效果見圖2。經條帶統計和遺傳多樣性分析，結果表明，9條引物共擴增出86條清晰可辨的條帶，其中多態性位點72條，多態性條帶比例為83.72%。基于遺傳相似度進行聚類分析得到10個品種的UPGMA聚類樹（圖3）。結果表明，10個盾葉薯蕷品種聚為3個大支，其中采自巴山西段的3個品種（NQ，NZ，CG）地理位置較近，聚為一支；采自巴山中段的2個品種（XX和ZB）聚在一起成為一支；其他幾個品種均采自秦嶺地區，聚成另一支。從各品種的聚類關系可以看出，地理距離較近的品種首先聚在一起，表現出較近的親緣關系。

2.310個盾葉薯蕷的DNA指紋鑒定圖譜

篩選出9條ISSR引物對10個盾葉薯蕷品種進行檢測分析，發現其中的3條引物UBC811、UBC8189和UBC825擴增效果好，不但條帶穩定清晰，而且多態性高。這3條引物共擴增出30條譜帶，每個品種在這3條引物上都有特征條帶，這30條條帶的組合可有效區分所有薯蕷DNA樣品，可以作為DNA鑒定指紋圖譜用于這10個品種的鑒定（表1）。

3討論

由于選用品種以及生長環境的不同，不同區域盾葉薯蕷品種的質量存在顯著差異。盾葉薯蕷品種在形態特征上極為相似，農業生產上還有誤栽培薯蕷屬其他植物充作盾葉薯蕷的情況，因此栽培品種混亂，不利于產業的長期發展。傳統的形態學鑒定方法主要是根據地下莖的性狀、種子在蒴果上的著生位置等性狀來區別盾葉薯蕷和薯蕷屬其他植物，而種內品種間的形態差別更為細微，因此基于傳統方法對盾葉薯蕷品種進行鑒定難度非常大。一個好的指紋圖譜應該具有簡單、高效、準確等特點。利用分子標記技術進行品種鑒定可以不受環境影響，從遺傳物質水平上直接反映品種間的差異，為品種鑒定提供了操作性強、準確性高的方法[7]。

該研究從50對ISSR引物中篩選出10條（表2）條帶穩定、多態性高的引物對10個盾葉薯蕷品種進行了遺傳分析，結果表明，盾葉薯蕷品種遺傳變異豐富（PPB=0.837 2）。薯蕷為單子葉植物較為進化的類群，該研究所用的10個品種均為當地野生品種馴化而來，雖然有一段時間的栽培歷史，仍然保持較高遺傳多樣性，未發現種質退化。另外，該研究結果表明10個品種大致聚為三大支，地理距離較近的品種首先聚在一起。這說明該物種的遺傳分化與其地理隔離有關，地理隔離造成了基因流限制，進而造成不同群體的遺傳漂變和遺傳分化，這是其現今遺傳結構的重要形成原因。

ISSR分子標記技術以顯性或共顯性的孟德爾方式遺

傳，由于較高的退火溫度和更長的引物序列，可以產生較可靠和重復性好的擴增帶[6]。該研究篩選出來的9條ISSR引物共擴增出86條條帶，其中72條為多態性條帶，且條帶的穩定性、可重復性高，這些ISSR引物不僅能用于盾葉薯蕷品種的鑒定，如有必要亦可用于該物種的群體遺傳分析。

為了簡單快捷地將不同盾葉薯蕷品種分開，從這10條引物中選出3條擴增穩定、重復性好、條帶清楚、個體間差異大的引物（USB811、USB818和USB825）作為核心引物建立了這10個品種的鑒定圖譜。這3條引物所擴增的30個條帶中，每個品種均有各自特異的共有譜帶、特有譜帶、缺失譜帶（表1），經多次PCR擴增和電泳檢測驗證，可用于盾葉薯蕷品種的DNA指紋鑒定。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：250-251.

[2] 丁志遵，唐世蓉，秦慧貞，等.甾體激素藥源植物[M].北京：科學出版社，1983.

[3] 國家中醫藥管理局《中華本草》編輯委員會.中華本草[M].上海：上海科學技術出版社，1998.

[4] 任建偉，白云，郭秋月，等.盾葉薯蕷培養細胞的生長及薯蕷皂甙元產生的變化規律[J].中草藥，1994，25（2）： 93-94.

[5] ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A，LABUDA D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat（ISSR）anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics，1994，20：176-183.

[6] 鄒喻蘋，葛頌，王曉東，等.系統與進化植物學中的分子標記[M].北京：科學出版社，2001.

[7] 汪小全，鄒喻蘋，張大明，等.RAPD應用于遺傳多樣性和系統學研究中的問題[J].植物學報，1996，38（12）：954-962.

[8] 劉本英，孫雪梅，李友勇，等.20個云南無性系茶樹良種的DNA指紋圖譜構建[J].熱帶作物學報，2011，32（4）：720-727.

[9] 朱巖芳，祝水金，李永平，等.ISSR分子標記技術在植物種質資源研究中的應用[J].種子，2010，29（2）：1-2.

[10] 吳凱旋，屈亞娟，楊培君，等.獨尾草DNA提取方法優化及ISSR反應體系的建立[J].陜西農業科學，2012（6）：111-115.