盾葉薯蕷品種的ISSR指紋圖譜研究

摘要[目的]利用ISSR分子標(biāo)記構(gòu)建盾葉薯蕷品種鑒定的DNA指紋圖譜，為盾葉薯蕷藥材鑒定和良種選育提供技術(shù)支持。[方法]篩選ISSR引物，對(duì)10個(gè)盾葉薯蕷品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測，統(tǒng)計(jì)條帶并進(jìn)行遺傳多樣性分析、聚類分析等；選擇核心引物，建立DNA指紋圖譜鑒定體系。[結(jié)果]從50條ISSR引物中篩選出9條，對(duì)10個(gè)品種擴(kuò)增共得到86條譜帶，多態(tài)性條帶72條，多態(tài)性條帶比率為83.72%；選出3條ISSR核心引物建立了10個(gè)薯蕷品種的ISSR指紋鑒定圖譜。[結(jié)論]盾葉薯蕷品種遺傳多樣性豐富；3條核心引物所構(gòu)建的植物圖譜中，每個(gè)品種均有各自特異的共有譜帶、特有譜帶、缺失譜帶，這些譜帶的組合可用于盾葉薯蕷品種鑒定。

關(guān)鍵詞盾葉薯蕷；ISSR；品種鑒定；ISSR指紋圖譜

中圖分類號(hào)S567文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）26-024-03

Abstract[Objective] With the aim to identify Dioscorea zingiberensis varieties， ISSR molecular markers was used to get its DNA fingerprint. [Method] ISSR primers were screened out， the PCR and polyacrylamide gel electrophoresis were carried out for the 10 D. zingiberensis. varieties， genetic diversity analyses and cluster analyses were performed， and the core primers were selected to set up an identified fingerprint system. [Result] 9 primers with clear band and high polymorphism were selected from 50. A total of 86 bands were amplified from 10 D. zingiberensis varieties， 72 bands among them were polymorphic， the percentage of polymorphism band （PPB） was 83.72%. Three core primers were select out to set up fingerprint of 10 D. zingiberensis Varieties. [Conclusion] The genetic diversity of D. zingiberens varieties was abundant. Each of 10 variety has its universal bands and specific bands， these unique bands can be used in the identification of the D. zingiberensis varieties.

Key wordsDioscorea zingiberensis C. H. Wright； ISSR； Variety identification； ISSR fingerprint

盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis C.H.Wright），又名黃姜，為薯蕷科（Dioscoreaceae）薯蕷屬（Dioscorea）多年生藤本植物[1]。其塊狀根中所含的薯蕷皂苷元是合成避孕藥、甾體激素類藥物的重要起始原料，也是生產(chǎn)皮質(zhì)激素、性激素和蛋白同化激素類藥物的重要原料，被稱之為激素之母[2-3]。因此，盾葉薯蕷是一種重要的藥用植物資源。

我國盾葉薯蕷資源豐富，主要分布于長江流域各省區(qū)，在陜西、河南、湖北、四川和重慶等地作為經(jīng)濟(jì)作物廣泛栽培[4]。然而，不同地域的盾葉薯蕷種質(zhì)因受當(dāng)?shù)貧夂颉⑼寥赖纫蛩赜绊懀涫硎氃碥盏暮坑忻黠@差異。為了篩選出優(yōu)良的盾葉薯蕷品種以利于種植和薯蕷皂素的生產(chǎn)與加工，有必要對(duì)不同產(chǎn)地的盾葉薯蕷種質(zhì)進(jìn)行精準(zhǔn)的鑒定。

簡單重復(fù)序列間隔區(qū)（intersimple sequence repeat，ISSR）是1994年由加拿大蒙特利爾大學(xué)[5]發(fā)展起來的一種基于微衛(wèi)星序列的分子標(biāo)記技術(shù)。該標(biāo)記以顯性或共顯性的孟德爾方式遺傳，事先不需知道靶序列，由于具有更長的引物序列和較高的退火溫度，因此產(chǎn)生可靠性高、重復(fù)性好的擴(kuò)增條帶，而且模板需要量少，多態(tài)性豐富，試驗(yàn)操作相對(duì)簡單，無需試劑盒，結(jié)果記錄方便[6-7]。因此，ISSR被認(rèn)為是研究種群遺傳多樣性一種非常有效的分子標(biāo)記手段，已被廣泛應(yīng)用于品種和種質(zhì)鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、物種和種群的親緣關(guān)系分析等方面的研究[8-9]。

筆者以陜西省南部秦嶺巴山地區(qū)的盾葉薯蕷種質(zhì)為材料，應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記引物檢測各盾葉薯蕷種質(zhì)資源的DNA多態(tài)性，構(gòu)建適合盾葉薯蕷種質(zhì)資源鑒定的DNA指紋圖譜，以期為該地區(qū)盾葉薯蕷資源的評(píng)價(jià)篩選和分子鑒定提供重要的理論和技術(shù)支撐，為盾葉薯蕷產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展奠定良好的基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

10個(gè)盾葉薯蕷種質(zhì)材料采自陜西南部的秦嶺、巴山地區(qū)（表1）。野外采集植物幼嫩葉片，放入密封袋內(nèi)用硅膠干燥，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于-20 ℃的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1DNA的提取與檢測。

采用改良的2×CTAB法提取植物的基因組DNA[10]。應(yīng)用微量核酸蛋白檢測儀檢測其純度。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整度。

1.2.2引物篩選與PCR擴(kuò)增。

選用2個(gè)純度高、完整性好盾葉薯蕷DNA為模板，對(duì)50條ISSR引物（UBC801～UBC850，由不列顛哥倫比亞大學(xué)設(shè)計(jì)，上海生工合成）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以篩選出條帶穩(wěn)定的ISSR引物。PCR反應(yīng)體系20 μl，包括50 ng模板DNA，1.0 μmol/L引物，1 U Taq聚合酶，0.4 mmol/L dNTP，2.5 mmol/L Mg2+。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 2 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，最后在4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為1.0 TBE，電壓為4 V/cm。

從上述50條ISSR引物中篩選出9條擴(kuò)增條帶穩(wěn)定清晰的ISSR引物，并對(duì)這9條引物的溫度進(jìn)行梯度試驗(yàn)，以確定其最適退火溫度。然后，在最適退火溫度下用上述9條ISSR引物對(duì)10個(gè)薯蕷種質(zhì)資源樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖電泳檢測。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

ISSR以擴(kuò)增條帶在相對(duì)遷移位置上的“有（顯性）”或“無（隱性）”，分別賦以“1”或“0”，獲得0、1二元數(shù)據(jù)矩陣。利用POPGENE Version 1.32軟件分析盾葉薯蕷品種的多態(tài)位點(diǎn)比率（PPL），估算各種質(zhì)間的Nei’s遺傳距離（GD），并用MEGA5軟件基于Nei’s遺傳距離矩陣，采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析構(gòu)建這10個(gè)盾葉薯蕷種質(zhì)資源的聚類圖。統(tǒng)計(jì)各引物的多態(tài)性位點(diǎn)比例；選擇多態(tài)性最高的3條引物構(gòu)建能用于鑒定這10個(gè)種質(zhì)資源的DNA鑒定體系。

2結(jié)果與分析

2.1薯蕷種質(zhì)資源DNA的提取效果及ISSR引物篩選

用改良的2×CTAB法提取盾葉薯蕷各種質(zhì)資源基因組DNA的純度良好，分光光度檢驗(yàn)所得OD260/280為1.77±0.18；提取的DNA完整度也很好，瓊脂糖電泳檢測出的大片段明顯（圖1），能用于ISSR引物的PCR擴(kuò)增。

2.210個(gè)盾葉薯蕷品種的遺傳多樣性與遺傳關(guān)系

用篩選出來的9條ISSR引物，對(duì)10份盾葉薯蕷種質(zhì)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖電泳檢測。引物UBC825對(duì)10個(gè)樣品的擴(kuò)增效果見圖2。經(jīng)條帶統(tǒng)計(jì)和遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，9條引物共擴(kuò)增出86條清晰可辨的條帶，其中多態(tài)性位點(diǎn)72條，多態(tài)性條帶比例為83.72%。基于遺傳相似度進(jìn)行聚類分析得到10個(gè)品種的UPGMA聚類樹（圖3）。結(jié)果表明，10個(gè)盾葉薯蕷品種聚為3個(gè)大支，其中采自巴山西段的3個(gè)品種（NQ，NZ，CG）地理位置較近，聚為一支；采自巴山中段的2個(gè)品種（XX和ZB）聚在一起成為一支；其他幾個(gè)品種均采自秦嶺地區(qū)，聚成另一支。從各品種的聚類關(guān)系可以看出，地理距離較近的品種首先聚在一起，表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。

2.310個(gè)盾葉薯蕷的DNA指紋鑒定圖譜

篩選出9條ISSR引物對(duì)10個(gè)盾葉薯蕷品種進(jìn)行檢測分析，發(fā)現(xiàn)其中的3條引物UBC811、UBC8189和UBC825擴(kuò)增效果好，不但條帶穩(wěn)定清晰，而且多態(tài)性高。這3條引物共擴(kuò)增出30條譜帶，每個(gè)品種在這3條引物上都有特征條帶，這30條條帶的組合可有效區(qū)分所有薯蕷DNA樣品，可以作為DNA鑒定指紋圖譜用于這10個(gè)品種的鑒定（表1）。

3討論

由于選用品種以及生長環(huán)境的不同，不同區(qū)域盾葉薯蕷品種的質(zhì)量存在顯著差異。盾葉薯蕷品種在形態(tài)特征上極為相似，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上還有誤栽培薯蕷屬其他植物充作盾葉薯蕷的情況，因此栽培品種混亂，不利于產(chǎn)業(yè)的長期發(fā)展。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法主要是根據(jù)地下莖的性狀、種子在蒴果上的著生位置等性狀來區(qū)別盾葉薯蕷和薯蕷屬其他植物，而種內(nèi)品種間的形態(tài)差別更為細(xì)微，因此基于傳統(tǒng)方法對(duì)盾葉薯蕷品種進(jìn)行鑒定難度非常大。一個(gè)好的指紋圖譜應(yīng)該具有簡單、高效、準(zhǔn)確等特點(diǎn)。利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行品種鑒定可以不受環(huán)境影響，從遺傳物質(zhì)水平上直接反映品種間的差異，為品種鑒定提供了操作性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高的方法[7]。

該研究從50對(duì)ISSR引物中篩選出10條（表2）條帶穩(wěn)定、多態(tài)性高的引物對(duì)10個(gè)盾葉薯蕷品種進(jìn)行了遺傳分析，結(jié)果表明，盾葉薯蕷品種遺傳變異豐富（PPB=0.837 2）。薯蕷為單子葉植物較為進(jìn)化的類群，該研究所用的10個(gè)品種均為當(dāng)?shù)匾吧贩N馴化而來，雖然有一段時(shí)間的栽培歷史，仍然保持較高遺傳多樣性，未發(fā)現(xiàn)種質(zhì)退化。另外，該研究結(jié)果表明10個(gè)品種大致聚為三大支，地理距離較近的品種首先聚在一起。這說明該物種的遺傳分化與其地理隔離有關(guān)，地理隔離造成了基因流限制，進(jìn)而造成不同群體的遺傳漂變和遺傳分化，這是其現(xiàn)今遺傳結(jié)構(gòu)的重要形成原因。

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)以顯性或共顯性的孟德爾方式遺

傳，由于較高的退火溫度和更長的引物序列，可以產(chǎn)生較可靠和重復(fù)性好的擴(kuò)增帶[6]。該研究篩選出來的9條ISSR引物共擴(kuò)增出86條條帶，其中72條為多態(tài)性條帶，且條帶的穩(wěn)定性、可重復(fù)性高，這些ISSR引物不僅能用于盾葉薯蕷品種的鑒定，如有必要亦可用于該物種的群體遺傳分析。

為了簡單快捷地將不同盾葉薯蕷品種分開，從這10條引物中選出3條擴(kuò)增穩(wěn)定、重復(fù)性好、條帶清楚、個(gè)體間差異大的引物（USB811、USB818和USB825）作為核心引物建立了這10個(gè)品種的鑒定圖譜。這3條引物所擴(kuò)增的30個(gè)條帶中，每個(gè)品種均有各自特異的共有譜帶、特有譜帶、缺失譜帶（表1），經(jīng)多次PCR擴(kuò)增和電泳檢測驗(yàn)證，可用于盾葉薯蕷品種的DNA指紋鑒定。

參考文獻(xiàn)

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：250-251.

[2] 丁志遵，唐世蓉，秦慧貞，等.甾體激素藥源植物[M].北京：科學(xué)出版社，1983.

[3] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編輯委員會(huì).中華本草[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1998.

[4] 任建偉，白云，郭秋月，等.盾葉薯蕷培養(yǎng)細(xì)胞的生長及薯蕷皂甙元產(chǎn)生的變化規(guī)律[J].中草藥，1994，25（2）： 93-94.

[5] ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A，LABUDA D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat（ISSR）anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics，1994，20：176-183.

[6] 鄒喻蘋，葛頌，王曉東，等.系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)中的分子標(biāo)記[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[7] 汪小全，鄒喻蘋，張大明，等.RAPD應(yīng)用于遺傳多樣性和系統(tǒng)學(xué)研究中的問題[J].植物學(xué)報(bào)，1996，38（12）：954-962.

[8] 劉本英，孫雪梅，李友勇，等.20個(gè)云南無性系茶樹良種的DNA指紋圖譜構(gòu)建[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2011，32（4）：720-727.

[9] 朱巖芳，祝水金，李永平，等.ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在植物種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用[J].種子，2010，29（2）：1-2.

[10] 吳凱旋，屈亞娟，楊培君，等.獨(dú)尾草DNA提取方法優(yōu)化及ISSR反應(yīng)體系的建立[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（6）：111-115.