海洋生物源抗高血壓肽的制備和構效關系研究進展

摘要高血壓已成為全球最常見的心血管疾病，其中腎素-血管緊張素-醛固酮系統（reninangiotensinaldosterone system，RAAS）發揮著重要的血壓調節作用，血管緊張素轉化酶（angiotensinconverting enzyme，ACE）催化血管緊張素Ⅰ轉化為血管緊張素Ⅱ，并使緩激肽失活，因此，其抑制劑成為抗高血壓藥物研究的靶點。許多研究表明小肽具有ACE活性抑制作用，存在調控高血壓的潛力。海洋生物種類豐富，具有潛在的生物活性肽的開發價值。對來自海洋生物的抗高血壓生物活性肽的生產和構效關系（StructureActivity Relationship，SAR）的研究現狀進行綜述。

關鍵詞海洋生物；ACE抑制肽；降血壓；制備；構效關系

中圖分類號S986.2文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）26-336-07

AbstractHypertension has become one of the most common cardiovascular disease， in which reninangiotensin aldosterone system（RAAS） plays an important role in regulating blood pressure. Thus， angiotensin converting enzyme （AngiotensinConverting Enzyme，ACE） inhibitors becomes the target of antihypertensive drugs. At present， many studies showed that some proteinderived peptides have ACE inhibition activity， which is the potential for regulating high blood pressure. Marine organism is rich in species and has the potential of developing bioactive peptides. In this paper， the preparation and the structureactivity relationship （SAR） of the antihypertensive bioactive peptides from Marine organisms were reviewed.

Key words Marinederived；Antihypertensive peptide； Lower blood pressure； Preparation；QSAR

根據2011年頒布的《中國高血壓防治指南》，當年我國18歲以上人群高血壓患病率約為20%，預測高血壓患者約2 億人，估計每年新增高血壓患者1 000萬人且呈年輕化趨勢。高血壓常引起心、腦、腎等臟器的并發癥，嚴重威脅和危害著人類健康。全球每年有超過1 700萬的人死于心血管疾病，其中由高血壓并發癥導致的死亡多達940萬[1]，高血壓成了名副其實的“沉默殺手”。目前，高血壓的調控主要依賴于藥物治療和飲食控制。但是，抗高血壓藥物常引起頭痛、眩暈、干咳和瘙癢等副作用。因此，利用天然食物資源分離抗高血壓功能組分，開發調控高血壓功能食品成為研究熱點。

腎素-血管緊張素系統（reninangiotensin system，RAS）或腎素-血管緊張素-醛固酮系統（reninangiotensinaldosterone system，RAAS）在協調哺乳動物體內的血壓與體液平衡中起著重要作用。其中血管緊張素轉換酶（angiotensinconverting enzyme，ACE）是一個羧基二肽酶，可以催化無生物活性的血管緊張素Ⅰ（Ang Ⅰ）生成具有促進血壓升高作用的血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）和鈍化擴張血管的舒緩激1肽（bradykinin），在調節機體血壓中發揮著重要作用。因此，抑制ACE酶作用已經成為抗高血壓功能組分開發的靶標。

越來越多的研究表明，在一些蛋白前體中潛藏著某些具有特殊生物活性的肽段，人們稱之為生物活性肽（bioactive peptides）或者功能肽（functional peptides）。自從首次在蛇毒中發現具有抑制血管緊縮素轉換酶的活性小肽以來，大量的研究業已證明很多源自食物蛋白的生物活性肽具有抗高血壓作用。同時，研究發現小肽可以更好地被人體吸收和利用，改變了傳統的蛋白質只能被降解成氨基酸才能被吸收利用的觀點[2]。因此，抗高血壓生物活性小肽的制備和活性研究已經成為抗高血壓功能性食品開發熱點。

海洋占據了大約71%的地球表面積，但擁有超過90%的生物圈，而其中的生物承受著生命中遇到的最極端的溫度、光線和壓力。適應這些惡劣的環境導致了海洋生物種類豐富性和遺傳多樣性。因此，利用海洋生物資源挖掘功能性組分已經漸成焦點。筆者對利用海洋生物的蛋白資源制備抗高血壓生物活性肽的現狀和趨勢進行綜述。

1生物活性肽調控血壓的作用方式

1.1對血管緊張素轉換酶的抑制高血壓的形成與很多因素相關，如年齡、性別、社會經濟地位、家庭高血壓史、體重指數、腰臀比、生活方式和膳食結構等。目前，經典的血壓調節機制認為RAS或RAAS在協調人體內的血壓與體液平衡中起著重要作用。在RAS系統中，肝臟分泌的血管緊張素原（angiotensinogen，Asp–Arg–Val–Tyr–Ile–HisPro–Phe–His–Leu–Val–Tyr–Ser–R），經腎臟分泌的天冬氨酸蛋白酶——腎素催化水解LeuVal之間的肽鍵產生無生理活性的Ang Ⅰ（Asp–Arg–Val–Tyr–Ile–His–Pro–Phe–His–Leu）。Ang Ⅰ經血管內皮的ACE作用，C-末端氨基酸殘基HisLeu被水解，形成Ang Ⅱ（Asp–Arg–Val–Tyr–Ile–His–Pro–Phe）[3]。Ang Ⅱ能夠刺激血管的收縮和促進腎上腺皮質分泌醛固酮，導致血壓升高[3]。此外，緩激肽在血壓調節中也發揮著重要作用。緩激肽是主要由肝臟和腎臟分泌的激肽原在激肽釋放酶的作用下形成的一種血管擴張因子，但它C-末端的PheArg可以被ACE水解丟失而導致活性喪失[4]。目前尚未發現海洋生物源小肽具有腎素活性抑制作用，因此ACE成為眾多海洋生物源調節高血壓小分子物質開發的靶標。

目前，海洋生物源抗高血壓肽（表1）對ACE的抑制作用方式主要分為競爭性抑制和非競爭性抑制。已發現的ACE競爭性抑制作用小肽有FCVLRP[14]、IFVPAF[14]、KPPETV[14]、VEGY[18]、DDTGHDFEDTGEAM[21]、LF[22]、WA[22]、WV[22]、WM[22]、MF[26]、RY[26]、LY[26]、YL[26]、KW[26]和RVY[26]；ACE非競爭性抑制作用的小肽有VWDPPKFD[7]、WPEAAELMMEVDP[8]、MIFPGAGGPEL[9]、GDLGKTTTVSNWSPPKYKDTP[10]、VECYGPNRPQF[19]、FL[22]、AW[22]、MW[22]、IW[22]、LW[22]、WL[22]、FGASTRGA[29]、LLMLDNDLPP[30]、VVYPWTQRF[33]、AHSY[37]和AMN[44]等。

同時，一些海洋生物源小肽兼具ACE競爭性和非競爭性抑制作用，如FEDYVPLSCF[7]和 FNVPLYE[7]，人們認為此類小肽可能是作為前體型抑制劑存在，它們被ACE水解后才產生真正的ACE抑制肽。此外，Seigo Ono等發現的VW具有反抑制作用[22]，它通過與ACE酶和作用底物形成的復合物結合，抑制底物的水解，從而達到減少Ang Ⅱ的生成、調節血管的舒張的作用。

1.2對高血壓相關基因的轉錄調控血壓的調節還與體內氧化應激途徑和Ca2+＼Na+＼K+的離子平衡相關，它們都受到一些基因的調控[5-7]。Pfeffer等發現，經過50 μg的EGCG處理的人臍帶靜脈血管內皮細胞中65個基因轉錄被特異性地上調或下調，他們認為這些基因可能參與信號傳導途徑，進一步影響血管舒張功能參與血壓調節[45]。Qian 等也發現，合成小肽IVP、VIP、IPP、IPPVPP和VPPIPP等能夠上調心肌肌漿網Ca2+-ATP酶基因（SERCA 2a）的轉錄水平[46-47]。SERCA可以促進細胞內鈣離子的吸收，從而舒張血管平滑肌和心肌，導致血壓的下降。但是，目前關于海洋生物源抗高血壓生物活性肽是否能夠促進或抑制這類基因的轉錄尚未見相關報道。

2生物活性肽的抗高血壓活性的檢測方法

目前，生物活性肽的抗高血壓活性的檢測方法主要分為體外（in vitro）分析和體內（in vivo）分析。

2.1體外ACE活性抑制分析方法體外分析主要是根據RAS途徑，評價小肽的ACE酶抑制活性和作用方式。在ACE活性抑制試驗體系中，常用底物為HipHis Leu （HHL）[48]和N[3（2furylacryloyl）]L PheGlyGly （FAPGG）[49]。HHL是模擬Ang Ⅰ的C-末端氨基酸殘基的合成物，其在ACE的作用下能夠水解成馬尿酸（Hippuric Acid，HA）和二肽HisLeu （HL）。HA在乙酸乙酯中具有較好的溶解特性并且在228 nm波長的紫外光下具有較強的吸收特征，而絕大多數的小肽具有較好的水溶性，因此可以通過乙酸乙酯萃取反應終產物中HA，揮發后定容至一定體積，通過228 nm波長紫外光下光密度值（OD）來推演抑制劑對ACE的抑制作用。基于此原理，Cushman等提出ACE活性抑制分析紫外分光光度法并被廣泛引用[8]。但是，乙酸乙酯存在對HA的萃取不完全、對HHL和弱疏水性肽的非選擇性、揮發殘留及在228 nm波長下HHL和乙酸乙酯同樣具有吸收特征等特點，導致此方法精度低且耗時。針對此方法的缺陷，Matsui等和Li等分別建立ACE活性抑制可見分光光度方法，它省略了HA的分離步驟，具有直接、靈敏、準確、重現性好等優點[50-51]。該法基于三硝基苯磺酸（TNBS）與HL特異性結合生成在416 nm可見光波長下具有特征吸收峰的TNPHL衍生物和在喹啉輔助下苯磺酰氯與HA特異性結合生成的在492 nm波長的可見光下具有特征吸收峰的喹啉-苯磺酰氯HA發色體。為了進一步提高分析的精確性，尤其是對痕量樣品的分析，Wu 等建立了利用RPHPLC分析ACE水解HHL所生成的HA的檢測方法[50]，現在這一方法已經取代了分光光度法，被廣泛應用。

另外，有研究人員建立了以FAPGG為作用底物的ACE活性抑制分析分光光度法[49]。ACE可以將呈藍色的N （3 [2furylacryloyl） PheGlyGly水解成2furylacryloylLPhe和GlyGly，使藍光在340 nm發生在遷移。通過連續檢測340 nm波長下吸光值的下降速度可以計算ACE活性。這一方法因省略了從反應產物中分離HA的過程，具有簡單、靈敏和高效的特點。Sentandreu等建立了ACE活性抑制分析熒光光度法[53]。它是基于ACE可以將分子內淬滅的熒光底物

Oaminobenzoylglycylpnitrophenylalanylproline（ABzGlyPhe（NO2）Pro） 水解釋放出熒光分子Abz–Gly，通過熒光酶標儀測定熒光信號的強弱，進而分析樣品對ACE活性的抑制作用。該方法因為使用試劑單一，可滿足大量樣品的篩選需求。

無論是紫外-可見光光度法，還是RPHPLC方法，它們分析樣本的能力依然存在不足，難以適應大量樣品篩選的高通量需求。Zhang 等建立了利用毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）直接分析ACE活性的方法[54]。這一方法仍然是基于HHL可以被ACE水解為HA和HL。CE法具有更快捷、樣品底物和ACE用量少，自動化程度更高等優點，已經被應用于ACE活性抑制肽的高通量篩選[55]。

ACE抑制劑（ACEI）對ACE活性的抑制效果一般采用某一濃度下的抑制率和IC502種方式表示。通常分析樣品的ACE抑制作用動力學呈非線性的對數曲線，因此抑制率表示雖然簡單快捷，但不能比較不同水解物間ACE抑制活性的大小。而IC50是抑制ACE 50%活性時所需要的ACE抑制劑濃度，被廣泛地應用于指征樣品的ACE活性抑制能力。

2.2體內血壓調控分析方法從體外ACE抑制活性和胃腸道模擬消化分析獲得的信息僅表明小肽為潛在的體內降低血壓的制劑。小肽生理功能的體現需要它能夠耐受在胃腸道和血管系統中消化和改變，以活性形式到達靶標位點。因此，抗高血壓肽還需要進行體內分析。生物活性肽的抗高血壓活性體內分析主要采用模式動物——自發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）。SHR是Okamoto和Aoki（1959）采用高血壓（SBP，150～175 mmHg）的雄性WistarKyoto（WKY）大鼠與雌性WKY大鼠（SBP，130～140 mmHg）交配得到高血壓子代（SBP，>150 mmHg），再選用血壓較高的大鼠進行選擇性近親交配20代后獲得穩定的高血壓遺傳性。通過口服或者靜脈注射生物活性肽，通過尾袖法連續測量喂食后的SHR尾大鼠尾動脈血壓，以收縮壓（SBP）的變化來衡量生物活性肽的降壓效果。在體內分析中，通常以正常血壓的WKY大鼠作正常對照組[56]，但是WKY的自發性高血壓發生率較高，被認為不適合作為對照組使用。因此，在體內抗高血壓分析中，通常以溶劑作為空白組，以抗高血壓藥物Captopril作為陽性對照組，比較分析生物活性肽的體內降壓能力，不再設置正常血壓WKY作為正常對照組。另一種方法是先給原發性高血壓大鼠靜脈注射六甲銨（一種降壓藥），以去除大鼠中不依賴于RAS血壓調節系統的影響，然后再靜脈注射ACE抑制肽和AngI，根據SHR的血壓變化來評價ACE抑制肽的血壓調控作用[57]。

3海洋抗高血壓生物活性肽的制備及活性

目前，制備抗高血壓生物活性肽常用的方法主要有蛋白酶解法[5-15，17-24，26-30，33-41，43-44]和微生物發酵法[16]（表1）。蛋白酶水解法不僅可以根據抗高血壓生物活性肽的構效關系，選擇蛋白酶的種類，定向制備抗高血壓生物活性肽，提高生產效率；而且可以水解破壞過敏源蛋白的表位以降低甚至消除其致敏性，提高食用安全性，擴大適用人群。因此，該方法已經被廣泛應用于海洋生物源抗高血壓生物活性肽的制備[5-15，17-24，26-30，33-41，43-44]。在蛋白酶水解體系中采用的蛋白酶主要有工業食品級蛋白酶，如堿性蛋白酶[7，13]；微生物來源的復合蛋白酶，如嗜熱菌蛋白酶[5，34]；Bacillus licheniformis的堿性蛋白酶[6，26]、Bacillus sp. SM98011的蛋白酶SM98011[11，14]、鏈霉蛋白酶E[28]、Protamex[35]、Bacillus. Mojavensis A21粗制蛋白酶[36，37]等；植物來源的蛋白酶，如木瓜蛋白酶[12，23]、菠蘿蛋白酶[34，40]、膠原酶[28]；以及動物來源的蛋白酶，如胃蛋白酶[8，10，15，19-20，29-30，42-43]、胰凝乳蛋白酶[30]、胰蛋白酶[30，41]和烏賊肝胰腺粗制蛋白酶[36]等。在這些蛋白酶中，應用最為廣泛的為胃蛋白酶和胰蛋白酶，這主要歸因于利用它們制備獲得的抗高血壓活性肽能夠耐受體內消化，從而增加生物利用度，同時所制得活性肽的體外活性與體內活性之間存在較好的相關性。

在生產抗高血壓活性肽的發酵制備工藝中，主要采用的Lactobacillus fermentum SM 605微生物發酵[16]，或采用25%NaCl腌制發酵成熟[25，31-32]。除此之外，酸水解法亦被應用于抗高血壓生物活性肽的制備[42]。

現有制備抗高血壓活性肽的海洋生物種類豐富，包含了魚類（如：麻哈魚、三文魚、金槍魚、鱈魚、鯊魚、海龍、海鯛、鳳尾魚、沙丁魚、鰹魚、鯔、鲹魚、斑鰩等），蝦類（如：中國毛蝦[14-16]）、軟體動物類（如：紫貽貝、文蛤、蛤蜊、珍珠貝、鮑、海參、烏賊等），藻類（如裙帶菜、海藻、小球藻等）和浮游生物類（如：臂尾輪蟲[21]）等。主要利用其肌肉蛋白進行水解[5，8，11，13，22，26-27，35-39]，其他水解和發酵部分包括整蝦粉碎物、骨架蛋白、蛋白廢棄物、皮、鱗和生殖腺[7，9-10，12，28-30，42]等。

在獲得抗高血壓活性肽的研究過程中（表1），Wu 等利用來源于Bacillus sp. SM98011的蛋白酶SM98011水解鯊魚肌肉蛋白獲得二肽MF，其ACE活性抑制IC50為0.92 μmol/L，為已報道ACE抑制活性最高的小肽[11]。但是，Matsufuji等利用來源于Bacillus licheniformis的堿性蛋白酶水解沙丁魚肌肉蛋白，同樣獲得二肽MF，而其ACE活性抑制IC50為44.7 μmol/L，遠比前者活性低[26]。筆者認為這可能與他們采用的ACE活性抑制分析方法不同造成，Wu等采用的是毛細管電泳法，而Matsufuji等采用的是TNBS比色法，也可能與不同的制備方法獲得的二肽構象上的差異相關。Suetsuna等利用胃蛋白酶水解裙帶菜，獲得四肽YKYY，其體外ACE活性抑制IC50為64.2 μmol/L，SHR口服YKYY（50 mg/kg BW）1 h后，收縮壓下降大約50 mmHg[20]。而Suetsuna等同時獲得的四肽YNKL的體外ACE活性抑制IC50為21 μmol/L，為YKYY活性的3倍，但是SHR口服相同劑量的YNKL 2 h后，其收縮壓降低效果與YKYY的降壓效果沒有顯著差異[20]。這可能是因為體內消化環境使這2個四肽發生進一步的水解，造成活性的改變，也可能是由于YKYY在體內除了通過RAS系統調節血壓之外，還通過其他途徑調節血壓，如：氧化應激和基因轉錄調控等。另外，YKYY和YNKL是已報道的抗高血壓肽中體內降壓效果最好的2個小肽，具有較好的商業化前景。

4海洋抗高血壓生物活性肽的構效關系

目前，有關活性肽的ACE抑制活性與其結構之間的關系已經進行了一些研究，但是單純的海洋生物源生物活性肽的ACE抑制活性與其結構之間的確切關系尚未見系統研究。基于已有的研究結果，筆者發現海洋生物源生物活性肽的ACE抑制活性與其分子量、氨基酸的種類和排列順序以及肽的構象有密切的關系。

4.1分子質量對抗高血壓肽活性的影響分子量是生物活性肽活性功能體現的最重要的影響因子之一。從海洋生物蛋白中制備獲得ACE抑制活性肽的分子量范圍為2～21個氨基酸組成（表1）。在統計的72個明確了ACE活性抑制IC50的2～3肽的ACE活性抑制IC50中位數為51 μmol/L，而58個明確了ACE活性抑制IC50的4～21肽的ACE活性抑制IC50中位數為38.25 μmol/L。這并不能說明小肽的分子量的大小與其ACE抑制活性之間存在必然的相關性，例如Lee等利用胃蛋白酶水解金槍魚骨架蛋白制備獲得21肽GDLGKTTTVSNWSPPKY KDTP的ACE活性抑制IC50為11.28 μmol/L[10]；Wu 等利用來源于Bacillus sp. SM98011的蛋白酶SM98011水解鯊魚肌肉蛋白獲得二肽MF，其ACE活性抑制IC50為0.92 μmol/L[11]；而Yokoyama等利用嗜熱菌蛋白酶水解干燥的鰹魚肌肉蛋白制備獲得5肽LKPNM，其ACE活性抑制IC50為17 μmol/L[27]。后來，Fujita等發現LKPNM被ACE水解后的LKP的ACE抑制活性是LKPNM的8倍[58]。這說明生物活性肽活性可能與肽的氨基酸組成有關。

4.2氨基酸組成和一級結構對抗高血壓肽活性的影響研究表明，生物活性肽的ACE抑制活性與其氨基酸的組成具有很高的相關性，這可能是由這些組成氨基酸的結構特征決定的。關于ACE抑制活性肽的QSAR研究表明，組成小肽的氨基酸的分子質量、拓撲結構、疏水性、電荷和靜電特征等是影響其活性的關鍵變量[59]。具有較高ACE抑制活性的2～3肽的C-末端通常是Tyr、Phe、Trp或Pro，其N-末端通常為Val、Lue和Ile等脂肪族支鏈氨基酸[60-61]。Ono等和Enari等利用嗜熱菌蛋白酶和胃蛋白酶水解大馬哈魚肌肉蛋白制備獲得ACE抑制活性較高的2肽LW[5]、IW[5]、MW[5]、VW[5]、AW[22]、IW[23]和LW[23]等的C-末端均為Trp殘基，相對活性較高的小肽N-末端都含有Val、Lue和Ile殘基，且對活性的影響Val>Ile>Lue。這可能與芳香族氨基酸的疏水性以及Trp的正電荷特性相關[59]。Toshiaki等從鳳尾魚、沙丁魚和鰹魚醬中分離獲得ACE抑制活性較高的2～3肽的C-末端均為Pro殘基，如AP、KP、和RP[25]。此外，ACE抑制活性肽中Pro殘基的存在，尤其是C-末端的Pro，具有耐受消化酶降解的特點，能夠提高其體內的生物利用度，更有機會以完整形式作用于其靶標。

即使小肽的氨基酸組成相同，氨基酸排列順序的不同也對其ACE抑制活性和抑制方式具有重要的影響。Ono等利用嗜熱菌蛋白酶水解大馬哈魚肌肉蛋白制備獲得2個二肽MW和WM，其中MW的ACE抑制活性是WM的10倍，且MW的抑制方式是非競爭性抑制而WM為競爭性抑制[5]；同樣的另外2個二肽VW和WV，前者的ACE抑制活性是后者200倍，且前者的作用方式為反抑制作用，后者為競爭性抑制[5]。Ono等同樣利用嗜熱菌蛋白酶水解馬蘇大馬哈魚肌肉蛋白獲得2個二肽FL和LF，其中FL的ACE抑制活性是LF的28倍，且前者的抑制方式為非競爭性，后者為競爭性抑制[22]。同時，他們獲得另外2對二肽LY和YL以及LW和WL，雖然它們之間的ACE抑制活性相差2倍左右，但其抑制方式一致，分別為競爭性抑制和非競爭性抑制。筆者發現，氨基酸組成相同但順序不同的小肽之間ACE抑制活性差異越大，其抑制方式越可能不同，這可能與順序差異導致小肽的拓撲結構的改變相關聯，尤其是在較大分子量的小肽中表現更為顯著[62]。

5海洋抗高血壓肽的商業化狀況

在日本，一些含有海水魚蛋白水解物/肽為功能成分的特定保健用食品（Food for Specified Health Uses，FOSHU）已經獲準商業化，這些產品均宣稱適合輕度高血壓人群消費，如Lapis SupportTM和Valtyron。兩者都是以沙丁魚的蛋白水解產物為主要功能成分，其中Lapis SupportTM是以飲料的形式售賣，而Valtyron卻以33種產品形式售賣，包括飲料、果凍、湯料粉和膳食補充劑等[63]。另外一個被準允商業化的產品是利用嗜熱菌蛋白酶水解鰹魚形成的抗高血壓肽速溶粉湯料，其主要功能成分為抗高血壓活性肽LKPNM，它可以顯著降低輕度高血壓患者的收縮壓。除了以飲料產品售賣外，在日本鰹魚肽也以粉劑和片劑形式售賣，如Peptide ACE 3000。這些鰹魚肽片劑在美國和加拿大均有銷售，其商品名稱分別為Vasotensin和Levenorm[63]。

6海洋抗高血壓肽的應用前景與研究展望

雖然ACE活性抑制肽相對于常規的抗高血壓藥物存在劑量效應上的弱勢，但是抗高血壓藥物通常具有一些副作用，如造成干咳、瘙癢等。然而，ACE活性抑制肽來源于天然的蛋白質，作用溫和、安全沒有副作用，可以每天食用。同時，一些ACE活性抑制肽還具有多重的生物學效應，如抗氧化和抗炎癥等[64]，使之可能成為抗高血壓藥物日常替代品。海洋環境的生物多樣性和特殊性造就了海洋生物蛋白質的組成和氨基酸序列與陸生生物的蛋白具有較大的差異性，蘊含著豐富的生物活性肽資源。利用海洋生物蛋白或廢棄物料制備抗高血壓肽具有較好的應用前景。

但是，目前抗高血壓肽的生產工藝主要是通過體外蛋白酶水解或食品加工（主要是利用食品級微生物發酵處理）。由于通常采用的是復合酶消化水解蛋白和多種微生物進行發酵處理，所以生產的活性肽都是復雜的混合物。而且對完整大分子蛋白質的水解能力較差，水解程度較低，水解產物粘度較大，這些局限性導致了抗高血壓肽的得率很低，不適合規模化生產。同時，利用RPHPLC等技術從復雜的生物活性肽混合物中分離出目的活性肽過程繁雜，且缺乏高通量的活性鑒定技術體系。因此，這種高成本、低重復性和低生物利用率的體外酶解消化生產生物活性肽的生產工藝迫切需要發展一種新的替代生產技術。同時，由于二肽和三肽具有耐受體內消化酶的作用、易被吸收和易向合成藥物轉化等特點，所以在海洋生物源抗高血壓肽的篩選和鑒定研究中，人們更應該關注2～3個氨基酸組成抗高血肽的挖掘。

目前不同的研究中采用的ACE抑制活性分析試驗方法體系存在差異，如紫外分光度法、可見光分光光度法、熒光分析法、毛細管電泳法和色譜法等，使得不同實驗室間的結果很難進行直接的比較分析。因此，建立ACE抑制活性分析的標準方法體系十分重要，這樣有助于建立一個科學的、可參考的海洋生物源抗高血壓生物活性肽庫，方便開展抗高血壓肽的結構與效應關系的解析。通過構建的抗高血壓肽的構效關系，利用生物信息學方法，建立抗高血壓肽的靶向生產方式也十分重要。

此外，抗高血壓肽活性的體現具有食品體系的依賴性。不同的食品體系對其穩定性和體內的生物利用率具有影響。因此，采用更準確的接近目標食物和生物體系的模擬體系來進行活性分析尤為重要。同時，突圍現有的研究仍然停留在體外化學分析的局限，通過設計巧妙的動物體內試驗和人類臨床研究進一步評估其健康促進作用和潛在的風險也需要予以關注。

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