口蹄疫病毒A型AF/72株衣殼蛋白在昆蟲細胞中的表達及鑒定

摘要通過限制性酶切位點將P12A和3C基因插入到帶有雙啟動子（Pp10 和PPH）的桿狀病毒表達載體pFastBacTMDual，轉(zhuǎn)化E.coli DH10感受態(tài)細胞進行藍白斑篩選，將鑒定正確的重組桿狀病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細胞后收獲重組桿狀病毒rBacDualP12A3C，通過間接免疫熒光（IFA）和蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）檢測衣殼蛋白的表達。IFA結果表明表達產(chǎn)物能夠被A型FMDV豬抗陽性血清所識別，鑒定正確并具有良好反應原性。Westernblot檢測到81 kD（P12A）、57 kD（VP0+VP3）、47 kD（VP3+VP1）、33 kD（VP0）和24 kD（VP1/VP3）5條蛋白條帶，與預期相符。該研究為進一步研究A型口蹄疫病毒空衣殼的體外組裝提供了試驗依據(jù)。

關鍵詞口蹄疫病毒；衣殼蛋白；檢測

中圖分類號S855.3文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2015）26-021-03

Abstract The P12A and 3C genes were cloned into the baculovirus expression vector pFastBacTM Dual which simultaneously expressed the target genes by two individual promoters （Pp10 and PPH） by restriction enzyme cutting sites. The recombinant baculovirus expression vectors， which carried the target genes， were transformed into E. coli DH10 Bac competent cells to make white and blue screening. After transfecting the sf9 cells， the recombinant baculovirus （rBacmidDualP12A3C） were obtained and the detection of the recombinant protein was analyzed by the immunouorescent assay and Westernblot. The result of immunouorescent assay indicated that the recombinant protein could react with the positive porcine antiserum against FMDV type A. As shown by Westernblot， the recombinant baculovirus （rBacmidDualP12A3C） appeared five protein bands that represented the P12A protein （81 kD）， VP0 and VP3 protein （57 kD）， VP3 and VP1 protein （47 kD）， VP0 protein （33 kD）， and VP1 or VP3 protein （24 kD）， respectively. The study provides experimental basis for the research of the construction of viruslike particles of FMDV Type A in vitro.

Key words Footandmouth disease virus； Capsid protein； Detection

口蹄疫（footandmouth disease ，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（footandmouth disease virus，F(xiàn)MDV）感染引起的偶蹄動物共患的一種高度接觸性傳染病，能夠造成重大的經(jīng)濟損失和不良的政治影響[1]。FMDV是微RNA病毒科（Picornaviridae）中口蹄疫病毒屬（Aphthovirus）的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約8 300 nt，根據(jù)其血清學特性分為7個血清型（A、O、C、SAT13及Asia I型）[2]。FMDV的RNA含有能夠編碼多聚蛋白的唯一的開放閱讀框，多聚蛋白在加工過程中能夠產(chǎn)生很多的前體。經(jīng)過一系列的切割前體最終成為14種成熟的蛋白質(zhì)（4種結構蛋白VP1～VP4，組裝成病毒衣殼；10種非結構蛋白L、2A、2B、2C、3A、3B蛋白的3個拷貝、3C和 3D）[34]。在非結構蛋白中，3C蛋白酶能夠?qū)⒁職さ鞍譖1降解成前體蛋白VP0以及VP1和VP3蛋白，在病毒粒子的組裝過程中發(fā)揮重要作用。

DV 衣殼蛋白的表達研究，為進一步研究FMDV空衣殼的體外組裝提供幫助。

注：1～2.感染重組桿狀病毒rBacDualP12A3C的Sf9細胞；3.感染重組桿狀病毒rBacDual的Sf9細胞。

圖6 Westernblot檢測Sf9細胞中重組蛋白的表達

桿狀病毒表達系統(tǒng)表達產(chǎn)生的重組蛋白具有良好的生物學特性，而這一點是原核表達系統(tǒng)所無法比擬的。桿狀病毒表達系統(tǒng)能夠?qū)ζ浔磉_的目的蛋白進行糖基化、甲基化和磷酸化等轉(zhuǎn)錄后的加工修飾，使目的蛋白能夠更好地模擬天然蛋白的某些結構與生物學活性[78]；其次桿狀病毒表達系統(tǒng)的克隆容量比原核表達系統(tǒng)大得多，能夠表達大片段的外源基因，且能使嵌入的目的基因高水平表達；同時在生物安全性方面，桿狀病毒表達系統(tǒng)優(yōu)于其他哺乳動物表達系統(tǒng)[9]。

該研究選擇狀病毒表達載體對衣殼蛋白P12A基因和蛋白酶3C基因進行表達。pFastBacTMDual桿狀病毒載體具有雙啟動子和雙克隆位點，能夠允許2個外源基因同時嵌入，衣殼蛋白P12A基因和蛋白酶3C基因分別置于PPH和Pp10啟動子調(diào)控下。重組表達載體轉(zhuǎn)化E.coli DH10 Bac感受態(tài)細胞，由于E.coli DH10 Bac感受態(tài)細胞內(nèi)含有輔助質(zhì)粒能夠編碼轉(zhuǎn)座酶，在此轉(zhuǎn)座酶的作用下，產(chǎn)生重組的桿狀病毒rBacDualP12A3C，進而轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞后經(jīng)傳代進行重組蛋白的表達研究。IFA和Westernblot檢測結果表明A型FMDV衣殼蛋白在昆蟲細胞中得到表達并具有良好的抗原性。

參考文獻

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桿狀病毒表達系統(tǒng)BactoBac的發(fā)展為研究FMDV空衣殼的體外組裝提供了理論基礎和試驗依據(jù)。近年來利用桿狀病毒表達系統(tǒng)已經(jīng)成功表達了O型和Asia I 型口蹄疫病毒的空衣殼。Cao等[5]成功將Asia I型FMDV的衣殼蛋白基因嵌入pFastBacTMDual載體，重組蛋白得到表達，且在體外組裝成直徑為25～30 nm的空衣殼結構。Mohana等[6]利用桿狀病毒表達系統(tǒng)構建了含有O型FMDV衣殼蛋白基因P12A3C的重組桿狀病毒，目的蛋白得到表達并組裝成病毒樣顆粒，免疫動物后獲得一定的免疫效果。而目前對A型FMDV的研究較少，因此筆者采用桿狀病毒表達系統(tǒng)，構建了包含F(xiàn)MDV A型AF/72株衣殼蛋白P12A與蛋白酶3C基因的重組桿狀病毒rBacmidDualP12A3C，并通過IFA及Westernblot鑒定了衣殼蛋白的抗原性，為體外研究A型FMDV空衣殼的體外組裝提供試驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1病毒和細胞FMDV A型AF/72毒株的豚鼠毒、Sf9細胞（草地夜蛾卵巢細胞）、A型FMDV豬抗陽性血清及A型FMDV高免豚鼠抗血清均為蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室保存。

1.2載體與試劑桿狀病毒表達載體pFastBacTMDual、E.coli Trans5α感受態(tài)細胞、E.coli DH10 Bac菌、轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin II Reagent 、Grace’s Insect Medium（分為完全培養(yǎng)基和不完全培養(yǎng)基2種）、PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit 和Sf900TMII SFM均購自Invitrogen公司；RNeasy Mini Kit（50）購自QIAGEN公司；PrimeScriptTM One Step RTPCR Kit Ver 2、T4 DNA連接酶、pMD19T克隆載體購自大連寶生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶BamH I、Spe I、Sph I、和Nhe I購自NEB公司；FITC標記的兔抗豬、HRP標記的山羊抗豚鼠IgG均購自Sigma公司。

1.3引物設計與合成根據(jù)中國農(nóng)業(yè)科學院家畜疫病病原生物學國家重點實驗室保存的FMDV A型AF/72株豚鼠毒的基因序列設計兩對引物分別擴增P12A和3C基因。擴增P12A基因的上游引物P12AF：5′CGGGATCCGGCGCCGGGCAATCCAGC3′和下游引物P12AR：5′ GGACTAGTCCTGACGTCAGAGAAGA3′，下劃線分別為BamH I和Spe I限制性內(nèi)切酶酶切位點。擴增3C基因的上游引物3CF：5′ CATGCATGCGCTAAGAACTTGATTGT3′和下游引物3CR：5′ CTAGCTAGCTTAATCTCTGGTGTCAACAA3′，下劃線分別為Sph I和Nhe I限制性內(nèi)切酶酶切位點。M13通用引物為pFastBacTMDual的通用引物。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4RTPCR擴增P12A和3C基因以提取的FMDV A型AF/72毒株的豚鼠毒RNA為模板，通過PrimeScriptTM One Step RTPCR Kit Ver 2試劑盒，分別用特異性引物P12AF/P12AR和3CF/3CR擴增P12A和3C基因。核酸電泳分析鑒定擴增后回收目的片段P12A和3C。

1.5重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMDualP12A3C的構建將目的片段P12A與桿狀病毒表達載體pFastBacTMDual同時用限制性內(nèi)切酶BamH I和Spe I雙酶切，回收后的P12A片段和pFastBacTM Dual片段連接并轉(zhuǎn)化E.coli Trans5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆菌落后搖菌提取質(zhì)粒，將雙酶切及測序鑒定為陽性的質(zhì)粒命名為pFastBacTM DualP12A。然后將重組質(zhì)粒pFastBacTM DualP12A和3C片段分別用限制性內(nèi)切酶Sph I和Nhe I雙酶切，回收酶切產(chǎn)物并連接，最后將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pFastBacTM DualP12A3C。

1.6重組桿狀病毒質(zhì)粒BacmidDualP12A3C的構建將重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMDualP12A3C轉(zhuǎn)化E.coli DH10感受態(tài)細胞進行藍白斑篩選，同時將未插入外源基因的質(zhì)粒pFastBacTMDual轉(zhuǎn)化E.coli DH10感受態(tài)細胞作為陰性對照。利用PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit試劑盒提取重組桿狀病毒質(zhì)粒BacmidDualP12A3C和BacmidDual。通過M13通用引物PCR鑒定目的基因是否插入。

1.7重組桿狀病毒rBacDualP12A3C的構建重組桿狀病毒質(zhì)粒BacmidDualP12A3C和BacmidDual在Cellfectin II Reagent轉(zhuǎn)染試劑的協(xié)助下分別轉(zhuǎn)染Sf9細胞。置于27.5 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d；待Sf9細胞出現(xiàn)病變后，將細胞吹打下來置于離心管中劇烈振蕩，除去細胞和碎片收集上清液，即為第一代重組桿狀病毒rBacDualP12A3C和rBacDual。將重組桿狀病毒在Sf9細胞中傳代培養(yǎng)至第三代，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8重組蛋白的間接免疫熒光（IFA）檢測將第三代重組桿狀病毒rBacDualP12A3C和rBacDual病毒液感染Sf9細胞，待細胞出現(xiàn)病變后，用PBS洗滌后用經(jīng)4%多聚甲醛固定20 min、0.5%的Triton X100穿孔15 min及含1% BSA的PBST在37 ℃下封閉1 h；37 ℃下孵育合適的一抗即A型FMDV豬抗陽性血清（1∶200）1 h；避光37 ℃條件下，孵育其對應的二抗即FITC標記的兔抗豬IgG（1∶500） 1 h；PBS洗滌3次后，于熒光顯微鏡下觀察重組蛋白的間接免疫熒光結果。

1.9重組蛋白的Westernblot檢測用重組桿狀病毒rBacDualP12A3C和rBacDual病毒液感染Sf9細胞，置于27.5 ℃培養(yǎng)3 d出現(xiàn)病變。收集細胞用RIPA裂解液裂解及富集超聲裂解，1×SDS loading buffer煮沸后，經(jīng)SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h。孵育相應的A型FMDV高免豚鼠抗血清一抗（按1∶200的比例稀釋），PBST洗滌3次后，然后孵育其對應的HRP標記的山羊抗豚鼠IgG二抗，最后加ECL顯色液，壓片、曝光。

2結果與分析

2.1P12A和3C基因的克隆及鑒定以提取乳鼠毒的RNA為模板，以引物P12AF/P12AR與3CF/3CR進行RTPCR，核酸電泳分析結果顯示，P12A長片段基因大小約為2 259 bp，3C基因長片段基因大小約為639 bp，成功擴增出目的基因（圖1）。

2.2重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMDualP12A3C的構建及鑒定P12A基因片段與pFastBacTM Dual桿狀病毒載體的連接產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和Spe I雙酶切后電泳得到大小約2 259和5 238 bp的片段，與預期相符（圖2），重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pFastBacTM DualP12A與3C基因片段連接后用限制性內(nèi)切酶Sph I和Nhe I雙酶切后電泳得到大小約為639和7 500 bp的片段，與預期相符（圖3），重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，鑒定正確命名為重組轉(zhuǎn)移載

體pFastBacTMDualP12A3C。結果表明A型FMDV衣殼蛋白P12A基因和蛋白酶3C基因成功插入桿狀病毒表達載體pFastBacTM Dual。

2.3重組桿狀病毒質(zhì)粒BacmidDualP12A3C的構建及鑒定以提取重組桿狀

病毒質(zhì)粒BacmidDualP12A3C和BacmidDual為模板，

用M13通用引物PCR擴增得到大小約為5 600和2 560 bp的條帶（圖4），結果表明重組桿狀病毒質(zhì)

粒BacmidDualP12A3C構建成功。

2.4重組桿狀病毒rBacDualP12A3C的構建重組桿狀病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細胞后27.5 ℃培養(yǎng)7 d，待細胞出現(xiàn)諸如細胞體積變大，細胞核增大，細胞大量脫落等病變后（圖4），收集上清液即為第一代重組桿狀病毒rBacDualP12A3C。

2.5重組蛋白的IFA檢測重組桿狀病毒rBacDualP12A3C和rBacDual病毒液感染Sf9細胞3 d后，用A型FMDV豬抗陽性血清進行IFA檢測。結果表明，感染重組桿狀病毒rBacDualP12A3C的細胞能夠檢測到綠色熒光，而感染rBacDual細胞則沒有檢測到綠色熒光（圖5）。這說明重組蛋白在昆蟲細胞中得到表達。

2.6重組蛋白的Westernblot檢測收集蛋白樣品經(jīng)SDSPAGE 凝膠后轉(zhuǎn)膜，用FMDV AF72豚鼠抗血清作為一抗進行Westernblot檢測，感染重組桿狀病毒rBacDualP12A3C的Sf9細胞檢測到大小約為81 kD（P12A）、57 kD（VP0+VP3）、47 kD（VP3+VP1）、33 kD（VP0）和24 kD（VP1/VP3）的蛋白，而感染rBacDual沒有檢測到蛋白條帶（圖6）。表明重組蛋白在Sf9細胞中得到表達，且具有良好的抗原性。

3討論

疫苗免疫是防控和根除FMD的主要手段。目前滅活疫苗具有良好的免疫效果，是使用最為廣泛的疫苗。但滅活疫苗在FMD的防控中存在很多缺陷，在一些發(fā)達國家和地區(qū)FMD滅活疫苗已經(jīng)被禁止接種。而且單一的疫苗接種不能克服當前疫苗的不足，針對不同的情形，選擇不同的疫苗接種是必要的。因此FMD新型疫苗的研究尤為重要。目前有許多研究轉(zhuǎn)向?qū)MDV VLPs組裝的研究，但對A型FMDV空衣殼的研究較少，該研究選取FMDV AF/72毒株進行FM