脹果甘草全草中甘草查爾酮A的鑒定研究

摘要

[目的]觀察脹果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat）特異性成分甘草查爾酮A在全草中的分布情況。[方法]利用超聲輔助的乙醇提取法制備新疆脹果甘草根、莖、葉和種子的提取物；利用硅膠薄層色譜法分析以上4種樣品的斑點特征；利用制備薄層法分離薄層板上的特殊斑點并對所分離的單體成分進行結構分析。[結果]脹果甘草乙醇提取物在展開劑為乙酸乙酯∶石油醚∶甲酸（6∶4∶1）的薄層色譜條件下所顯示的一種特殊亮黃色斑點被鑒定為甘草查爾酮A，此斑點僅存在于脹果甘草根和莖的提取物中，而不存在于葉和種子提取物中。[結論]甘草查爾酮A在甘草中主要分布在根和莖中。此結果為脹果甘草莖的藥用開發及脹果甘草的快速品種鑒定奠定了一定的基礎。

關鍵詞脹果甘草；甘草查爾酮A； 鑒定分析；甘草全草

中圖分類號S567.7+1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）26-064-03

Abstract[Objective] To observe the distribution of licochalcone A （LicoA） in the whole plant of Glycyrrhiza inflata Bat （GIB）. [Method] The extracts of the root， stem， leaf and seed of GIB plant were prepared by using the ultrasonic assisted ethanol extraction method； their silica gel thin-layer chromatographic （TLC） characteristics were analyzed； the special TLC spot was isolated and structurally characterized. [Result] The special TLC spots of GIB ethanol extract was characterized by mobile phase of acetic acetate/petroleum ether/methyl acetate （6∶4∶1） and identified as licochalcone A， which was found in GIB root and stem， but not found in leaf and seed. [Conclusion] Licochalcone A is mainly distributed in the root and stem of Glycyrrhiza inflata Bats. This result could provide useful information for the research and medicinal development of the stem of Glycyrrhiza inflata Bat and rapid identification of licorice specie.

Key words Glycyrrhiza inflata Bat； Licochalcone A； Identification and analysis； Whole plant of licorice

甘草在我國藥用歷史悠久，在傳統醫學中廣泛應用。中醫學認為甘草有益氣補中、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調和諸藥等功效。甘草的品種較多，而《中國藥典》（2010 年版一部）記載其原植物有 3 種，即烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）、脹果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat）和光果甘草（Glycyrrhiza glabra L），其中脹果甘草在新疆、甘肅等西部地區分布資源較為豐富[1]。

甘草的化學成分是其藥用功效的主要物質基礎。國內外已從甘草中分離出100多種黃酮類化合物、60多種三萜類化合物以及香豆素類、生物堿類、有機酸類等成分[2]。因不同種類甘草的化學成分有一定的區別，而其藥用價值可能不完全相同。因此其品種鑒定是非常重要的。

甘草查爾酮A （Licochalcone A，LicoA）是甘草中的一種查爾酮類化合物，被視為脹果甘草的種屬特異性成分，主要存在于脹果甘草中[3]。近期的藥理學和生物學研究表明，LicoA具有抗氧化[4]、抗炎[5]、抗菌[6]、抗腫瘤[7]和調節免疫[8]等多種生物活性，在食品和醫藥工業中有廣泛的用途。近期的試驗研究顯示，LicoA顯示明顯的抗前列腺癌和抗乳腺癌活性，并能抑制癌細胞的擴散轉移[9-11]，該結果促進了脹果甘草在抗癌新藥研究中的潛在價值。然而，LicoA主要存在于脹果甘草根中，且其含量低（約為0.416%）[12]。有學者探索LicoA的人工合成工藝，然而因其結構式較復雜、合成路線較長，且需要用一些昂貴的化學試劑，從而合成成本比天然提取更高[13]，這限制了LicoA的深入藥理學研究及應用開發。 為尋找LicoA的新資源或新來源，該研究就LicoA在脹果甘草根、莖、葉和種子中的分布情況進行了觀察研究，并探討甘草全草的綜合開發利用思路。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1

藥材。新疆脹果甘草（2012年8月分別采集于新疆甘草基地巴楚縣），根據藥材特征初步鑒定品種，并由新疆醫科大學藥學院帕麗達·阿不力孜教授進行生藥學鑒定為脹果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat）。

1.1.2

儀器。IR Prestige21紅外光譜儀（SHIMADZU），UnityInova600超導核磁共振譜儀（美國Varian公司），AB104N電子天平（MettlerToledo Group），DT200型電子分析天平（常熟市衡器廠），N1001型旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司），SK2510HP型數控超聲清洗儀（上海科導超聲儀有限公司），ZF2C暗箱式紫外分析儀（上海安亭電子儀器廠），WRS1A型數字式熔點測定儀（上海精密科學儀器有限公司）。

1.1.3

試劑。乙酸乙酯、石油醚、無水乙醇、甲酸等均為分析純；甘草查爾酮A對照品（美國Sigma公司，批號803529），蒸餾水（新疆醫科大學蒸餾水供應中心提供），進口硅膠薄層GF254層析板（德國Merck）。

1.2方法

1.2.1

甘草總黃酮提取物的制備。將干燥脹果甘草根、莖、葉和種子分別經粉碎、過20目篩，各取一定量的樣品粉末（根1 g、莖3 g、葉和種子各2 g），分別在15 ml的70%乙醇中室溫浸泡10 min后，放入水浴鍋中，50 ℃下超聲10 min，并過濾，得約6 ml的4種供試品溶液，分別編號為T-A（提取物A，根的提取液）、T-B（莖的提取液）、T-C（葉的提取液）和T-D（種子的提取液）。

1.2.2

甘草查爾酮A對照品溶液的制備。精密稱取甘草查爾酮A對照品約10 mg，放置10 ml的容量瓶中用70%的乙醇溶解定容，制成濃度為1 mg/ml的對照品溶液備用。

1.2.3

甘草提取物的薄層鑒定。用毛細管將以上所制備的4種樣品提取物溶液（T-A、T-B、T-C、T-D）和甘草查爾酮A對照品溶液（LicoA），以體積比乙酸乙酯∶石油醚∶甲酸（6∶4∶1）混合展開劑進行展開，分別點樣于進口硅膠GF-254薄層板上，并在365 nm的紫外燈下觀察薄層斑點特征。

1.2.4

脹果甘草提取物中特殊斑點的分離鑒定。根據以上薄層鑒定的結果，先初步觀察到脹果甘草根和莖存在LicoA對照品特征的相同樣品斑點，再利用制備薄層法，對此種樣品斑點進行分離純化鑒定。具體操作過程：分別稱取脹果甘草根和莖的粉末各10 g，分別加在50 ml的70%乙醇中室溫浸泡4 h后，放入超聲清洗儀，50 ℃的溫度下提取30 min，提取2次，并合并過濾，各得約70 ml的提取液，用旋轉蒸發儀減壓濃縮至干，得浸膏，利用自制的硅膠制備薄層板（20 cm×20 cm，0.3 mm）進行展開（乙酸乙酯∶石油醚∶甲酸6∶4∶1），在紫外光365 nm下顯色，對甘草查爾酮A斑點的色帶標記，并刮取，用甲醇處理，減壓濃縮至干，2種樣品的黃色提取物固體分別用乙酸乙酯-石油醚重結晶，各得少量亮黃色針狀結晶，過濾，干燥，并用光譜方法進行結構鑒定。

2結果與分析

2.1脹果甘草不同部位薄層色譜特征

脹果甘草不同部位乙醇提取物（T-A、T-B、T-C、T-D）的薄層色譜特征如圖1所示；這些提取物中根和莖具有與對照物甘草查爾酮A（LicoA）相應的亮黃色熒光斑點（Rf=0.68），即初步證明含有LicoA成分。

2.2單體成分的光譜鑒定結果

經薄層鑒定結果可觀察到脹果甘草不同部位的乙醇提取物中，只有根和莖中具有符合于LicoA的1個亮黃色熒光斑點。經過薄層并重結晶的方法得到外觀與對照品（LicoA）相似的亮黃色結晶，經過光譜鑒定和理化鑒定后，亮黃色針狀結晶，紫外光365 nm下呈亮黃色熒光斑點，易溶于乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑，不溶于水，熔點為156.3～158.2 ℃；與FeCl3溶液反應生成黃色沉淀，與鹽酸-鎂粉反應顯微紅色，遇到硫酸顯桔紅色，遇堿性顯色試劑顯橙色。IR（紅外光譜，KBr壓片）υ分別為837、904、1 006、1 039、1 078、1 166、1 215、1 261、1 290、1 346、1 446、1 510、1 556、1 587、1 604、1 650、2 964、3 217 cm-1。1H-NMR（核磁共振譜，Varian 600 MHz，CDCl3）δ分別為1.45（6H，s，CH3-4’’，5’’）、2.19（2H，s，OH-4，4’）、3.87（3H，s，OCH3）、5.32（1H，dd，J=10.1Hz，H-3’’）、5.32（1H，dd，J=10.1Hz，H-3’’）、5.35（1H，dd，J=18.1Hz，H-3’’）、6.20（1H，dd，J=18，10Hz，H-2’’）、6.45（1H，s，H-3）、6.96（2H，d，J=8.5Hz，H-3’，5’）、7.47（1H，s，H-6）、7.58（1H，d，J=16Hz，H-α）、7.98（2H，d，J=8.5Hz，H-2’，6’）、8.03（1H，d，J=16Hz，H-β）。NMR圖譜中可以觀察到1.45（6H，s，CH3-4’’，5’’）為2個甲基的信號，2.19（2H，s，OH-4，4’）是2個酚羥基，3.87（3H，s，OCH3）是一個甲氧基，6.20（1H，dd，J=18，10Hz，H-2’’）、5.35（1H，dd，J=18.1Hz，H-3’’）和5.32（1H，dd，J=10.1Hz，H-3’’）這三組信號還給出一組末端雙鍵質子信息， 7.98（2H，d，J=8.5Hz，H-2’，6’）和8.03（1H，d，J=16Hz，H-β）為典型的查爾酮特征信號。氫譜還給出一組AA’XX’偶合的A環芳氫信號6.96（2H，d，J=8.5Hz，H-3’，5’）和7.98（2H，d，J=8.5Hz，H-2’，6’），以及B環2個孤立芳環質子信號6.45（1H，s，H-3）和7.47（1H，s，H-6）。上述理化鑒定結果與Wanga等[14]的研究結果一致。因此，將此單體成分鑒定為甘草查爾酮A，其化學結構如圖2所示。

3討論

脹果甘草是中國藥典收錄的甘草品種之一，主要分布于新疆、甘肅、內蒙古一帶。近期研究顯示，脹果甘草和脹果甘草藥渣中的總黃酮具有較強的抗癌活性，其作用機制為誘導腫瘤細胞早期凋亡，經進一步研究顯示，其發揮抗腫瘤作用的主要有效成分為LicoA，尤其是宮頸癌細胞對LicoA的抗癌活性更為敏感[15-16]。可見，單體成分LicoA及脹果甘草資源在抗癌新藥研究中具有潛在的深入研究價值。然而，LicoA在脹果甘草中的含量很低、人工合成方法的工藝路線復雜、制備成本很高[12-13]，這促使人們尋找LicoA 的新資源和新來源，以便促進相關的藥理學研究。

木合布力·阿布力孜等[17]利用硅膠薄層色譜法，以LicoA為對照品，對新疆脹果甘草進行品種鑒定法，為脹果甘草的快速品種鑒定提供依據。該試驗在文獻方法的基礎上，優化了試驗條件和展開劑組成，并利用硅膠薄層色譜法對新疆脹果甘草全草進行LicoA的分布特征研究，并發現了全草中LicoA的新存在部位。在操作中，首先分別對已鑒定的脹果甘草根、莖、葉和種子的乙醇提取進行制備，然后利用硅膠薄層色譜法，以LicoA為對照品，以優化的展開系統乙酸乙酯∶石油醚∶甲酸（6∶4∶1）進行展開，結果發現，脹果甘草根和莖具有適合于LicoA特征的鮮明黃色斑點，而甘草葉和種子沒有該特色斑點。進一步利用制備薄層色譜法，將適合于LicoA對照品特征的樣品色帶進行分離純化，利用光譜分析方法進行結構鑒定，并確定其化學結構為LicoA，從而進一步確定適合于對照品特征的樣品斑點確實為LicoA。

關于查爾酮類活性成分LicoA在脹果甘草莖里面分布方面未見文獻報道。因此，該研究結果具有一定的創新意義。從脹果甘草中提取制備甘草查爾酮A時，利用甘草莖在保護甘草資源及甘草地上部分的綜合開發利用中具有一定的價值。因此該研究結果在抗癌活性成分甘草查爾酮A新資源的研究、脹果甘草莖的藥用開發利用、甘草根資源保護以及脹果甘草品種的快速鑒定研究中將具有重要意義。

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