色譜法檢測動物源食品中磺胺類藥物殘留研究進展

摘要磺胺類藥物是一類可限量使用于水產養殖和畜禽業的廣譜高效抗菌藥物，且被廣泛應用。磺胺類在動物源性食品中會有殘留，通過任何途徑攝入磺胺都有可能在人體內蓄積而對人造成危害。目前，動物源性食品中磺胺類藥物多殘留的定量檢測主要有高效液相色譜法（HPLC）以及高效液相串聯質譜法（HPLCMSMS）。色譜法檢測磺胺類藥物的主要步驟為提取、濃縮、凈化和進色譜柱分析。簡要綜述了色譜法檢測動物源食品中磺胺類藥物的方法研究進展，以期為動物源性食品中磺胺類藥物多殘留檢測提供參考。

關鍵詞磺胺類；殘留；檢測；動物源食品；高效液相色譜；質譜

中圖分類號S851.34+7文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）26-330-03

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）是指具有對氨基苯磺酰胺結構的一類藥物的總稱，被廣泛應用于水產養殖和畜禽業，主要作為化學治療藥物用于預防和治療細菌感染性疾病[1]。磺胺類藥物有較廣的抗菌譜，對大多數革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌的抑制作用明顯[2]。可限量使用的磺胺類藥物是目前水產養殖業中最常使用的抗生素之一，多用于養殖類水生生物的爛鰓病、腸炎病、弧菌病、癤瘡病、細菌性敗血病等。在生物體內，磺胺類藥物有著比較長的作用時間和代謝時間，通過食物鏈等途徑攝入的磺胺類藥物都有可能蓄積在人體內并富集，磺胺二甲嘧啶等甚至有引起潛在致癌性的可能[3]。人類造血系統會遭受磺胺類藥物殘留的破環，從而引發粒細胞缺乏癥、血小板減少癥、溶血性貧血癥等[4]；磺胺類藥物殘留也會引起人體過敏反應，輕則出現蕁麻診或皮膚瘙癢，嚴重時則引起血管性水腫，甚至導致死亡[5]。世界上一些地區或國家對動物源性食品中的磺胺類藥物最高殘留限量要求不斷提高[6]，歐盟、美國等地區或國家規定了動物源性食品中單個磺胺以及總磺胺的最高殘留限量（MRLs）為100 μg/kg，而潛在致癌的磺胺二甲基嘧啶（SM2）最高殘留限量（MRLs）為25 μg/kg[7]。

Smedley MD等在20世紀90年代初用液相色譜法對牛奶中多種磺胺類殘留進行檢測[8]，Tsai CE等用液相色譜法對雞血清和雞蛋中磺胺類殘留進行檢測[9]，Ikai Y等用試劑盒對肉中的磺胺類殘留進行檢測[10]。國內出現的較早對磺胺類檢測的報道有楊紅建立的酶聯免疫吸附分析（ELISA）對磺胺類檢測[11]，張素霞等對豬肌肉組織中磺胺類藥物的MSPD凈化和HPLC測定等[12]。適用于檢測動物源性食品中磺胺類藥物多組分殘留的方法比較多，目前國內外報道的主要有微生物檢測法[13]、酶聯免疫分析法[14-15]、氣相色譜質譜法[16]、高效液相色譜[17-19]、毛細管電泳（CE）法[20]，高效液相色譜串聯質譜（HPLCMS）[21-22]。微生物檢測法存在菌種不易篩選、耗時長、穩定性差、靈敏度低等缺點，不能滿足微量抗微生物藥殘留的實際樣品檢測工作的要求[23]；酶聯免疫法和放射免疫法主要應用于快速檢測和簡單定性試驗，時有假陽性或假陰性樣品出現；氣相色譜-質譜法較為先進，其特異性和靈敏度比較高，但需進行繁瑣的衍生過程。帶選擇離子監控的HPLCMSMS無需進行繁瑣的衍生過程，但其普及不廣，應用較少[24]；高效液相色譜紫外檢測法和毛細管電泳法受基質雜峰干擾比較大，容易出現定性誤差；高效液相色譜熒光檢測靈敏度高、基質干擾較小，是目前農業部規定作定量的一種重要方法[25]；高效液相色譜-串聯質譜法（HPLCMS）是目前最可靠的方法，其靈敏度高、定量準確，是農業部指定作為磺胺類檢測數據確證的方法[26]。

1樣品的提取

1.1試劑選擇磺胺類藥物不易溶于水，比較容易溶于有機溶劑、稀酸和稀堿[24]。動物源性食品中SAs的提取試劑可以大致分為以下4種：①強極性有機溶劑提取，如乙腈、丙酮、乙酸乙酯等。方炳虎等選取乙酸乙酯作提取溶劑檢測了牛奶中12種磺胺類藥物[18]；張小軍等選用乙酸乙酯提取再用鹽酸萃取檢測了水產品中4種磺胺類藥物[24]；孫偉紅等選用乙腈并在其中添加1%甲酸作為提取溶劑檢測了水產品中18種磺胺類藥物[1]。②不溶于水的有機溶劑，如三氯甲烷和二氯甲烷。③易溶于水的有機溶劑添加一定比例的酸或堿和含水的乙腈或甲醇混合液提取，如水-乙腈-乙酸。劉海新選用加入水-乙腈-乙酸（90∶10∶0.2，V/V）溶液提取，再用乙腈重復提取殘渣，加入水、二甘醇、二氯甲烷萃取后濃縮[27]。④緩沖溶液提取，如磷酸緩沖液；加入灼燒過的無水硫酸鈉除水和有機溶劑提取。李孟玻等先加無水硫酸鈉再用二氯甲烷在超聲處理條件下提取[28]。

使用乙腈提取時，需加入經過灼燒的無水硫酸鈉，可促進樣品蛋白質變性分散以及防止水分進入目標提取液，使樣品分散效果較好，提取更加充分，且容易濃縮凈化[29]。液相色譜-串聯質譜法（HPLCMS）主要采用此提取方法。乙腈作為萃取溶劑使用時需要脫水，則會增加樣品預處理的操作步驟。經試驗比較得知，乙酸乙酯萃取效果較為理想，平均回收率在74.6%～98.9%。在使用酸或者堿溶液作反萃取的試驗中，有機相提取液中磺胺類藥物的反萃取用2 mol/L的鹽酸效果最好，此方法平均回收率在81.6%～94.7%[24]。液相色譜法（HPLC）測定磺胺類主要使用該方法提取樣品。

1.2提取方式樣品提取主要采用獨立高速振蕩器勻質、振蕩，或結合超聲技術提取。提取時需待冷凍的樣品解凍，離心管中不出現大塊樣品，勻質或振蕩時間1 min以上，保證充分提取。王靜等采用加速溶劑萃取法（ASE）提取水產品中的SAs，提高了檢測結果的回收率和精密度，降低基質干擾，并且開發出一種新的可同時測定水產品中13種磺胺類的方法，方法簡便準確，13種藥物完全分離，重現性高[30]。

2凈化

色譜法分析SAs多殘留主要有液-液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）2種凈化方法，實際分析過程中需根據樣品基質的性質和提取溶劑選擇合適的凈化方法。樣品提取液凈化的基本方法是LLE，原理是互不相溶的試劑對待測SAs組分和雜質溶解性的差異進行分配。選用乙腈和乙酸乙酯作為提取劑時，常用的除脂試劑為正己烷，其凈化效果較好。乙腈與正己烷具有互溶性，導致SAs加標回收率有所降低，朱曉華等使用正己烷去脂前則先用乙腈對正己烷進行飽和[31]。SPE已逐步代替了樣品易乳化、消耗高純溶劑量大、操作費時等不足的LLE。SPE凈化時溶劑量消耗較少且不產生乳化現象，是SAs提取液凈化最常選用的方法，該方法主要用于緩沖溶液和極性溶劑提取SAs之后。凈化常用的SPE柱主要是硅膠鍵合C8或C18的反相柱以及硅膠鍵合丙酸基或者苯磺酸基等基團的離子交換柱（如PRS、MPC、SCX），聚合物基質的SPE柱（如HLB柱）使得SPE技術得到更為廣泛的應用。

有研究者以基質固相分散技術（MSPD）與HPLC相結合的方法來測定牛奶中8種常見的磺胺類藥物殘留，如余輝菊等的研究[32]等。多種磺胺類藥物都是具有一定極性的化合物，具有極性的吸附劑對此類磺胺類藥物吸附效果更好，C18、中性氧化鋁、酸性氧化鋁等對磺胺類藥物則不具有較高的吸附回收率。硅酸鎂和堿性氧化鋁也適用于牛奶中磺胺類藥物多殘留的MSPD分離。龐國芳等重點對比了三氯甲烷提取+硅膠柱凈化、Na2EDTAMcllvaine緩沖溶液提取+Oasis HLB固相萃取柱凈化、乙腈提取+氧化鋁柱凈化和乙腈提取蒸干后用正己烷去除脂肪4種提取凈化體系[21]。三氯甲烷作為提取劑，提取液中會有較多的脂肪，再經硅膠柱凈化后會直接影響到磺胺類的回收率。提取劑為Na2EDTAMcllvaine緩沖溶液時，目標提取液經Oasis HLB固相萃取柱凈化，分析得出回收率和穩定性都較差。選擇乙腈提取劑加正己烷除脂肪凈化的方法所得目標提取液得到明顯凈化，結果顯示磺胺類藥物的回收率較高。

3 提取液濃縮

樣品提取液濃縮至干會導致目標物溶解不充分，凈化后氮吹儀水浴和真空旋轉水浴蒸發濃縮到目標量1 ml左右。當樣品提取液量大于15 ml時應該選擇真空旋轉水浴蒸發，旋蒸過程中產生爆沸、氮吹過程中氮氣流速過大均會導致回收率偏低。SAs熱穩定姓良好，故旋蒸和氮吹對水浴溫度要求不高，一般45～60 ℃對目標物回收率沒有明顯影響。

4高效液相色譜法

4.1 色譜柱的選擇SAs的多殘留檢測時，需要在一定的保留時間內完全出峰，因此對色譜柱的分離效果要求較高。SAs多殘留分析試驗中多采用C18柱、C8柱等以高純硅膠為基質且經端基封閉處理好的色譜柱，一般柱的規格為（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）或（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）。經試驗比較，（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）的色譜柱分離效果不夠理想，SAs多殘留分析時常常出現多種組分不能完全分離，半峰高以下部分完全結合的情況，直接造成分析結果不準確；（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）的色譜柱則可以使SAs所有組分完全分離，峰形對稱尖銳對稱性好，分析結果準確，在SAs多組分殘留分析時選用此規格的色譜柱最佳。

4.2流動相的選擇使用色譜技術分析SAs多殘留，其流動相一般由酸性溶液和有機試劑組成。SAs組分中含有對氨基苯磺酰胺的化學結構，水解后產物為呈酸堿兩性的磺酰胺基和伯胺基，流動相的pH變化會導致其解離狀態和溶解性的變化，因此流動相的pH對SAs組分在色譜柱上的分離效果以及保留時間會產生顯著影響。郭偉等試驗發現，流動相的酸度比較高時，各種SAs 分離效果不理想，酸度過低則有比較明顯的拖尾現象[33]。梯度洗脫是SAs的色譜分析技術中流動相的主要洗脫方式。高效液相色譜法（HPLC）初始流動相組合有V（2%乙酸）∶V（乙腈）=75∶25；V（甲醇）∶V（2%乙酸溶液）∶V（乙腈）=5∶85∶10 [34]等。

4.3檢測器的選擇

4.3.1 紫外檢測。SAs具有較強的紫外吸收，動物組織中SAs殘留可選擇用紫外檢測器檢測。郭萌萌等和牛曰華選擇高效液相色譜紫外檢測器快速測定水產品中多種磺胺類殘留，利用PDA二極管陣列檢測器獲得多種組分的光譜數據， 得出各種組分在190～ 400 nm范圍內有最大吸收[19，35]。其中幾種磺胺分別在230、250、285 nm左右有最大吸收，但都在270 nm左右有次強吸收，其余的多種磺胺在270 nm左右都有較強的吸收。經綜合比較，最終選定檢測波長為270 nm。磺胺類藥物在270 nm波長下有較高靈敏度，各組分保留時間比較穩定，能滿足磺胺類各組分的定性分析。

4.3.2熒光檢測。熒光檢測器具有較高靈敏度，比紫外檢測器高出百倍甚至幾千倍不等，SAs本身不具有熒光性質，有的熒光試劑對芳香族胺和初級脂肪族胺具有特異性，如熒光胺能與磺胺類藥物結合，之后產生選擇性的熒光體，有高熒光效應。從而具有激發-發射光譜特性，激發波長為λEx=395～405 nm，發射波長為λEm=480～510 nm，熒光胺及其水解產物都不具有熒光性。劉海新等采用熒光胺在線柱后衍生的方法檢測水產品中多種磺胺類藥物殘留，適當縮短分析時間，減少樣品處理過程中部分凈化步驟，消除部分基質干擾[6，27]。操作中也有提取液凈化后先用熒光胺衍生化反應再進樣分析的實例，此方法的優點是方便操作，缺點是熒光胺衍生化后響應值會降低，不利于長時間連續進樣分析。熒光檢測激發波長（λEx）較多選用400和405 nm，與之對應的發射波長（λEm）較多選用488和495 nm。

4.4 檢測限動物源性食品中SAs多殘留分析較多的是肌肉組織，樣品多為畜牧、家禽、水產品肌肉。也有少部分研究選動物內臟、皮膚等器官組織作為樣品[36]。由于檢測的SAs種類、源動物組織、前處理樣品方法以及檢測儀器的條件各不相同，動物源性食品中SAs多殘留的檢出限也有所不同。目前高效液相色譜法檢測水產品中SAs多殘留的檢出限主要在2.0～20.0 μg/kg。Kunihiro等用高效液相色譜法同時檢測雞肉、雞蛋、雞血漿中的磺胺二甲氧嘧啶以及其N4羥基乙酰化代謝產物，檢測限一般在10.0 μg/kg以上[37]。蘇敏等用熒光胺衍生化-液相色譜熒光檢測法檢測動物肝臟中10種磺胺類藥物殘留，進一步使SAs的檢測限降低到2.0 μg/kg[17]。

5 高效液相色譜串聯質譜法

HPLCMSMS是SAs殘留檢測的主要方法之一，也是農業部指定水產品中SAs殘留數據確證方法。研究發現，MS的檢測靈敏度較熒光檢測器高，檢測限大大降低，且檢測時間大大縮短，有效提高了檢測效率。如水產品中8種磺胺類檢測用液相色譜時間約為50 min，采用質譜檢測6.5 min之內全部出峰。采用MS分析時HPLCMSMS的初始流動相主要為V（5 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸）∶V（乙腈）=90∶10，或V（2 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸）∶V（乙腈）=90∶10，流速一般為0.2～0.3 ml/min。在多種藥物同時檢測時，為使藥物各種成分都處于檢測條件的最佳狀態，選擇流動相梯度洗脫程序。電噴霧離子源（ESI）、多反應監測模式（MRM）則是常用方式。孫偉紅等采用LCMSMS聯用法選擇反應監測（SRM）正離子模式測定，可同時對水產品中的18 種SAs進行定性和定量[1]。除磺胺胍和磺胺苯吡唑2種定量限為2.0 μg/kg，檢出限為1.0 μg/kg外，其他SAs的定量限均為1.0 μg/kg，檢出限則達0.5 μg/kg 以下。黎智廣等使用由0.1%甲酸和乙腈組成的流動相，采用多反應監測模式（MRM）對SAs進行定性與定量分析，SAs定量限均為1.0 μg/kg[38]。范瑩瑩等用高效液相色譜串聯質譜法檢測豬肉中5 種SAs的殘留，該方法能快速準確檢測豬肉中的磺胺類藥物，且檢出限較低，SAs最低檢出限達到0.1～0.5 μg/kg[22]。

安徽農業科學2015年6 結語

目前，高效液相色譜法（HPLC）是檢測動物源性食品中SAs多殘留的重要方法，高效液相色譜串聯質譜法（HPLCMSMS）是動物源性食品中SAs多殘留定量確證的主要方法，在具體試驗中需根據所檢測基質和SAs的種類以及檢測要求選擇適宜的前處理方法和色譜條件。HPLC測定SAs多殘留時有可能出現雜峰影響定性，故HPLCMSMS是SAs多殘留確證的主要方法。未來SAs多殘留分析的發展研究方向主要是定量檢測多組分，且能夠同時提供各種組分的結構信息，以達到未知組分得到充分確證的目的。

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