色譜法檢測(cè)動(dòng)物源食品中磺胺類藥物殘留研究進(jìn)展

摘要磺胺類藥物是一類可限量使用于水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜禽業(yè)的廣譜高效抗菌藥物，且被廣泛應(yīng)用。磺胺類在動(dòng)物源性食品中會(huì)有殘留，通過任何途徑攝入磺胺都有可能在人體內(nèi)蓄積而對(duì)人造成危害。目前，動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物多殘留的定量檢測(cè)主要有高效液相色譜法（HPLC）以及高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMSMS）。色譜法檢測(cè)磺胺類藥物的主要步驟為提取、濃縮、凈化和進(jìn)色譜柱分析。簡要綜述了色譜法檢測(cè)動(dòng)物源食品中磺胺類藥物的方法研究進(jìn)展，以期為動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物多殘留檢測(cè)提供參考。

關(guān)鍵詞磺胺類；殘留；檢測(cè)；動(dòng)物源食品；高效液相色譜；質(zhì)譜

中圖分類號(hào)S851.34+7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）26-330-03

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）是指具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜禽業(yè)，主要作為化學(xué)治療藥物用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病[1]。磺胺類藥物有較廣的抗菌譜，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌的抑制作用明顯[2]。可限量使用的磺胺類藥物是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中最常使用的抗生素之一，多用于養(yǎng)殖類水生生物的爛鰓病、腸炎病、弧菌病、癤瘡病、細(xì)菌性敗血病等。在生物體內(nèi)，磺胺類藥物有著比較長的作用時(shí)間和代謝時(shí)間，通過食物鏈等途徑攝入的磺胺類藥物都有可能蓄積在人體內(nèi)并富集，磺胺二甲嘧啶等甚至有引起潛在致癌性的可能[3]。人類造血系統(tǒng)會(huì)遭受磺胺類藥物殘留的破環(huán)，從而引發(fā)粒細(xì)胞缺乏癥、血小板減少癥、溶血性貧血癥等[4]；磺胺類藥物殘留也會(huì)引起人體過敏反應(yīng)，輕則出現(xiàn)蕁麻診或皮膚瘙癢，嚴(yán)重時(shí)則引起血管性水腫，甚至導(dǎo)致死亡[5]。世界上一些地區(qū)或國家對(duì)動(dòng)物源性食品中的磺胺類藥物最高殘留限量要求不斷提高[6]，歐盟、美國等地區(qū)或國家規(guī)定了動(dòng)物源性食品中單個(gè)磺胺以及總磺胺的最高殘留限量（MRLs）為100 μg/kg，而潛在致癌的磺胺二甲基嘧啶（SM2）最高殘留限量（MRLs）為25 μg/kg[7]。

Smedley MD等在20世紀(jì)90年代初用液相色譜法對(duì)牛奶中多種磺胺類殘留進(jìn)行檢測(cè)[8]，Tsai CE等用液相色譜法對(duì)雞血清和雞蛋中磺胺類殘留進(jìn)行檢測(cè)[9]，Ikai Y等用試劑盒對(duì)肉中的磺胺類殘留進(jìn)行檢測(cè)[10]。國內(nèi)出現(xiàn)的較早對(duì)磺胺類檢測(cè)的報(bào)道有楊紅建立的酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）對(duì)磺胺類檢測(cè)[11]，張素霞等對(duì)豬肌肉組織中磺胺類藥物的MSPD凈化和HPLC測(cè)定等[12]。適用于檢測(cè)動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物多組分殘留的方法比較多，目前國內(nèi)外報(bào)道的主要有微生物檢測(cè)法[13]、酶聯(lián)免疫分析法[14-15]、氣相色譜質(zhì)譜法[16]、高效液相色譜[17-19]、毛細(xì)管電泳（CE）法[20]，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLCMS）[21-22]。微生物檢測(cè)法存在菌種不易篩選、耗時(shí)長、穩(wěn)定性差、靈敏度低等缺點(diǎn)，不能滿足微量抗微生物藥殘留的實(shí)際樣品檢測(cè)工作的要求[23]；酶聯(lián)免疫法和放射免疫法主要應(yīng)用于快速檢測(cè)和簡單定性試驗(yàn)，時(shí)有假陽性或假陰性樣品出現(xiàn)；氣相色譜-質(zhì)譜法較為先進(jìn)，其特異性和靈敏度比較高，但需進(jìn)行繁瑣的衍生過程。帶選擇離子監(jiān)控的HPLCMSMS無需進(jìn)行繁瑣的衍生過程，但其普及不廣，應(yīng)用較少[24]；高效液相色譜紫外檢測(cè)法和毛細(xì)管電泳法受基質(zhì)雜峰干擾比較大，容易出現(xiàn)定性誤差；高效液相色譜熒光檢測(cè)靈敏度高、基質(zhì)干擾較小，是目前農(nóng)業(yè)部規(guī)定作定量的一種重要方法[25]；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMS）是目前最可靠的方法，其靈敏度高、定量準(zhǔn)確，是農(nóng)業(yè)部指定作為磺胺類檢測(cè)數(shù)據(jù)確證的方法[26]。

1樣品的提取

1.1試劑選擇磺胺類藥物不易溶于水，比較容易溶于有機(jī)溶劑、稀酸和稀堿[24]。動(dòng)物源性食品中SAs的提取試劑可以大致分為以下4種：①強(qiáng)極性有機(jī)溶劑提取，如乙腈、丙酮、乙酸乙酯等。方炳虎等選取乙酸乙酯作提取溶劑檢測(cè)了牛奶中12種磺胺類藥物[18]；張小軍等選用乙酸乙酯提取再用鹽酸萃取檢測(cè)了水產(chǎn)品中4種磺胺類藥物[24]；孫偉紅等選用乙腈并在其中添加1%甲酸作為提取溶劑檢測(cè)了水產(chǎn)品中18種磺胺類藥物[1]。②不溶于水的有機(jī)溶劑，如三氯甲烷和二氯甲烷。③易溶于水的有機(jī)溶劑添加一定比例的酸或堿和含水的乙腈或甲醇混合液提取，如水-乙腈-乙酸。劉海新選用加入水-乙腈-乙酸（90∶10∶0.2，V/V）溶液提取，再用乙腈重復(fù)提取殘?jiān)尤胨⒍蚀肌⒍燃淄檩腿『鬂饪s[27]。④緩沖溶液提取，如磷酸緩沖液；加入灼燒過的無水硫酸鈉除水和有機(jī)溶劑提取。李孟玻等先加無水硫酸鈉再用二氯甲烷在超聲處理?xiàng)l件下提取[28]。

使用乙腈提取時(shí)，需加入經(jīng)過灼燒的無水硫酸鈉，可促進(jìn)樣品蛋白質(zhì)變性分散以及防止水分進(jìn)入目標(biāo)提取液，使樣品分散效果較好，提取更加充分，且容易濃縮凈化[29]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMS）主要采用此提取方法。乙腈作為萃取溶劑使用時(shí)需要脫水，則會(huì)增加樣品預(yù)處理的操作步驟。經(jīng)試驗(yàn)比較得知，乙酸乙酯萃取效果較為理想，平均回收率在74.6%～98.9%。在使用酸或者堿溶液作反萃取的試驗(yàn)中，有機(jī)相提取液中磺胺類藥物的反萃取用2 mol/L的鹽酸效果最好，此方法平均回收率在81.6%～94.7%[24]。液相色譜法（HPLC）測(cè)定磺胺類主要使用該方法提取樣品。

1.2提取方式樣品提取主要采用獨(dú)立高速振蕩器勻質(zhì)、振蕩，或結(jié)合超聲技術(shù)提取。提取時(shí)需待冷凍的樣品解凍，離心管中不出現(xiàn)大塊樣品，勻質(zhì)或振蕩時(shí)間1 min以上，保證充分提取。王靜等采用加速溶劑萃取法（ASE）提取水產(chǎn)品中的SAs，提高了檢測(cè)結(jié)果的回收率和精密度，降低基質(zhì)干擾，并且開發(fā)出一種新的可同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中13種磺胺類的方法，方法簡便準(zhǔn)確，13種藥物完全分離，重現(xiàn)性高[30]。

2凈化

色譜法分析SAs多殘留主要有液-液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）2種凈化方法，實(shí)際分析過程中需根據(jù)樣品基質(zhì)的性質(zhì)和提取溶劑選擇合適的凈化方法。樣品提取液凈化的基本方法是LLE，原理是互不相溶的試劑對(duì)待測(cè)SAs組分和雜質(zhì)溶解性的差異進(jìn)行分配。選用乙腈和乙酸乙酯作為提取劑時(shí)，常用的除脂試劑為正己烷，其凈化效果較好。乙腈與正己烷具有互溶性，導(dǎo)致SAs加標(biāo)回收率有所降低，朱曉華等使用正己烷去脂前則先用乙腈對(duì)正己烷進(jìn)行飽和[31]。SPE已逐步代替了樣品易乳化、消耗高純?nèi)軇┝看蟆⒉僮髻M(fèi)時(shí)等不足的LLE。SPE凈化時(shí)溶劑量消耗較少且不產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，是SAs提取液凈化最常選用的方法，該方法主要用于緩沖溶液和極性溶劑提取SAs之后。凈化常用的SPE柱主要是硅膠鍵合C8或C18的反相柱以及硅膠鍵合丙酸基或者苯磺酸基等基團(tuán)的離子交換柱（如PRS、MPC、SCX），聚合物基質(zhì)的SPE柱（如HLB柱）使得SPE技術(shù)得到更為廣泛的應(yīng)用。

有研究者以基質(zhì)固相分散技術(shù)（MSPD）與HPLC相結(jié)合的方法來測(cè)定牛奶中8種常見的磺胺類藥物殘留，如余輝菊等的研究[32]等。多種磺胺類藥物都是具有一定極性的化合物，具有極性的吸附劑對(duì)此類磺胺類藥物吸附效果更好，C18、中性氧化鋁、酸性氧化鋁等對(duì)磺胺類藥物則不具有較高的吸附回收率。硅酸鎂和堿性氧化鋁也適用于牛奶中磺胺類藥物多殘留的MSPD分離。龐國芳等重點(diǎn)對(duì)比了三氯甲烷提取+硅膠柱凈化、Na2EDTAMcllvaine緩沖溶液提取+Oasis HLB固相萃取柱凈化、乙腈提取+氧化鋁柱凈化和乙腈提取蒸干后用正己烷去除脂肪4種提取凈化體系[21]。三氯甲烷作為提取劑，提取液中會(huì)有較多的脂肪，再經(jīng)硅膠柱凈化后會(huì)直接影響到磺胺類的回收率。提取劑為Na2EDTAMcllvaine緩沖溶液時(shí)，目標(biāo)提取液經(jīng)Oasis HLB固相萃取柱凈化，分析得出回收率和穩(wěn)定性都較差。選擇乙腈提取劑加正己烷除脂肪凈化的方法所得目標(biāo)提取液得到明顯凈化，結(jié)果顯示磺胺類藥物的回收率較高。

3 提取液濃縮

樣品提取液濃縮至干會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物溶解不充分，凈化后氮吹儀水浴和真空旋轉(zhuǎn)水浴蒸發(fā)濃縮到目標(biāo)量1 ml左右。當(dāng)樣品提取液量大于15 ml時(shí)應(yīng)該選擇真空旋轉(zhuǎn)水浴蒸發(fā)，旋蒸過程中產(chǎn)生爆沸、氮吹過程中氮?dú)饬魉龠^大均會(huì)導(dǎo)致回收率偏低。SAs熱穩(wěn)定姓良好，故旋蒸和氮吹對(duì)水浴溫度要求不高，一般45～60 ℃對(duì)目標(biāo)物回收率沒有明顯影響。

4高效液相色譜法

4.1 色譜柱的選擇SAs的多殘留檢測(cè)時(shí)，需要在一定的保留時(shí)間內(nèi)完全出峰，因此對(duì)色譜柱的分離效果要求較高。SAs多殘留分析試驗(yàn)中多采用C18柱、C8柱等以高純硅膠為基質(zhì)且經(jīng)端基封閉處理好的色譜柱，一般柱的規(guī)格為（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）或（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）。經(jīng)試驗(yàn)比較，（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）的色譜柱分離效果不夠理想，SAs多殘留分析時(shí)常常出現(xiàn)多種組分不能完全分離，半峰高以下部分完全結(jié)合的情況，直接造成分析結(jié)果不準(zhǔn)確；（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）的色譜柱則可以使SAs所有組分完全分離，峰形對(duì)稱尖銳對(duì)稱性好，分析結(jié)果準(zhǔn)確，在SAs多組分殘留分析時(shí)選用此規(guī)格的色譜柱最佳。

4.2流動(dòng)相的選擇使用色譜技術(shù)分析SAs多殘留，其流動(dòng)相一般由酸性溶液和有機(jī)試劑組成。SAs組分中含有對(duì)氨基苯磺酰胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)，水解后產(chǎn)物為呈酸堿兩性的磺酰胺基和伯胺基，流動(dòng)相的pH變化會(huì)導(dǎo)致其解離狀態(tài)和溶解性的變化，因此流動(dòng)相的pH對(duì)SAs組分在色譜柱上的分離效果以及保留時(shí)間會(huì)產(chǎn)生顯著影響。郭偉等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相的酸度比較高時(shí)，各種SAs 分離效果不理想，酸度過低則有比較明顯的拖尾現(xiàn)象[33]。梯度洗脫是SAs的色譜分析技術(shù)中流動(dòng)相的主要洗脫方式。高效液相色譜法（HPLC）初始流動(dòng)相組合有V（2%乙酸）∶V（乙腈）=75∶25；V（甲醇）∶V（2%乙酸溶液）∶V（乙腈）=5∶85∶10 [34]等。

4.3檢測(cè)器的選擇

4.3.1 紫外檢測(cè)。SAs具有較強(qiáng)的紫外吸收，動(dòng)物組織中SAs殘留可選擇用紫外檢測(cè)器檢測(cè)。郭萌萌等和牛曰華選擇高效液相色譜紫外檢測(cè)器快速測(cè)定水產(chǎn)品中多種磺胺類殘留，利用PDA二極管陣列檢測(cè)器獲得多種組分的光譜數(shù)據(jù)， 得出各種組分在190～ 400 nm范圍內(nèi)有最大吸收[19，35]。其中幾種磺胺分別在230、250、285 nm左右有最大吸收，但都在270 nm左右有次強(qiáng)吸收，其余的多種磺胺在270 nm左右都有較強(qiáng)的吸收。經(jīng)綜合比較，最終選定檢測(cè)波長為270 nm。磺胺類藥物在270 nm波長下有較高靈敏度，各組分保留時(shí)間比較穩(wěn)定，能滿足磺胺類各組分的定性分析。

4.3.2熒光檢測(cè)。熒光檢測(cè)器具有較高靈敏度，比紫外檢測(cè)器高出百倍甚至幾千倍不等，SAs本身不具有熒光性質(zhì)，有的熒光試劑對(duì)芳香族胺和初級(jí)脂肪族胺具有特異性，如熒光胺能與磺胺類藥物結(jié)合，之后產(chǎn)生選擇性的熒光體，有高熒光效應(yīng)。從而具有激發(fā)-發(fā)射光譜特性，激發(fā)波長為λEx=395～405 nm，發(fā)射波長為λEm=480～510 nm，熒光胺及其水解產(chǎn)物都不具有熒光性。劉海新等采用熒光胺在線柱后衍生的方法檢測(cè)水產(chǎn)品中多種磺胺類藥物殘留，適當(dāng)縮短分析時(shí)間，減少樣品處理過程中部分凈化步驟，消除部分基質(zhì)干擾[6，27]。操作中也有提取液凈化后先用熒光胺衍生化反應(yīng)再進(jìn)樣分析的實(shí)例，此方法的優(yōu)點(diǎn)是方便操作，缺點(diǎn)是熒光胺衍生化后響應(yīng)值會(huì)降低，不利于長時(shí)間連續(xù)進(jìn)樣分析。熒光檢測(cè)激發(fā)波長（λEx）較多選用400和405 nm，與之對(duì)應(yīng)的發(fā)射波長（λEm）較多選用488和495 nm。

4.4 檢測(cè)限動(dòng)物源性食品中SAs多殘留分析較多的是肌肉組織，樣品多為畜牧、家禽、水產(chǎn)品肌肉。也有少部分研究選動(dòng)物內(nèi)臟、皮膚等器官組織作為樣品[36]。由于檢測(cè)的SAs種類、源動(dòng)物組織、前處理樣品方法以及檢測(cè)儀器的條件各不相同，動(dòng)物源性食品中SAs多殘留的檢出限也有所不同。目前高效液相色譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中SAs多殘留的檢出限主要在2.0～20.0 μg/kg。Kunihiro等用高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)雞肉、雞蛋、雞血漿中的磺胺二甲氧嘧啶以及其N4羥基乙酰化代謝產(chǎn)物，檢測(cè)限一般在10.0 μg/kg以上[37]。蘇敏等用熒光胺衍生化-液相色譜熒光檢測(cè)法檢測(cè)動(dòng)物肝臟中10種磺胺類藥物殘留，進(jìn)一步使SAs的檢測(cè)限降低到2.0 μg/kg[17]。

5 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

HPLCMSMS是SAs殘留檢測(cè)的主要方法之一，也是農(nóng)業(yè)部指定水產(chǎn)品中SAs殘留數(shù)據(jù)確證方法。研究發(fā)現(xiàn)，MS的檢測(cè)靈敏度較熒光檢測(cè)器高，檢測(cè)限大大降低，且檢測(cè)時(shí)間大大縮短，有效提高了檢測(cè)效率。如水產(chǎn)品中8種磺胺類檢測(cè)用液相色譜時(shí)間約為50 min，采用質(zhì)譜檢測(cè)6.5 min之內(nèi)全部出峰。采用MS分析時(shí)HPLCMSMS的初始流動(dòng)相主要為V（5 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸）∶V（乙腈）=90∶10，或V（2 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸）∶V（乙腈）=90∶10，流速一般為0.2～0.3 ml/min。在多種藥物同時(shí)檢測(cè)時(shí)，為使藥物各種成分都處于檢測(cè)條件的最佳狀態(tài)，選擇流動(dòng)相梯度洗脫程序。電噴霧離子源（ESI）、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）則是常用方式。孫偉紅等采用LCMSMS聯(lián)用法選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）正離子模式測(cè)定，可同時(shí)對(duì)水產(chǎn)品中的18 種SAs進(jìn)行定性和定量[1]。除磺胺胍和磺胺苯吡唑2種定量限為2.0 μg/kg，檢出限為1.0 μg/kg外，其他SAs的定量限均為1.0 μg/kg，檢出限則達(dá)0.5 μg/kg 以下。黎智廣等使用由0.1%甲酸和乙腈組成的流動(dòng)相，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）對(duì)SAs進(jìn)行定性與定量分析，SAs定量限均為1.0 μg/kg[38]。范瑩瑩等用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)豬肉中5 種SAs的殘留，該方法能快速準(zhǔn)確檢測(cè)豬肉中的磺胺類藥物，且檢出限較低，SAs最低檢出限達(dá)到0.1～0.5 μg/kg[22]。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2015年6 結(jié)語

目前，高效液相色譜法（HPLC）是檢測(cè)動(dòng)物源性食品中SAs多殘留的重要方法，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMSMS）是動(dòng)物源性食品中SAs多殘留定量確證的主要方法，在具體試驗(yàn)中需根據(jù)所檢測(cè)基質(zhì)和SAs的種類以及檢測(cè)要求選擇適宜的前處理方法和色譜條件。HPLC測(cè)定SAs多殘留時(shí)有可能出現(xiàn)雜峰影響定性，故HPLCMSMS是SAs多殘留確證的主要方法。未來SAs多殘留分析的發(fā)展研究方向主要是定量檢測(cè)多組分，且能夠同時(shí)提供各種組分的結(jié)構(gòu)信息，以達(dá)到未知組分得到充分確證的目的。

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