重組乳酸乳球菌對模擬胃腸道的耐受力研究

摘要

[目的]研究重組菌株在不同pH胃液和膽鹽濃度腸液中的生存情況，驗證重組菌株能否在腸道中發(fā)揮作用，為其制備基因工程活載體疫苗、新型免疫型微生態(tài)制劑及功能發(fā)酵食品提供理論依據(jù)。 [方法]人工模擬人體胃腸道環(huán)境，研究表達(dá)金黃色葡萄球菌纖黏蛋白原凝集素A（ClfA）的重組乳酸乳球菌MG1363/pMG36cclfA菌株在不同pH胃液和膽鹽濃度的腸液中的耐受力。 [結(jié)果]重組菌株在pH 3.0的人工胃液中處理2 h后，存活率約為88.6%；在0.3%膽鹽濃度的人工腸液中處理2和4 h后，存活率約為83.6%和68.2%。[結(jié)論]重組菌株對胃腸道環(huán)境有較強(qiáng)的耐受力，適合制備基因工程活載體疫苗、新型免疫型微生態(tài)制劑及功能發(fā)酵食品。

關(guān)鍵詞重組乳酸乳球菌；金黃色葡萄球菌；纖黏蛋白原凝集素A；模擬胃腸道；耐受力

中圖分類號S188文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2015）26-027-03

Abstract [Objective] Survival condition of the recombinant strains in different pH gastric juice and different bile salt concentration of intestinal juice was studied， and verified whether recombinant strains could play a role in the intestinal tract. The study provided theoretical basis for the preparation of genetic engineering live carrier vaccine and new type immune probiotics and fermented food.[Method] Artificial simulating human gastrointestinal tract environment， the tolerance of recombinant Lactococcus lactis MG1363/pMG36cclfA strain with expressing fibrinogen lectin A of Staphylococcus aureus in different pH value gastric juice and different bile salt concentration of intestinal fluid were studied. [Result]The results showed that the recombinant strain was treated with 3 h in artificial gastric juice of pH 2，the survival rate was about 88.6%；in the 0.3% concentration of bile salts in artificial intestinal juice 2 and 4 h，the survival rate was 83.6% and 68.2%.[Conclusion]The recombinant strains had good tolerance to the gastrointestinal tract，it was suitable for the preparation of gene engineering live vector vaccine，new type immune microecological preparation and functional fermented food.

Key words Recombinant Lactococcus lactis；Staphylococcus aureus ；Fibrinogen lectin A；Simulated gastrointestinal tract；Tolerance

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種人畜共患病的重要致病菌，可引起人體局部化膿感染、肺炎、偽膜性腸炎、心包炎甚至敗血癥、膿毒血癥等[1-2]，美國每年因被金黃色葡萄球菌感染而喪生的人數(shù)已超過死于艾滋病人數(shù)[3]。同時，金黃色葡萄球菌也是國內(nèi)外最常見的細(xì)菌性食物中毒病原之一，由其引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的33%[4-5]。在動物感染方面，金黃色葡萄球菌可引起牛羊乳房炎、豬羊皮炎和流產(chǎn)、羔羊敗血病、馬創(chuàng)傷性感染、膿腫、蜂窩織炎、雞的壞疽性皮炎、敗血病等疾病，造成了我國每年上百億元的經(jīng)濟(jì)損失[6]。因此，金黃色葡萄球菌的防治具有重要意義。

目前，金黃色葡萄球菌的防治主要依靠抗生素和疫苗。抗生素在過去的使用歷史中，對治療感染作出了重要貢獻(xiàn)。然而，其引發(fā)的負(fù)面效應(yīng)已成為關(guān)注的焦點：使用抗生素易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療用藥量及飼料用藥升高；抗生素的使用使機(jī)體抵抗力下降，易發(fā)生各種細(xì)菌性及病毒性疾病；養(yǎng)殖業(yè)中使用的抗生素經(jīng)過食物鏈進(jìn)入人體，危害人類健康[7-8]。

疫苗方面目前市場上主要以傳統(tǒng)疫苗和亞單位疫苗為主，兩者均存在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答之前發(fā)生降解的可能，防治效果不明顯；基因工程疫苗是利用基因工程和分子生物學(xué)技術(shù)，將引起病原感染的主要抗原組分制成重組菌、蛋白、多肽或裸DNA的形式，通過免疫感染對象使機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，從技術(shù)水平上基因工程疫苗領(lǐng)先于傳統(tǒng)疫苗和亞單位疫苗。常見的幾種基因工程疫苗包括基因工程亞單位疫苗、重組活載體疫苗、核酸疫苗（DNA疫苗）、合成肽疫苗和基因缺失疫苗等。目前，以乳酸乳球菌為載體的基因工程重組活載體疫苗是研究的熱點[6，9]。

為探討前期構(gòu)建的表達(dá)金黃色葡萄球菌纖黏蛋白原凝集素A（ClfA）的重組乳酸乳球菌MG1363/pMG36cclfA菌株作為微生態(tài)制劑應(yīng)用的可能性，筆者人工模擬人體胃腸道環(huán)境，研究重組菌株在不同pH胃液和膽鹽濃度的腸液中的生存情況，驗證重組菌株能否在腸道中發(fā)揮作用，為其下一步制備基因工程活載體疫苗、新型免疫型微生態(tài)制劑及功能發(fā)酵食品提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株。重組乳酸乳球菌（MG1363/pMG36cclfA）由黑龍江省科學(xué)院微生物研究所應(yīng)用醫(yī)學(xué)微生物研究室構(gòu)建。

1.1.2試劑。胃蛋白酶（Pepsin，酶活力≥1 200.0 U/g）、胰蛋白酶（Trypsin，酶活力≥2 500.0 U/mg）、牛膽鹽購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基購自北京陸橋公司；PBS緩沖液參照諸葛健等[10]方法配制，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min備用。

1.2方法

1.2.1重組乳酸乳球菌對人工胃液耐受情況。參照Galindo[11]的方法，將重組乳酸乳球菌接種于100 ml MRS肉湯培養(yǎng)基中，30 ℃靜止培養(yǎng)28 h，4 ℃、4 000 r/min離心20 min，收集沉淀，用30 ml 0.1 mol/L PBS（pH 6.0）洗滌3次，沉淀溶于30 ml 0.1 mol/L PBS（pH 6.0）中，用細(xì)菌麥?zhǔn)媳葷醿x精確校正菌液濃度6.0×108 CFU/ml左右。

參照劉蕓等[12]的方法，模擬胃液環(huán)境，取5 ml精確校正菌液加入20 ml 0.1 mol/L PBS（pH 6.0），按1%比例添加胃蛋白酶，混勻，迅速用1 mol/L HCl將混勻液pH分別調(diào)至2.0、2.5、3.0。37 ℃靜止培養(yǎng)0、2、4 h后分別取樣，用無菌水梯度稀釋，取各稀釋度菌液0.1 ml，涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板上，每個梯度3個重復(fù)，30 ℃靜止培養(yǎng)48 h后進(jìn)行平板菌落計數(shù)。

1.2.2重組乳酸乳球菌對人工腸液耐受情況。參照Galindo[11]的方法培養(yǎng)、收集重組乳酸乳球菌菌體，用30 ml 0.1 mol/L PBS（pH 6.8）離心洗滌3次，沉淀溶于30 ml 0.1 mol/L PBS（pH 6.8）中，用細(xì)菌麥?zhǔn)媳葷醿x精確校正菌液濃度6.0×108 CFU/ml左右。

參照劉蕓等[12]的方法，模擬腸液環(huán)境，取5 ml 校正菌液加入20 ml 0.1 mol/L PBS（pH 6.8），按1%比例添加胰蛋白酶，混勻，迅速加入牛膽鹽，將混勻液膽鹽濃度分別調(diào)為0.1%、0.3%、0.5%。37 ℃靜止培養(yǎng)0、2、4 h后分別取樣，用無菌水梯度稀釋，取各稀釋度菌液0.1ml，涂布MRS固體培養(yǎng)基平板，每個梯度3個重復(fù)，30 ℃靜止培養(yǎng)48 h后進(jìn)行平板菌落計數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)處理細(xì)菌數(shù)量均為3個重復(fù)的平均值。試驗數(shù)據(jù)用簡明統(tǒng)計軟件計算，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2結(jié)果與分析

2.1人工胃液對重組乳酸乳球菌存活的影響

由表1可知，重組乳酸乳球菌在不同pH和培養(yǎng)時間下，其存活率差別較大，人工胃液的pH越低，處理時間越長，重組乳酸乳球菌存活率越低。

在pH 2.0條件下，處理2 h后，重組乳酸乳球菌存活率為0.42%；處理4 h后，存活率為0.09%。在pH 2.5條件下，處理2 h后，重組乳酸乳球菌存活率為2.71%；處理4 h后，存活率為1.19%。

在pH 3.0條件下，處理2 h后，重組乳酸乳球菌存活數(shù)為5.27×108 CFU/ml，存活率達(dá)到88.62%；處理4 h后，重組乳酸乳球菌存活數(shù)為3.97×108 CFU/ml，存活率仍達(dá)到66.74%，表現(xiàn)出良好的耐酸、耐蛋白酶特性。

2.2人工腸液對重組乳酸乳球菌存活的影響

由表2可知，隨著膽鹽濃度的升高，重組乳酸乳球菌的存活數(shù)和存活率有所降低，但下降的幅度不大，都與初始菌數(shù)保持在同一數(shù)量級，表現(xiàn)對膽鹽的良好耐受性。

0.1%膽鹽濃度的人工腸液對重組乳酸乳球菌生長幾乎沒有影響，處理2和4 h后，重組乳酸乳球菌存活數(shù)分別為6.93×108和7.27×108 CFU/ml，存活率分別為115.56%和121.11%。

0.3%膽鹽濃度的人工腸液對重組乳酸乳球菌生長影響較小，存活率隨著處理時間的延長而有所下降，處理2和4 h后，重組乳酸乳球菌存活數(shù)分別為5.07×108和4.13×108 CFU/ml，存活率分別為83.60%和68.20%。

0.5%膽鹽濃度的人工腸液對重組乳酸乳球菌生長影響大于0.1%和0.3%，處理2和4 h后，重組乳酸乳球菌存活數(shù)分別為3.73×108和3.10×108 CFU/ml，存活率分別為61.98%和51.47%，但都與初始菌數(shù)保持在同一數(shù)量級水平。

3討論

乳酸乳球菌是安全級的微生物，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，是乳酸菌的重要模式菌。以乳酸乳球菌作為宿主菌表達(dá)異源蛋白和酶，已成為生物制藥、疫苗和食品工業(yè)研究的熱點。

該研究人工模擬人體胃腸道環(huán)境，對前期構(gòu)建的表達(dá)金黃色葡萄球菌纖黏蛋白原凝集素A（ClfA）的重組乳酸乳球菌MG1363/pMG36cclfA菌株進(jìn)行胃腸道耐受力評價。人體胃液與食物混合后的pH約為3.0，且流體類食物的胃排空時間很短，遠(yuǎn)低于一般食物3～4 h的排空時間，因此，該研究設(shè)定了pH 2.0、2.5、3.0和2、4 h的處理時間組。據(jù)相關(guān)報道，攝入含有1.0×106 CFU/ml以上的活性乳酸菌能充分發(fā)揮其益生的功效[13-15]，重組乳酸乳球菌在pH 3.0的人工胃液中處理2 h后，存活率約為88.62%，處理4 h后，存活率仍在66.74%左右，且存活數(shù)均在3.97×108 CFU/ml以上，表明重組菌株對低pH環(huán)境和胃蛋白酶有較強(qiáng)的耐受力，能夠保持較高濃度的活菌數(shù)順利通過胃抵達(dá)腸道。

對于益生菌而言，對腸液的耐受能力要比其對胃液的耐受能力更為重要[12]。對于低pH和富含蛋白酶的胃液，可采用腸溶膠囊或制備微膠囊等手段保護(hù)耐酸、耐蛋白酶能力弱的菌株，使其順利抵達(dá)腸道。而重組菌株若想發(fā)揮其黏膜免疫、益生功能，必須具備在腸道中存活的能力。食物通過小腸的平均時間約為1.5 h[16]，正常人體小腸液中膽汁濃度為0.03%～0.30%[17]，因此，該研究設(shè)定了膽鹽濃度0.1%、0.3%、0.5%和2、4 h的處理時間組。結(jié)果表明，重組菌株在0.3%和0.5%膽鹽濃度的人工模擬腸液中處理2和4 h后，均有較高的存活率，且存活數(shù)與初始菌數(shù)保持在同一數(shù)量級水平，證實了重組菌株能夠耐受小腸高濃度膽鹽環(huán)境并大量存活，進(jìn)而發(fā)揮其黏膜免疫和益生功效。

綜上所述，重組乳酸乳球菌MG1363/pMG36cclfA菌株具有較強(qiáng)的耐酸、耐蛋白酶、耐膽鹽能力，可順利通過胃腸道，在小腸中大量存活，進(jìn)而發(fā)揮其黏膜免疫作用和益生菌所具備的其他功能，在制備基因工程活載體疫苗和新型免疫型微生態(tài)制劑方面具有廣闊的應(yīng)用潛力。

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