柿子葉提取物對酪氨酸酶的抑制作用

摘要[目的] 測定柿子葉不同提取物對酪氨酸酶的抑制作用。[方法] 以多巴為底物，利用酪氨酸酶與多巴反應生成紅色多巴醌的原理，用酶標儀檢測柿子葉不同提取物對酪氨酸酶的抑制作用。[結果] 柿子葉的乙醚萃取物對酪氨酸酶有最大抑制，最大抑制率為43.5%，半數抑制濃度（IC50）為0.591 mg/ml。

[結論] 柿子葉的乙醚提取物對酪氨酸酶具有較強的抑制作用，具有一定的美白功效。

關鍵詞酪氨酸酶抑制劑；柿葉；多酚類物質

中圖分類號S-03文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）26-008-03

Abstract[Objective] The inhibition of persimmon leaves extract on tyrosinase was determined. [Method] The effect of extract on the activity of tyrosinase was investigated using LDOPA. [Result] The inhibition of the separation of the ether parts relative to other components on tyrosinase was the highest， and the maximum inhibition rate was 43.5%， IC50 was 0.591 mg/ml. [Conclusion]The ether extract of persimmon leaves extract had the strong inhibition on tyrosinase and played a role in whitening effect.

Key wordsTyrosinase inhibitor； Persimmon leaves； Olyphenols酪氨酸酶[1]（Tyrosinase，EC.1.14.18.1）又稱多酚氧化酶（PPO），廣泛存在于微生物、動植物及人體中，是結構復雜的含銅氧化還原酶。酪氨酸酶在黑色素合成過程中起著關鍵作用。造成皮膚黑色素生成的原因有多種，如遺傳因素和環境因素。目前研究結果基本上認為其成因在于皮膚細胞

中的酪氨酸在酪氨酸酶的作用下逐漸氧化為多巴（Dopa）、多巴醌（Dopaquinone），生成的這些醌類物質易于多聚化，并與細胞內蛋白作用，生成黑色或棕色的色素沉淀，最后逐步轉化為皮膚黑色素（Tyrsinemelanin）[2]，其反應式見圖1。

酪氨酸酶的雙核銅中心結構[3]如圖 2 所示。每個銅離子由3個組氨酸殘基的亞氨基共價結合固定在活性中心上，其中2個組氨酸在橫向，結合較強，有一個在軸向，結合較弱。2個銅離子之間結合氧原子，形成電子通路。銅離子結合氧原子的個數并不是固定不變的。根據銅離子結合氧原子數的不同，酪氨酸酶可分為氧化態（Eoxy）、還原態（Emet）和脫氧態（Edeoxy）3種型態。這3種酶形態的存在和相互轉化是酪氨酸酶獨特的雙重催化功能的基礎。

氧化態的酶單酚、雙酚均可結合，單酚和雙酚循環均參與。與雙酚結合，經一步反應后釋放出醌，轉化為還原態酶。還原態的酶單酚、雙酚都可結合，但與單酚結合時進入一條死循環途徑，不參與正常產物的生成；與雙酚結合時，參與雙酚途徑。脫氧態的酶不可與單酚雙酚結合，只能結合氧轉化成為氧化態酶，是酶經單酚雙酚循環后的終態。3種酶型態[4]相互轉換，即氧化態酶去氧生成還原態酶，還原態酶脫氧生成脫氧態酶，而氧化態酶和脫氧態酶通過釋放和結合氧氣又可逆轉化。

皮膚黑色素細胞組織將黑色素轉移到表皮基底層細胞中，隨著細胞的新陳代謝而被帶到角質層中，最后隨角度化細胞脫落。若皮膚黑色素增長過快、過多或在皮膚中分布不均，則皮膚階段性變黑，即局部色素沉著。因此，皮膚美白劑就是可以控制黑色素生成過程的物質。由于酪氨酸酶在

合成黑色素的酪氨酸轉化為多巴和多巴醌 2個過程

中起限速作用，目前的皮膚美白劑大多是通過抑制酪氨酸酶活性，從而減少黑色素的生成，達到美白皮膚的效果。柿葉[4]為柿樹科（Ebenaceae）柿樹屬（Diospyros）植物柿（Diospyros kaki L.f.）的新鮮或干燥葉。全世界柿樹有6屬450余種，其中我國有2屬50多種。我國是世界上最主要的柿樹生產國，目前栽培面積約2.0×105 hm2，年產柿子5.0×105 t，占世界總產量的50%以上。柿葉具有較高的營養價值和醫療保健作用。柿葉[5]含有豐富的維生素C、蘆丁、膽堿、黃酮苷、胡蘿卜素、多種氨基酸及鐵、鋅、鈣等對人體健康有益的營養成分。據測定，每百克柿葉中含有蛋白質11.05 g、脂肪6.84 g、糖類54.84 mg、維生素C 704 mg、膽堿317 mg、蘆丁121.34 mg，其中尤以維生素C含量為多，比一般水果高幾倍到幾十倍。柿葉具有抗菌消炎、生津止渴、清熱解毒、潤肺強心、鎮咳止血、抗癌防癌、美白、祛斑、抗衰老等醫療保健功能。多酚是柿葉中重要的活性成分，柿葉中的多酚類物質又被稱柿葉單寧。柿的澀味[6]和很多藥理作用都與其有關[7]。多酚化合物（Polyphenol）是一類廣泛存在于植物體內的含有酚羥基化合物的總稱，主要存在于植物的根、皮、葉、果中。植物多酚[8]來源于莽草酸途徑和苯丙氨酸代謝途徑，具有芳環結構，并且結合一個或多個酚羥基。這種獨特結構使其具有很多的藥理保健功能，如清除體內自由基、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、美白、解蛇毒以及除臭等，是目前天然產物中研究較多的一個化學成分，已被廣泛應用在食品、化妝品、醫藥以及保健品等領域。

隨著人們現代生活越來越優越，很多女性對美麗的追求也愈加強烈，對美白產品的需求量不斷增大。酪氨酸酶抑制劑能夠抑制黑色素的生成，達到美白作用。研究柿葉對酪氨酸酶的抑制作用是非常有意義的。

1材料與方法

1.1供試材料供試

香蕉購買自商洛市場，置于-10 ℃冰箱中保存。9月在商洛學院內采摘柿葉，洗凈，于55 ℃烘箱中烘干，保存。

1.2試驗方法

1.2.1酪氨酸酶制備與活力測定。

1.2.1.1酪氨酸酶制備。

從冰箱中取出香蕉，去皮，稱取100 g，加入100 ml 0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.6）置于打漿機中破碎，冰水浴條件下充分勻漿，再放入超聲細胞破碎儀中破碎10 min；4 000 r/min 4 ℃離心10 min，取100 ml粗酶液，置于冰水浴中，同時放置于磁力攪拌器上，邊攪拌邊加入研磨好的硫酸銨固體，至硫酸銨的最終濃度為30%；冰水浴中繼續攪拌20 min，充分沉淀后4 ℃ 4 000 r/min二次離心10 min，棄去沉淀物；對離心所得上清液進行二次鹽析至硫酸銨終濃度為55%，持續攪拌20 min后，以4 ℃ 10 000 r/min 3次離心10 min，沉淀物用0.1 mol/L pH 7.6磷酸緩沖液溶解后再以4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄去不溶物，上清液為所得酶液[9]。

1.2.1.2酶活力測定。

取0.1 ml粗酶液于10 ml比色管中，加入2.9 ml 0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.6），再加入0.1 mg/ml多巴溶液1 ml，同時開始計時，用分光光度計在475 nm處測定吸光度，開始時6 min內每分鐘讀1個數，每隔2 min讀1個數，直至吸光度變化不大為止，記錄每組數據[10]。在此條件下，以每分鐘催化生成1 mol多巴醌的酶量定義為一個活力單位。

1.2.2柿葉提取物的制備與活力測定。

1.2.2.1柿葉活性成分提取。

柿葉粉碎，過50目篩，稱取200 g粉末于含鹽酸1.2%的無水甲醇中，在料液比1∶10、溫度55 ℃的條件下超聲萃取60 min，過濾，減壓濃縮后得到柿葉提取液。將提取液分別加入到100 ml石油醚、乙醚、乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮至10 ml，放入50 ℃恒溫箱中烘干，得到石油醚萃取物、乙醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及萃取后剩余物。

1.2.2.2柿葉提取物對酪氨酸酶的抑制[11]。

準確稱取石油醚萃取物、乙醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及萃取后剩余物各10 mg，用0.1 mol/ml磷酸緩沖液（pH 7.6）配制成1 mg/ml的4組溶液。

取6支干凈的1 ml試管，編號1～6。1～4號為試驗組，5號為對照組，6為空白組。1～4每個試管分別加入0.1 mg/ml 多巴溶液0.2 ml、酶液0.2 ml。向1號試管再加入1 mg/ml石油醚萃取溶液0.2 ml，向2號試管加入1 mg/ml乙醚萃取溶液0.2 ml，向3號試管加入1 mg/ml乙酸乙酯萃取溶液0.2 ml，向4號試管加入0.1 ml萃取后剩余溶液0.2 ml，向5號試管加入0.3 ml多巴溶液和0.3 ml酶液，向6號試管加入0.6 ml多巴溶液。在各組分混合均勻后，放入37 ℃的恒溫箱中孵化20 min。用移液槍每組吸取0.2 ml于96孔板中，于475 nm處測量其吸光度。該試驗共設3個平行組。

1.2.2.3乙醚萃取物對酪氨酸酶抑制率的測定。

準確稱取乙醚萃取物，用0.1 mol/ml磷酸緩沖液（pH 7.6）配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/ml的待測組。

取8支干凈的1 ml試管，同時編號1～8。其中，1～6號試管為試驗組，7號試管為對照組，8號試管為試驗組。1～6號試管分別加入配制好的0.1 mg/ml的多巴溶液0.2 ml、酶液0.2 ml。向1號試管再加入0.1 mg/ml配制好的乙醚萃取溶液0.2 ml，向2號試管加入0.2 mg/ml配制好的乙醚萃取溶液0.2 ml，其余試管依次加入配制好的不同濃度乙醚萃取溶液各0.2 ml。各組分別混合均勻后放入37 ℃搖床培養箱中孵育20 min。用移液槍每組吸取0.2 ml于96孔板中，于475 nm處測量其吸光度。該試驗共設3個平行組。

2結果與分析

2.1酪氨酸酶活力分析

以時間為橫坐標，以吸光度為縱坐標，做出酶反應過程曲線。由圖4可知，樣品的吸光度在前4 min的變化基本趨于一條直線，做直線方程：y=0.161x+0.176，斜率k=0.161。根據直線斜率和下面公式[12]，可求得酶活為1.79 U/ml。

2.2柿葉對酪氨酸酶的抑制活性

2.2.1柿葉不同提取物對酪氨酸酶的抑制。由圖5可知，乙醚萃取部分2組（乙醚萃取部分）對酪氨酸酶有明顯抑制，1組（石油醚萃取部分）和3組（乙酸乙酯萃取部分）對酪氨酸酶有抑制，但抑制程度不大，而4組（萃取后剩余提取部分）對酪氨酸酶無明顯抑制作用。這說明對酪氨酸酶起主要抑制作用的是乙醚萃取部分。

紅外光譜儀檢測柿葉乙醚萃取物。由圖6可知，3 434.56 cm-1處有一個大、寬且吸收很強的峰，這是一個締合羥基；1 690 cm-1處的吸收峰是C=C的特征峰。

根據以上解析，推測出乙酸乙酯萃取物中存在多酚類物質。

安徽農業科學2015年

2.2.2柿葉乙醚萃取物對酪氨酸酶的抑制活性。

根據抑制率公式計算出各濃度下的抑制率。以濃度為橫坐標，以抑制率為縱坐標，繪制出抑制曲線。

由圖7可知，當濃度為0.5 mg/ml時抑制率達到最高（43.5%），IC50為0.591 mg/ml。當乙醚萃取物濃度為0.1～0.2 mg/ml時，抑制率變化最大；當乙醚萃取物濃度大于0.5 mg/ml時，其抑制率基本不變。常見美白類中藥如白芷、白術、白及、白茯苓、白扁豆、白細辛、白牽牛、白蘞等都是美白面膜的主要原料。徐世芳等[13]報道，白芷提取物對酪氨酸酶的抑制率為38.7%，IC50為1.25 mg/ml?？梢?，柿葉乙醚萃取物對酪氨酸酶的抑制活性強于常見美白類中藥。

3結論

研究表明，柿葉提取物對酪氨酸酶有抑制作用，其中柿葉乙醚萃取物對酪氨酸酶有較大抑制，且在濃度為0.5 mg/ml時有最大抑制率（43.5%），IC50為0.591 mg/ml。對酪氨酸酶發揮抑制作用的主要成分是多酚類物質。柿子葉來源廣泛，廉價易得，是一種極具市場潛力的酪氨酸酶抑制劑。

參考文獻

[1] 陳清西，宋康康.酪氨酸酶的研究進展[J].廈門大學學報，2006，45（5）：731-737.

[2] 李溯，丁勁松.黑色素生物合成與酪氨酸酶抑制劑的研究進展[J].中南藥學，2013，11（4）：278-282.

[3] 張曉晴.香樟果實酪氨酸酶的分離、純化和性質分析[D].無錫：江南大學，2008：3-8.

[4] 傅建敏，梁晉軍，周道順.柿葉有效成分研究綜述[J].中南林業科技大學學報，2013，33（11）：66-72.

[5] 紀莉蓮，張強華，崔桂友.柿葉抗菌活性的研究及活性成分的分離鑒定[J].營養衛生，2003，24（3）：129-131.

[6] FRIEDMAN M.Food browning and its prevention：An overview[J].Agricuture food chemistry，2006，44（3）：631-653.

[7] 王超華.柿葉中酚類物質的提取、純化及初步鑒定研究[D].長沙：湖南農業大學，2010：3-4.

[8] 顧海峰.柿子單寧的性質、結構及其與幾種蛇毒蛋白的相互作用研究[D].武漢：華中農業大學，2007：57-59.

[9] 王君玲.馬鈴薯酪氨酸酶的部分純化及理化性質的研究[J].山西大學學報，2005，18（2）：184-189.

[10] 王寧芳.分光光度法對馬鈴薯中酪氨酸酶活性的測定[J].安徽科學學報，2009， 37（19）：8821-8822.

[11] 穆燕.千日紅酪氨酸酶抑制劑的分離純化及其抑制機理研究[D].廣州：華南理工大學，2012：11-18.

[12] 龔盛昭，楊卓如，程江.酪氨酸酶抑制劑IC50值的計算方法及其驗證[J].日用化學工程，2007，37（3）：149-155.

[13] 徐世芳，李曉譽，葉益萍，等.白芷提取物對酪氨酸酶的抑制作用[J].中華中醫藥學刊，2011，29（7）：1613-1614.