柿子葉提取物對酪氨酸酶的抑制作用

摘要[目的] 測定柿子葉不同提取物對酪氨酸酶的抑制作用。[方法] 以多巴為底物，利用酪氨酸酶與多巴反應(yīng)生成紅色多巴醌的原理，用酶標(biāo)儀檢測柿子葉不同提取物對酪氨酸酶的抑制作用。[結(jié)果] 柿子葉的乙醚萃取物對酪氨酸酶有最大抑制，最大抑制率為43.5%，半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.591 mg/ml。

[結(jié)論] 柿子葉的乙醚提取物對酪氨酸酶具有較強(qiáng)的抑制作用，具有一定的美白功效。

關(guān)鍵詞酪氨酸酶抑制劑；柿葉；多酚類物質(zhì)

中圖分類號(hào)S-03文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）26-008-03

Abstract[Objective] The inhibition of persimmon leaves extract on tyrosinase was determined. [Method] The effect of extract on the activity of tyrosinase was investigated using LDOPA. [Result] The inhibition of the separation of the ether parts relative to other components on tyrosinase was the highest， and the maximum inhibition rate was 43.5%， IC50 was 0.591 mg/ml. [Conclusion]The ether extract of persimmon leaves extract had the strong inhibition on tyrosinase and played a role in whitening effect.

Key wordsTyrosinase inhibitor； Persimmon leaves； Olyphenols酪氨酸酶[1]（Tyrosinase，EC.1.14.18.1）又稱多酚氧化酶（PPO），廣泛存在于微生物、動(dòng)植物及人體中，是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的含銅氧化還原酶。酪氨酸酶在黑色素合成過程中起著關(guān)鍵作用。造成皮膚黑色素生成的原因有多種，如遺傳因素和環(huán)境因素。目前研究結(jié)果基本上認(rèn)為其成因在于皮膚細(xì)胞

中的酪氨酸在酪氨酸酶的作用下逐漸氧化為多巴（Dopa）、多巴醌（Dopaquinone），生成的這些醌類物質(zhì)易于多聚化，并與細(xì)胞內(nèi)蛋白作用，生成黑色或棕色的色素沉淀，最后逐步轉(zhuǎn)化為皮膚黑色素（Tyrsinemelanin）[2]，其反應(yīng)式見圖1。

酪氨酸酶的雙核銅中心結(jié)構(gòu)[3]如圖 2 所示。每個(gè)銅離子由3個(gè)組氨酸殘基的亞氨基共價(jià)結(jié)合固定在活性中心上，其中2個(gè)組氨酸在橫向，結(jié)合較強(qiáng)，有一個(gè)在軸向，結(jié)合較弱。2個(gè)銅離子之間結(jié)合氧原子，形成電子通路。銅離子結(jié)合氧原子的個(gè)數(shù)并不是固定不變的。根據(jù)銅離子結(jié)合氧原子數(shù)的不同，酪氨酸酶可分為氧化態(tài)（Eoxy）、還原態(tài)（Emet）和脫氧態(tài)（Edeoxy）3種型態(tài)。這3種酶形態(tài)的存在和相互轉(zhuǎn)化是酪氨酸酶獨(dú)特的雙重催化功能的基礎(chǔ)。

氧化態(tài)的酶單酚、雙酚均可結(jié)合，單酚和雙酚循環(huán)均參與。與雙酚結(jié)合，經(jīng)一步反應(yīng)后釋放出醌，轉(zhuǎn)化為還原態(tài)酶。還原態(tài)的酶單酚、雙酚都可結(jié)合，但與單酚結(jié)合時(shí)進(jìn)入一條死循環(huán)途徑，不參與正常產(chǎn)物的生成；與雙酚結(jié)合時(shí)，參與雙酚途徑。脫氧態(tài)的酶不可與單酚雙酚結(jié)合，只能結(jié)合氧轉(zhuǎn)化成為氧化態(tài)酶，是酶經(jīng)單酚雙酚循環(huán)后的終態(tài)。3種酶型態(tài)[4]相互轉(zhuǎn)換，即氧化態(tài)酶去氧生成還原態(tài)酶，還原態(tài)酶脫氧生成脫氧態(tài)酶，而氧化態(tài)酶和脫氧態(tài)酶通過釋放和結(jié)合氧氣又可逆轉(zhuǎn)化。

皮膚黑色素細(xì)胞組織將黑色素轉(zhuǎn)移到表皮基底層細(xì)胞中，隨著細(xì)胞的新陳代謝而被帶到角質(zhì)層中，最后隨角度化細(xì)胞脫落。若皮膚黑色素增長過快、過多或在皮膚中分布不均，則皮膚階段性變黑，即局部色素沉著。因此，皮膚美白劑就是可以控制黑色素生成過程的物質(zhì)。由于酪氨酸酶在

合成黑色素的酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴和多巴醌 2個(gè)過程

中起限速作用，目前的皮膚美白劑大多是通過抑制酪氨酸酶活性，從而減少黑色素的生成，達(dá)到美白皮膚的效果。柿葉[4]為柿樹科（Ebenaceae）柿樹屬（Diospyros）植物柿（Diospyros kaki L.f.）的新鮮或干燥葉。全世界柿樹有6屬450余種，其中我國有2屬50多種。我國是世界上最主要的柿樹生產(chǎn)國，目前栽培面積約2.0×105 hm2，年產(chǎn)柿子5.0×105 t，占世界總產(chǎn)量的50%以上。柿葉具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療保健作用。柿葉[5]含有豐富的維生素C、蘆丁、膽堿、黃酮苷、胡蘿卜素、多種氨基酸及鐵、鋅、鈣等對人體健康有益的營養(yǎng)成分。據(jù)測定，每百克柿葉中含有蛋白質(zhì)11.05 g、脂肪6.84 g、糖類54.84 mg、維生素C 704 mg、膽堿317 mg、蘆丁121.34 mg，其中尤以維生素C含量為多，比一般水果高幾倍到幾十倍。柿葉具有抗菌消炎、生津止渴、清熱解毒、潤肺強(qiáng)心、鎮(zhèn)咳止血、抗癌防癌、美白、祛斑、抗衰老等醫(yī)療保健功能。多酚是柿葉中重要的活性成分，柿葉中的多酚類物質(zhì)又被稱柿葉單寧。柿的澀味[6]和很多藥理作用都與其有關(guān)[7]。多酚化合物（Polyphenol）是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的含有酚羥基化合物的總稱，主要存在于植物的根、皮、葉、果中。植物多酚[8]來源于莽草酸途徑和苯丙氨酸代謝途徑，具有芳環(huán)結(jié)構(gòu)，并且結(jié)合一個(gè)或多個(gè)酚羥基。這種獨(dú)特結(jié)構(gòu)使其具有很多的藥理保健功能，如清除體內(nèi)自由基、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤、美白、解蛇毒以及除臭等，是目前天然產(chǎn)物中研究較多的一個(gè)化學(xué)成分，已被廣泛應(yīng)用在食品、化妝品、醫(yī)藥以及保健品等領(lǐng)域。

隨著人們現(xiàn)代生活越來越優(yōu)越，很多女性對美麗的追求也愈加強(qiáng)烈，對美白產(chǎn)品的需求量不斷增大。酪氨酸酶抑制劑能夠抑制黑色素的生成，達(dá)到美白作用。研究柿葉對酪氨酸酶的抑制作用是非常有意義的。

1材料與方法

1.1供試材料供試

香蕉購買自商洛市場，置于-10 ℃冰箱中保存。9月在商洛學(xué)院內(nèi)采摘柿葉，洗凈，于55 ℃烘箱中烘干，保存。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1酪氨酸酶制備與活力測定。

1.2.1.1酪氨酸酶制備。

從冰箱中取出香蕉，去皮，稱取100 g，加入100 ml 0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.6）置于打漿機(jī)中破碎，冰水浴條件下充分勻漿，再放入超聲細(xì)胞破碎儀中破碎10 min；4 000 r/min 4 ℃離心10 min，取100 ml粗酶液，置于冰水浴中，同時(shí)放置于磁力攪拌器上，邊攪拌邊加入研磨好的硫酸銨固體，至硫酸銨的最終濃度為30%；冰水浴中繼續(xù)攪拌20 min，充分沉淀后4 ℃ 4 000 r/min二次離心10 min，棄去沉淀物；對離心所得上清液進(jìn)行二次鹽析至硫酸銨終濃度為55%，持續(xù)攪拌20 min后，以4 ℃ 10 000 r/min 3次離心10 min，沉淀物用0.1 mol/L pH 7.6磷酸緩沖液溶解后再以4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄去不溶物，上清液為所得酶液[9]。

1.2.1.2酶活力測定。

取0.1 ml粗酶液于10 ml比色管中，加入2.9 ml 0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.6），再加入0.1 mg/ml多巴溶液1 ml，同時(shí)開始計(jì)時(shí)，用分光光度計(jì)在475 nm處測定吸光度，開始時(shí)6 min內(nèi)每分鐘讀1個(gè)數(shù)，每隔2 min讀1個(gè)數(shù)，直至吸光度變化不大為止，記錄每組數(shù)據(jù)[10]。在此條件下，以每分鐘催化生成1 mol多巴醌的酶量定義為一個(gè)活力單位。

1.2.2柿葉提取物的制備與活力測定。

1.2.2.1柿葉活性成分提取。

柿葉粉碎，過50目篩，稱取200 g粉末于含鹽酸1.2%的無水甲醇中，在料液比1∶10、溫度55 ℃的條件下超聲萃取60 min，過濾，減壓濃縮后得到柿葉提取液。將提取液分別加入到100 ml石油醚、乙醚、乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮至10 ml，放入50 ℃恒溫箱中烘干，得到石油醚萃取物、乙醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及萃取后剩余物。

1.2.2.2柿葉提取物對酪氨酸酶的抑制[11]。

準(zhǔn)確稱取石油醚萃取物、乙醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及萃取后剩余物各10 mg，用0.1 mol/ml磷酸緩沖液（pH 7.6）配制成1 mg/ml的4組溶液。

取6支干凈的1 ml試管，編號(hào)1～6。1～4號(hào)為試驗(yàn)組，5號(hào)為對照組，6為空白組。1～4每個(gè)試管分別加入0.1 mg/ml 多巴溶液0.2 ml、酶液0.2 ml。向1號(hào)試管再加入1 mg/ml石油醚萃取溶液0.2 ml，向2號(hào)試管加入1 mg/ml乙醚萃取溶液0.2 ml，向3號(hào)試管加入1 mg/ml乙酸乙酯萃取溶液0.2 ml，向4號(hào)試管加入0.1 ml萃取后剩余溶液0.2 ml，向5號(hào)試管加入0.3 ml多巴溶液和0.3 ml酶液，向6號(hào)試管加入0.6 ml多巴溶液。在各組分混合均勻后，放入37 ℃的恒溫箱中孵化20 min。用移液槍每組吸取0.2 ml于96孔板中，于475 nm處測量其吸光度。該試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)平行組。

1.2.2.3乙醚萃取物對酪氨酸酶抑制率的測定。

準(zhǔn)確稱取乙醚萃取物，用0.1 mol/ml磷酸緩沖液（pH 7.6）配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/ml的待測組。

取8支干凈的1 ml試管，同時(shí)編號(hào)1～8。其中，1～6號(hào)試管為試驗(yàn)組，7號(hào)試管為對照組，8號(hào)試管為試驗(yàn)組。1～6號(hào)試管分別加入配制好的0.1 mg/ml的多巴溶液0.2 ml、酶液0.2 ml。向1號(hào)試管再加入0.1 mg/ml配制好的乙醚萃取溶液0.2 ml，向2號(hào)試管加入0.2 mg/ml配制好的乙醚萃取溶液0.2 ml，其余試管依次加入配制好的不同濃度乙醚萃取溶液各0.2 ml。各組分別混合均勻后放入37 ℃搖床培養(yǎng)箱中孵育20 min。用移液槍每組吸取0.2 ml于96孔板中，于475 nm處測量其吸光度。該試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)平行組。

2結(jié)果與分析

2.1酪氨酸酶活力分析

以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，做出酶反應(yīng)過程曲線。由圖4可知，樣品的吸光度在前4 min的變化基本趨于一條直線，做直線方程：y=0.161x+0.176，斜率k=0.161。根據(jù)直線斜率和下面公式[12]，可求得酶活為1.79 U/ml。

2.2柿葉對酪氨酸酶的抑制活性

2.2.1柿葉不同提取物對酪氨酸酶的抑制。由圖5可知，乙醚萃取部分2組（乙醚萃取部分）對酪氨酸酶有明顯抑制，1組（石油醚萃取部分）和3組（乙酸乙酯萃取部分）對酪氨酸酶有抑制，但抑制程度不大，而4組（萃取后剩余提取部分）對酪氨酸酶無明顯抑制作用。這說明對酪氨酸酶起主要抑制作用的是乙醚萃取部分。

紅外光譜儀檢測柿葉乙醚萃取物。由圖6可知，3 434.56 cm-1處有一個(gè)大、寬且吸收很強(qiáng)的峰，這是一個(gè)締合羥基；1 690 cm-1處的吸收峰是C=C的特征峰。

根據(jù)以上解析，推測出乙酸乙酯萃取物中存在多酚類物質(zhì)。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2015年

2.2.2柿葉乙醚萃取物對酪氨酸酶的抑制活性。

根據(jù)抑制率公式計(jì)算出各濃度下的抑制率。以濃度為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，繪制出抑制曲線。

由圖7可知，當(dāng)濃度為0.5 mg/ml時(shí)抑制率達(dá)到最高（43.5%），IC50為0.591 mg/ml。當(dāng)乙醚萃取物濃度為0.1～0.2 mg/ml時(shí)，抑制率變化最大；當(dāng)乙醚萃取物濃度大于0.5 mg/ml時(shí)，其抑制率基本不變。常見美白類中藥如白芷、白術(shù)、白及、白茯苓、白扁豆、白細(xì)辛、白牽牛、白蘞等都是美白面膜的主要原料。徐世芳等[13]報(bào)道，白芷提取物對酪氨酸酶的抑制率為38.7%，IC50為1.25 mg/ml。可見，柿葉乙醚萃取物對酪氨酸酶的抑制活性強(qiáng)于常見美白類中藥。

3結(jié)論

研究表明，柿葉提取物對酪氨酸酶有抑制作用，其中柿葉乙醚萃取物對酪氨酸酶有較大抑制，且在濃度為0.5 mg/ml時(shí)有最大抑制率（43.5%），IC50為0.591 mg/ml。對酪氨酸酶發(fā)揮抑制作用的主要成分是多酚類物質(zhì)。柿子葉來源廣泛，廉價(jià)易得，是一種極具市場潛力的酪氨酸酶抑制劑。

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