朱砂根外植體消毒及啟動培養的研究

摘要以朱砂根優良單株為材料，進行朱砂根外植體表面消毒及啟動培養研究，從外植體材料、消毒試劑、消毒流程以及啟動培養的基本培養基、植物激素等因素進行試驗，通過完全隨機試驗設計和正交試驗設計優化出最佳的外體植消毒流程和啟動培養的培養基組合。結果表明，帶腋芽莖段外植體的最佳消毒流程是先用75%乙醇消毒50～60 s，再用0.1%HgCl2溶液滅菌7 min，其污染率控制在28.9%，成活率達66.7%；朱砂根啟動培養的培養基最佳組合為改良MS+6BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。該研究結果為朱砂根的組培工廠化育苗奠定重要基礎。

關鍵詞朱砂根；外植體消毒；啟動培養；組織培養

中圖分類號S603.6文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2015）26-030-03

AbstractIn this paper，we detected the effect of many factors in the explant surface sterilization and initiation culture of A.crenata，including the explant material，disinfection reagents，disinfection process，the basic medium and plant hormones of initiation culture medium，and so on.To optimize the explants disinfection process and initiation culture medium，these tests were conducted by completely random experimental design and orthogonal test design.The results showed that the ideal disinfection process of explants，stem with axillary bud，was that disinfected with 75% alcohol solution for 50-60 s，then with 0.1% mercury bichloride solution for 7 min.In this case，the contamination rate of explants was controlled in 28.9% and the survival rate of explants was achieved in 66.7%.In addition，the optimized initiation culture medium for A.crenata，was contained with the modified MS basic medium，3.0 mg/L 6BA and 0.1 mg/L NAA.In conclusion，all results of this study will serve as an important foundation for the propagation of A.crenata by tissue culture.

Key wordsArdisia crenata； Sterilization of explant； Initiation culture； Tissue culture

朱砂根（Ardisia crenata Sims），又名富貴籽，屬紫金牛科（Myrsinaceae）紫金牛屬（Ardisia）常綠小灌木，廣泛分布于全世界，原產地從日本延伸到北印度，在海拔90～2 400 m的疏、密林下蔭濕的灌木叢中均有分布[1-2]。朱砂根的果實鮮紅亮麗，觀賞期長，且耐陰性強，既可作庭園綠化苗木，又適宜室內盆栽[3]。此外，朱砂根還具有很高的藥用價值，具有抗菌消炎、抗病毒等作用[4-5]。盡管朱砂根具有重要的應用價值，但目前生產上仍以播種和野生馴化為主要繁殖方式，存在繁殖速度慢、后代性狀分離嚴重等問題，無法實現規模化和標準化生產。利用植物組織培養技術進行無性快繁，不僅能保持母本的優良遺傳特性，而且可在短時間內提供大量整齊一致的良種苗木，是解決朱砂根產業快速發展的最佳途徑[6]。因此，筆者以朱砂根成年嫩枝為材料，開展了外植體消毒和啟動培養研究，初步建立了朱砂根的無菌株系，以期為朱砂根的組培工廠化育苗提供技術支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為龍巖市武平縣朱砂根生產基地所提供的優良品種。離體培養時從優良品種朱砂根植株上，選取健康、無病蟲害、生長健壯的新梢作為外植體。

1.2試驗設計

1.2.1外植體消毒程序設計。

外植體先用清水沖洗除去表面的附著物后，放入洗衣粉稀釋液中逐個清洗，再置于流水中徹底沖去洗滌劑，最后轉入超凈工作臺進行消毒處理[7]。外植體消毒時，選用75%乙醇、10%次氯酸鈉及0.1%升汞為消毒劑，從消毒時間和程序上進行試驗設計（表 1）。

1.2.2啟動培養設計。

啟動培養的目的是確定合適的基本培養基類型、植株再生的可能途徑以及適宜的培養條件[8-9]。分別對不同外植體材料進行單因素、雙因素及三因素試驗設計[10]，在較大范圍內全面尋找合適的基本培養基及激素水平。

（1）朱砂根莖段啟動培養中生長素篩選試驗。以1/2MS基本培養基為基礎，添加6BA 3.0 mg/L+不同濃度的NAA（0.01、0.05、0.10 mg/L），按照完全隨機化單因子試驗設計安排試驗組合（表 2）。

（2）朱砂根莖段啟動培養中基本培養基、分裂素和生長素組合的優化試驗。以B1、改良MS和1/2MS基本培養基為基礎，添加不同濃度6BA（1.0、3.0、5.0 mg/L）及NAA（0.01、0.05、0.10 mg/L），進行L9（34）正交試驗設計（表 3）。

1.2.3基本培養條件。

將接種后的材料置于溫度（25±2）℃，光照12 h/d，光強2 000 lx左右的培養室內，進行培養和觀察。

1.3試驗數據統計及分析

1.3.1外植體消毒效果。

外植體處理后，將消毒好的莖段再切成帶1～2個腋芽或頂芽的小段，每瓶接1個莖段，每個處理接種30瓶，3個重復，接種20 d后統計污染率及存活率。

污染率=污染莖段數/接種莖段總數×100%

存活率=（接種莖段總數-污染莖段數-受殺傷莖段數）/接種莖段總數×100%

受殺傷的莖段是指統計時莖段未萌動，葉腑處無離層出現或莖段干枯壞死。

1.3.2啟動培養效果。啟動培養中，每個處理每次接種40～70瓶，每瓶接種1個外植體，3個重復。

外植體植入后每天觀察一次，記錄啟動天數、啟動效果、萌芽情況等指標。30d后統計啟動培養的啟動時間和萌發率。

以出現肉眼可見的愈傷組織或芽體明顯萌發生長或形成新的芽，記為外植體啟動；

萌發率=萌發芽的莖段數/存活的莖段數×100%

1.3.3數據分析方法。

均采用DPS v6.55版數據處理系統進行數據分析。

2結果與分析

2.1外植體消毒效果

從表4可以看出，不同外植體材料消毒的難易程度相差較大，從總體上看，帶腋芽莖段消毒較容易，平均污染率只有34.6%，存活率為39.3%；帶頂芽莖段消毒較難，平均污染率達56.0%，存活率只有23.6%。無論從消毒效果還是外植體成活率，帶腋芽的莖段都是較理想的培養材料。因此，啟動培養的外植體均采用帶腋芽的莖段。

不同藥劑的滅菌流程對外植體的消毒效果差異較大。從處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的比較可以發現，用0.1%HgCl2對外植體進行消毒，浸泡時間在6～10 min內，浸泡時間越短，污染率越高，而延長處理時間雖然能降低污染率，但增加了消毒液對組織細胞的毒害，導致受殺傷莖段數增加，存活率反而下降。從帶腋芽莖段消毒效果分析，用10%NaClO消毒10 min 的污染率高達67.8%，是同樣條件下0.1% HgCl2消毒7min的3.2倍，可見用升汞消毒效果較好。

帶頂芽莖段和帶腋芽莖段2種材料滅菌均以處理Ⅳ效果最好，帶頂芽莖段的存活率達45.6%，帶腋芽莖段的存活率達66.7%，即75%乙醇50～60 s+0.1%HgCl2溶液7 min的滅菌流程的消毒效果最好。

2.2啟動培養效果

2.2.1不同生長素對外植體啟動培養的影響。

在濃度為3.0 mg/L 6BA條件下，含有不同濃度NAA和IBA的1/2MS培養基上，帶腋芽莖段的培養效果見表5。

由表5可知，所有處理中，莖段的腋芽均有萌發，其中添加生長素NAA的培養基朱砂根腋芽的平均誘導率為51.85%；而添加IBA的培養基平均腋芽誘導率為35.19%，明顯低于添加生長素NAA的培養基。表明，在含有細胞分裂素6BA的培養基中，配合添加生長素NAA對朱砂根腋芽的誘導效果較生長素IBA要好。

對外植體啟動速度進行分析表明，無論是NAA還是IBA，濃度較低時均有利于外植體的啟動，較高濃度則抑制了外植體的啟動。當NAA濃度為0.01 mg/L時，平均啟動時間為9.4d，而濃度增加到0.1 mg/L時，平均啟動時間增加到13.9 d。

2.2.2不同培養基及不同濃度激素組合對朱砂根莖段腋芽誘導培養的影響。由表6可知，3個因素的最佳組合為改良MS+6BA3.0 mg/L+NAA0.1 mg/L；比較R值的大小發現，RA>RB>RC，由此可知，基本培養基、6BA和NAA對朱砂根莖段腋芽誘導培養影響的主次關系為基本培養基、6BA、NAA。

對朱砂根莖段腋芽誘導培養試驗結果進行方差分析，結果顯示，基本培養基、6BA和NAA 3個因素的F值分別為133.14，62.90和8.90，均大于F0.01（2，8）=8.65，這表明基本培養基種類、6BA和NAA濃度對朱砂根腋芽誘導培養的影響達到極顯著水平。

3結論與討論

外植體消毒是植物組織培養過程中的基礎環節。朱砂根是多年生木本植物，外植外采集時容易攜帶大量的微生物，有效的消毒方法是進一步開展無菌培養的重要前提。該研究從外植體取材的部位、消毒液的種類和濃度等方面，探討了朱砂根外植體消毒的有效方法，結果表明：①同一植株上取的材料，帶頂芽的莖段要比不帶頂芽的莖段污染率高。這可能是由于頂芽被芽苞片覆蓋，消毒液難以滲透進去，從而影響到滅菌效果。因此，朱砂根離體培養時，應選擇生長健壯、無病蟲害的嫩枝莖段作為外植體。②對比0.1% 升汞和10%次氯酸鈉的消毒效果顯示，升汞的消毒效果更好，最佳的消毒流程：75%乙醇50～60 s+0.1%升汞7 min，莖段的存活率達66.7%。

激素種類和組合對植物細胞分化和增殖具有重要影響。該研究在6BA濃度為3.0 mg/L的條件下，對比了NAA和IBA 2種生長素對朱砂根啟動誘導的影響，結果表明，在一定濃度的分裂素條件下，添加低濃度的生長素有利于外植體的啟動，這與鄧素芳等[8]研究朱砂根離體培養的結果相同；而且以NAA的效果更佳，當NAA濃度為0.01 mg/L時，平均啟動時間為9.4 d。

在此基礎上，進一步分析了基本培養基、6BA濃度和NAA濃度3個因素對朱砂根莖段腋芽誘導培養的影響。陳偉等[11]對光皮樺的組培試驗表明，6BA濃度較低時有利于愈傷組織的分化，而濃度較高時則有利于外植體芽的分化，添加低濃度的NAA效果更好。該試驗結果表明，低濃度的生長素NAA配合較高濃度的6BA，可以較好地誘導朱砂根腋芽的萌發，這與前人研究結果相同[11-12]。3個因素對朱砂根莖段腋芽誘導培養均具有顯著影響，其主次關系為基本培養基、6BA、NAA，最佳培養基組合為：改良MS + 6BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L。

安徽農業科學2015年

參考文獻

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