乳酪蛋白肽制備工藝的優化

摘要[目的] 研究制備乳酪蛋白肽的最佳工藝。 [方法]以乳酪蛋白為原料，以水解度為考察指標，確定堿性蛋白酶為乳酪蛋白的最佳水解酶。利用單因素試驗考察酶解溫度、 pH、投酶量、酶解時間和底物濃度對水解度的影響，確定主要影響因素。通過 L9（34） 正交試驗獲得堿性蛋白酶的最佳水解條件。利用凝膠色譜法確定乳酪蛋白肽的分子量。[結果]試驗得出制備乳酪蛋白肽的最佳工藝為：酶解溫度 60 ℃，pH 7.0，投酶量 1.5%，酶解時間 150 min。制備的乳酪蛋白肽分子量為 2 kD。 [結論]研究可為乳酪蛋白活性肽的產業化研發提供理論依據。

關鍵詞乳酪蛋白；乳酪蛋白肽；水解度；正交試驗；分子量

中圖分類號S879.1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）26-358-03

Abstract [Objective] This paper studied the best preparation process for preparing casein peptides using casein as experimental material.[Method] Alcalase was the optimal enzyme with hydrolysis degree as evaluation indexes.In single factor experiment， hydrolysis temperature， pH value， enzyme concentration， hydrolysis time and substrate concentration were selected to detect the main influence factors.The optimal hydrolysis conditions of alcalase were obtained from the results of L9（34） orthogonal test.The molecular weight of casein peptides were obtained from the results of gel permeation chromatography.[Result] The optimal hydrolysis conditions were obtained as hydrolysis temperature 60 ℃， pH 7.0， enzyme concentration 1.5% and hydrolysis time 150 min through orthogonal test analysis.Casein peptides showed molecular weight of 2 kD.[Conclusion] This paper will provide important theoretical basis and technical approach for casein peptides research and development.

Key words Casein； Casein peptides； Hydrolysis degree； Orthogonal test； Molecular weight

乳酪蛋白是一種重要的蛋白質，富含人體所需的氨基酸，是科研工作者研究的熱點，在我國已形成一定規模的產業集群[1]。乳酪蛋白的氨基酸序列中潛伏著百余種活性多肽，這些活性多肽具有免疫調節、自由基清除、礦物質載體、抗癌、抗菌、降血壓、溶栓等功能特征，在功能食品和藥品等領域具有廣泛的應用前景[2-7]。然而，這些活性多肽在乳酪蛋白氨基酸序列中不具備活性功能，只有在特異性蛋白酶的酶解過程中，才能從乳酪蛋白序列中釋放出來，并發揮其生物功能。因此，筆者利用堿性蛋白酶酶解法制備乳酪蛋白肽，為乳酪蛋白及其衍生物的高附加值開發提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料原料及試劑：乳酪蛋白，青海凱興干酪素有限公司；堿性蛋白酶（105 U/g）、中性蛋白酶 （105 U/g）、胰蛋白酶 （105 U/g），南寧龐博生物工程有限公司；糜蛋白酶 （105 U/g），上海林葉生物科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉，廣西西隴化工股份有限公司；SuperdexTM Peptide 10/300 GL 凝膠色譜柱，美國 GE 公司；蛋白質標準樣品，美國 Sigma 公司。

主要儀器：電熱恒溫干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；凱氏定氮儀，福斯賽諾分析儀器有限公司；SG2 便攜式 pH 計，梅特勒-托利多儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器，太倉市華利達實驗設備有限公司；HHS4 數顯恒溫水浴鍋，金壇市醫療儀器廠；MilliQ 超純水純化系統，美國 millipore 公司；AKTA 全自動蛋白層析系統，美國 GE 公司；RC6 PULS大型高速冷凍離心機，美國 Thermo Fisher Scientific；Epsilon 26D 凍干機，德國 Christ 公司。

1.2方法

1.2.1乳酪蛋白肽制備方法。取一定量的乳酪蛋白，加入 200 ml 純水，在 85 ℃ 的恒溫條件下加熱預處理15 min，冷卻到適當的溫度，調整 pH，加入一定量的蛋白酶，水解一段時間，水解過程中保持pH不變，反應結束后，升溫至 85 ℃ 滅酶 10 min。酶解液冷卻離心，取上清液冷凍干燥后冷藏備用。

1.2.2水解酶的選擇。以水解度為考察指標，按“1.2.1”的酶解方法，考察堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的酶解能力，確定酶解乳酪蛋白的最佳水解酶，蛋白酶的酶解條件如表 1 所示。

1.2.3單因素試驗。取上述水解酶酶解乳酪蛋白，以水解度為考察指標，考察不同酶解溫度、pH、酶解時間、加酶量、底物濃度對酶解效率的影響，初步確定該酶的酶解條件。

1.2.4正交試驗。在單因素試驗的基礎上，根據正交試驗的中心組合試驗設計原理，進行 L9（34） 正交試驗設計，以水解度為考察指標，確定優先酶的最佳酶解條件。

1.2.5水解度（DH）的測定。水解度的測定采用 pHstat 法[8-9]，根據水解過程中消耗的氫氧化鈉的量計算水解度：

DH = （B×Nb）/（α×Mp×htot）

式中，B，水解中消耗氫氧化鈉的體積 （L）；Nb，所用氫氧化鈉的物質的量濃度 （mol/L）；α，α氨基的解離度；Mp，底物蛋白質總量（g） ；htot，毎克底物蛋白質中肽鍵的克當量（mol/g），乳酪蛋白的 htot為 8.2。

1.2.6分子量的測定。采用凝膠色譜法檢測產品的分子量，檢測條件為：色譜柱：SuperdexTM 200 10/300 GL；流動相：0.05 mol/L 磷酸緩沖鹽緩沖液；流速：0.5 ml/min；檢測波長：215 nm。標準蛋白分子量分別為 cytochrome C （12 384 D）、aprotinin （6 512 D）、vitamin B12（1 855 D）、（Gly）3 （189 D）、gly （75 D）。

1.2.7數據處理。所有數據均重復3次，采用 Sigmaplot 軟件對試驗數據進行統計學分析。

2結果與分析

2.1乳酪蛋白水解酶的確定根據表 1中的蛋白酶的水解條件可以得出，4種蛋白酶對乳酪蛋白的酶解效果各不相同，堿性蛋白酶水解乳酪蛋白時水解度最高，為（21.71±0.15）%；糜蛋白酶水解乳酪蛋白時水解度最低，為（15.03±0.08）%；而中性蛋白酶和胰蛋白酶水解乳酪蛋白時的水解度分別為（19.21±0.27）%、（17.45±0.24）%。因此篩選出堿性蛋白酶為水解乳酪蛋白的最佳蛋白酶。

2.2堿性蛋白酶水解乳酪蛋白的單因素試驗

2.2.1酶解溫度的影響。在酶添加量為 3%，底物濃度為 4%，pH為 9.0，酶解時間為 240 min 的條件下，考察反應溫度為 30、40、50、60、70 ℃ 對水解度的影響。由圖 1 可知，開始階段，水解度隨著溫度的增加而大幅上升；當溫度達到 60 ℃ 時，水解度達到最高；當溫度大于 60 ℃ 時，隨著溫度的增加，水解度反而下降，這是因為溫度過高，部分乳酪蛋白肽被降解成氨基酸。因此，選擇酶解溫度為 60 ℃ 。

2.4乳酪蛋白肽的分子量利用凝膠色譜 SuperdexTM peptide 10/300 GL 檢測乳酪蛋白肽的分子量，5 種標準樣品的分子量如圖 6 所示，以各標準樣品分子量的對數值對洗脫體積做標準曲線，得到的回歸方程為 lgMr = -0.229 3V+6.375 8（R2=0.992 1）。式中，Mr 為分子量，V 為洗脫體積。通過乳酪蛋白肽的洗脫體積（圖7）計算試驗制備的乳酪蛋白肽的分子量為 2 kD。參考文獻

[1] 汪玉松， 鄒思湘.乳生物化學[M].長春： 吉林大學出版社， 1995.

[2] EBNER J，ASCI ARSLAN A，FEDOROVA M，et al.Peptide profiling of bovine kefir reveals 236 unique peptides released from caseins during its production by starter culture or kefir grains[J].Journal of proteomics， 2015， 117： 41-57.、

[3] TANG W T，YUAN H N，ZHANG H，et al.An antimicrobial peptide screened from casein hydrolyzate by Saccharomyces cerevisiae cell membrane affinity method[J].Food control， 2015， 50： 413-422.

[4] CARCATEJEDOR A，SNCHEZRIVERA L，RECIO I，et al.Dairy Debaryomyces hansenii strains produce the antihypertensive caseinderived peptides LHLPLP and HLPLP[J].LWTfood science and technology， 2015， 61： 550-556.

[5] NONGONIERMA A B，FITZGERALD R J.Inhibition of dipeptidyl peptidase IV （DPPIV） by proline containing caseinderived peptides[J].Journal of functional foods， 2013， 5： 1909-1917.

[6] SU R X，LIANG M，QI W，et al.Pancreatic hydrolysis of bovine casein： Peptide release and timedependent reaction behavior[J].Food chemistry， 2012， 133： 851-858.

[7] 陳東平，牟光慶.不同分子量酪蛋白肽對自由基清除作用研究[J].中國釀造， 2010（4）：33-35.

[8] BOUGATEF A，NEDJARARROUME N，RAVALLECPL，R et al.Angiotensin Ιconverting enzyme （ACE） inhibitory activities of sardinelle （Sardinella aurita） byproducts protein hydrolysates obtained by treatment with microbial and visceral fish serine proteases[J].Food chemistry， 2008， 111： 350-356.

[9] 胡新穎.山核桃蛋白多肽制備方法的研究[D].長春： 吉林農業大學，2002.安徽農業科學，Journal of Anhui Agri. Sci.2015，43（26）：364-365，372